專利名稱：一種檢測多拉菌素的方法及其專用酶聯(lián)免疫試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測多拉菌素的方法及其專用酶聯(lián)免疫試劑盒。
背景技術(shù)：
多拉菌素(Doramectin)又稱都林霉素，是一種新大環(huán)內(nèi)酯類抗生素——阿維菌素的第三代衍生物。由于其優(yōu)異的驅(qū)蟲活性和較高的安全性，被認為是目前最優(yōu)良、應(yīng)用最廣泛、銷量最大的一類新型、廣譜、高效、安全和用量小的獸用抗內(nèi)、外寄生蟲藥，已廣泛應(yīng)用于獸醫(yī)臨床，但所用多拉菌素的劑量過大，將引起畜禽中毒，從而影響人類的身體健康。2002年12月我國農(nóng)業(yè)部公告第235號文規(guī)定在動物的脂肪中最高殘留量為100μg/kg、肝中最高殘留量為50μg/kg、腎中最高殘留量為30μg/kg、肌肉中的最高殘留量為10μg/kg。因此加強對動物性食品中多拉菌素的殘留檢測是非常必要的。
檢測多拉菌素殘留量的化學(xué)方法主要有薄層色譜法(TLC)、氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)、氣—質(zhì)聯(lián)機(GC/MS)、液—質(zhì)聯(lián)機(HPLC/MS)、毛細管電泳(CE)等，由于復(fù)雜的儀器設(shè)備和繁瑣的過程，不適合現(xiàn)場監(jiān)控和大量樣本篩查。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測多拉菌素的方法及其專用酶聯(lián)免疫試劑盒。
本發(fā)明所提供的檢測多拉菌素的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括多拉菌素特異性抗體及包被原和酶標記物；所述包被原為多拉菌素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物或抗抗體；所述酶標記物為酶標抗抗體或酶標多拉菌素半抗原；當所述包被原為多拉菌素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物時，所述酶標記物為酶標抗抗體；當所述包被原為抗抗體時，所述酶標記物為酶標多拉菌素半抗原。
所述多拉菌素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物可通過將多拉菌素半抗原和載體蛋白用混合酸酐法或活性酯法進行偶聯(lián)得到；所述多拉菌素半抗原是將多拉菌素的5位羥基用琥珀酰酐酰化，從而在分子中引入羧基，合成多拉菌素半抗原；所述載體蛋白可為鼠血清蛋白、兔血清蛋白或卵清蛋白等常用載體蛋白。
所述酶標記物的標記酶為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酯酶，其中標記酶優(yōu)選堿性磷酸酯酶；堿性磷酸酯酶標記抗抗體可采用現(xiàn)有技術(shù)中的多種方法如戊二醛法或過碘酸鈉法將酶交聯(lián)在抗抗體上；堿性磷酸酯酶標記的多拉菌素半抗原可采用混合酸酐法將堿性磷酸酯酶與多拉菌素半抗原偶聯(lián)得到。所述多拉菌素半抗原是將多拉菌素的5位羥基用琥珀酰酐?；瑥亩诜肿又幸媵然?，合成多拉菌素半抗原。
所述多拉菌素特異性抗體可為多拉菌素單克隆抗體或多拉菌素多克隆抗體；它們均是用多拉菌素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物作為免疫原得到的；所述多克隆抗體可為鼠源、馬源、羊源、兔源或豚鼠源抗體，所述多拉菌素單克隆抗體優(yōu)選為多拉菌素鼠單克隆抗體，所述多拉菌素多克隆抗體優(yōu)選為多拉菌素兔多克隆抗體。所述抗抗體為羊抗鼠或羊抗兔抗抗體。
所述多拉菌素鼠單克隆抗體優(yōu)選為多拉菌素的單克隆雜交瘤細胞株A-3-1CGMCC No.1611分泌的抗體。
多拉菌素的單克隆雜交瘤細胞株A-3-1 CGMCC No.1611已于2006年2月9日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)。
以上抗體均可以用多拉菌素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物作為免疫原按常規(guī)方法制備。所述載體蛋白可為鼠血清蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白或血蘭蛋白等常用載體蛋白；所述多拉菌素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物可通過將多拉菌素半抗原和載體蛋白用混合酸酐法進行偶聯(lián)得到；所述多拉菌素半抗原是將多拉菌素的5位羥基用琥珀酰酐?；瑥亩诜肿又幸媵然?，合成多拉菌素半抗原。
為了更方便現(xiàn)場監(jiān)控和大量樣本篩查，所述試劑盒還包括多拉菌素標準品溶液、顯色劑、終止液、濃縮洗滌液、濃縮復(fù)溶液。
所述濃縮洗滌液為0.01M，pH 7.4，含有0.8％～1.2％吐溫80和0.5％硫柳汞防腐劑的磷酸鹽緩沖液。
所述當標記酶為辣根過氧化物酶時顯色劑由顯色液A液和顯色液B液組成，所述顯色液A液為過氧化氫或過氧化脲，所述顯色液B液為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺；當標記酶為堿性磷酸酯酶時，顯色液為4-硝基酚磷酸鹽緩沖液。
所述濃縮復(fù)溶液為0.01mol/L含有1％酪蛋白和1％明膠的磷酸鹽緩沖液。
所述封閉液為pH 7.4，0.01mol/L含有20％新生牛血清，0.05％酪蛋白的磷酸鹽緩沖液。
所述包被緩沖液為pH 8.2、0.05mol/L含有0.5％卵清蛋白的硼砂—硼酸緩沖液。
所述終止液為1-2mol/L硫酸、鹽酸或氫氧化鈉。
可作為固定所述抗抗體的載體的物質(zhì)很多，如聚苯乙烯、纖維素、聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚丙烯、交聯(lián)葡聚糖、玻璃、硅橡膠、瓊脂糖凝膠等。該載體的形式可以是試管、微量反應(yīng)板凹孔、小珠、小圓片等；其中優(yōu)選為聚苯乙烯制成的微量反應(yīng)板凹孔。聚苯乙烯具有較強的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗原吸附其上后還是保留原來的免疫活性，空白值低，孔底透明度高，各板之間、同一板各孔之間性能相近，所以固相載體優(yōu)選為聚苯乙烯。
本發(fā)明所提供的檢測多拉菌素的方法，包括以下步驟1)樣品前處理當樣品為動物組織時，用均質(zhì)器均質(zhì)樣本，稱取5g樣本，加入10ml無水甲醇混合，渦動1min后于振蕩器上振蕩，3000g以上，15℃離心10min，取上清液20μl，用稀釋了的上述濃縮復(fù)溶液(按V濃縮復(fù)溶液∶V水＝1∶2稀釋)稀釋5倍后，取20μl進行分析；當樣品為血液樣本時，將血樣靜置半小時，在3000g以上，15℃離心10min，取上清液加入2ml稀釋了的濃縮復(fù)溶液(按V濃縮復(fù)溶液∶V水＝1∶2稀釋)；2)利用上述檢測多拉菌素的酶聯(lián)免疫試劑盒檢測樣品。
本發(fā)明的試劑盒可定性、定量檢測動物組織、血清中多拉菌素藥物殘留量。本發(fā)明的檢測原理是當以多拉菌素與載體蛋白偶聯(lián)物為包被原時，將多拉菌素與載體蛋白的偶聯(lián)物為包被原吸附于固相載體上，加入樣品或多拉菌素標準品溶液和多拉菌素特異性抗體，再加入酶標記抗抗體進行酶活性的放大作用，待測樣本中殘留的多拉菌素與酶標板上包被的偶聯(lián)抗原競爭多拉菌素抗體；當以抗抗體為包被原時，加入多拉菌素抗體工作液，孵育洗滌拍干，加入樣品或標準品溶液，同時加入酶標多拉菌素半抗原，孵育洗滌拍干，待測樣品中殘留的多拉菌素和酶標記多拉菌素半抗原競爭多拉菌素特異性抗體，顯色后終止，測定樣品吸光值，該值與樣品中多拉菌素殘留物含量呈負相關(guān)，與標準曲線比較即可得出樣本中多拉菌素的含量。同時根據(jù)酶標板上的樣品顏色的深淺，與系列濃度的多拉菌素的標準品溶液顏色的比較可判斷樣品的濃度范圍。
本發(fā)明試劑盒中包被有包被原的酶標板所用的封閉液含有的酪蛋白會減少抗體的非特異性吸附，還能對蛋白起到一定的保護作用；濃縮洗滌液中含有的硫柳汞在溶液中抑制細菌的生長，對溶液的穩(wěn)定性起到一個保護作用。本發(fā)明試劑盒的濃縮復(fù)溶液中的明膠能減少抗原、抗體的非特異性吸附，從而增加了抗原、抗體的結(jié)合率。
多拉菌素是小分子物質(zhì)，只有免疫反應(yīng)性，沒有免疫原性，不能誘發(fā)機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，必須與大分子載體蛋白偶聯(lián)后才具有免疫原性。本發(fā)明將多拉菌素的5-O-(單)琥珀酰部分用琥珀酰酐?；瑥亩诜肿又幸媵然?，合成多拉菌素半抗原，有助于制出針對多拉菌素抗原特異性較強的多克隆抗體。再將多拉菌素半抗原采用混合酸酐法與載體蛋白偶聯(lián)得到免疫原。半抗原與載體蛋白的結(jié)合比例過低或過高都對免疫不利，半抗原與KLH、RSA和MSA的結(jié)合摩爾比分別為16∶1、20∶1、18∶1。
本發(fā)明的檢測多拉菌素的酶聯(lián)免疫試劑盒對樣品的前處理要求低，樣品前處理過程簡單，能同時快速檢測大批樣品；主要試劑以工作液形式提供，檢驗方法方便易行，經(jīng)過對試劑盒的精密度和準確度測試實驗表明，本發(fā)明的酶聯(lián)免疫試劑盒具有高特異性、高靈敏度、高精確度、高準確度等特點，將在食品和飼料多拉菌素殘留量的檢測中發(fā)揮重要作用。本發(fā)明的試劑盒結(jié)構(gòu)簡單、使用方便、價格便宜、便于攜帶，可用于動物源性食品中多拉菌素的檢測；本發(fā)明的檢測多拉菌素的方法高效、準確、簡便、適于大批量樣品篩選的定性、定量檢測。將在食品和飼料多拉菌素殘留量的檢測中發(fā)揮重要作用。


圖1為以多拉菌素抗原為包被原的酶聯(lián)免疫試劑盒多拉菌素標準曲線2為以多拉菌素抗抗體為包被原的酶聯(lián)免疫試劑盒多拉菌素標準曲線圖具體實施方式
下述實施例的方法如無特別說明，均為常規(guī)方法。
下述實施例中的百分含量，如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。
實施例1、以多拉菌素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物為包被原的酶聯(lián)免疫試劑盒的制備及其檢測方法以多拉菌素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物為包被原的酶聯(lián)免疫試劑盒包括(1)包被有多拉菌素半抗原與載體蛋白偶聯(lián)物的酶標板；(2)堿性磷酸酯酶標記的羊抗鼠抗抗體工作液用含有0.5‰(質(zhì)量濃度)甘油，2％新生牛血清的溶液將堿性磷酸酯酶標記的羊抗鼠抗抗體稀釋成蛋白濃度為1μg/L，12ml/瓶，1瓶；(3)多拉菌素標準品溶液多拉菌素系列標準溶液6瓶，0μg/L、0.5μg/L、1.5μg/L、4.5μg/L、13.5μg/L、40.5μg/L，1-3ml/瓶。標準品溶液的稀釋液為含有5‰(質(zhì)量濃度)N’N-二甲基甲酰胺(DMF)的磷酸鹽緩沖液。
(4)顯色液顯色液為4-硝基酚磷酸鹽緩沖液，7ml/瓶。
(5)多拉菌素鼠單克隆抗體工作液將多拉菌素的單克隆雜交瘤細胞株A-3-1CGMCC No.1611分泌的抗體稀釋成蛋白濃度為5.0μg/L使用，12ml/瓶，1瓶。
(6)濃縮洗滌液0.01M，pH 7.4，含有0.8％～1.2％吐溫80和0.5％硫柳汞防腐劑的磷酸鹽緩沖液，50ml/瓶，1瓶。為正常使用濃度的20倍。
(7)終止液2mol/L氫氧化鈉溶液，8ml/瓶，1瓶。
(8)濃縮復(fù)溶液0.01mol/L含有1％酪蛋白和1％明膠的的磷酸鹽緩沖液，分裝50ml/瓶，1瓶，此濃度為正常使用濃度的3倍。
(9)包被緩沖液pH8.2 0.05mol/L含有0.5％卵清蛋白的硼砂—硼酸緩沖液。
(10)封閉液pH 7.4，0.01mol/L含有20％新生牛血清，0.05％酪蛋白的磷酸鹽緩沖液。
其中，多拉菌素半抗原與載體蛋白偶聯(lián)物、多拉菌素特異性抗體、堿性磷酸酯酶標記的羊抗鼠抗抗體的制備方法如下一、酶標板的制備1、多拉菌素半抗原的合成方法半抗原合成將多拉菌素的5位羥基用琥珀酰酐?；?，從而在分子中引入羧基，合成多拉菌素半抗原。
其半抗原的制備的過程為(1)取多拉菌素500mg和琥珀酰酐200mg溶于5ml吡啶中；(2)60攝氏度回流反應(yīng)8小時，用氯仿萃取后干燥即可。
2、包被原將多拉菌素半抗原和兔血清白蛋白采用混合酸酐法進行偶聯(lián)得到包被原。
包被原的具體制備方法如下(1)取多拉菌素半抗原2g溶于30ml，50％的N，N-二甲基甲酰胺溶液中；(2)再取0.5ml氯甲酸異丁酯溶于5ml無水二噁烷中，加到步驟(1)的溶液中，室溫攪拌反應(yīng)4小時；(3)取兔血清白蛋白32g溶于70ml pH9.6碳酸鹽緩沖液中，再將兔血清白蛋白滴加到步驟(2)的溶液中4℃攪拌過夜，用0.2M的磷酸鹽緩沖液透析7天，每天換液4次，最后將抗原濃縮或凍干保存。
3、酶標板的制備用包被緩沖液將多拉菌素半抗原與兔血清白蛋白偶聯(lián)物稀釋成0.1-1μg/ml，每孔加入100μl，37℃溫育2h或4℃過夜，傾去包被液，用稀釋19倍的濃縮洗滌液洗滌3次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入200μl封閉液，37℃溫育2h，傾去孔內(nèi)液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。
二、多拉菌素兔多克隆抗體的制備1、免疫原由于血蘭蛋白與被免疫動物之間蛋白關(guān)系較遠，且結(jié)構(gòu)復(fù)雜，故免疫原性好，能誘導(dǎo)較強的免疫應(yīng)答，使其產(chǎn)生的抗體較好，用血蘭蛋白作為免疫原的載體。將多拉菌素半抗原和血蘭蛋白(KLH)采用混合酸酐法，進行偶聯(lián)得到免疫原。免疫原制備的具體步驟為1)取多拉菌素半抗原2g溶于30ml 50％的N，N’-二甲基甲酰胺溶液中；2)再取0.5ml氯甲酸異丁酯溶于5ml無水二噁烷中，加入步驟1)的溶液中室溫攪拌反應(yīng)4小時；3)將血藍蛋白32g溶于70ml pH9.6碳酸鹽緩沖液中，然后滴加到步驟2)得到反應(yīng)后的溶液中，在4℃攪拌12小時；4)反應(yīng)完畢后，用0.2M的磷酸鹽緩沖液透析7天，每天換液3～4次，得到含有免疫原的溶液，然后將含有免疫原的溶液濃縮保存或凍干保存。
采用新西蘭大白兔作為免疫動物，以上述多拉菌素半抗原與血蘭蛋白偶聯(lián)物為免疫原為，免疫劑量為1mg/kg，首免時將免疫原與等量的弗氏完全佐劑混合制成乳化劑，頸背部皮下多點注射，間隔3～4周取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加強免疫一次，共免疫5次，最后一次不加佐劑。最后一次免疫7～10d后采血，測定血清抗體效價，心臟采血，經(jīng)硫酸銨分級沉淀得到純化的多克隆抗體。
2、多拉菌素鼠單克隆抗體制備動物免疫程序采用BALB/c小鼠作為免疫動物，以上述多拉菌素半抗原與血蘭蛋白偶聯(lián)物為免疫原，免疫劑量為80-100μg/只，首免時將抗原與等量的弗氏完全佐劑混合制成乳化劑，頸背部皮下多點注射，間隔2-3周取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加強免疫一次，四免后腹腔加強免疫一次，3天后取脾細胞。
細胞融合與克隆化取免疫BALB/c小鼠脾細胞，按5∶1比例與SP2/0骨髓瘤細胞融合，采用間接競爭ELISA測定細胞上清液，篩選陽性孔。利用有限稀釋法對陽性孔進行克隆化，直到得到穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株—多拉菌素的單克隆雜交瘤細胞株A-3-1 CGMCC No.1611。
細胞凍存和復(fù)蘇取處于對數(shù)生長期的多拉菌素的單克隆雜交瘤細胞株A-3-1CGMCC No.1611用凍存液制成1×106-5×106個/mL的細胞懸液，分裝于凍存管，在液氮中長期保存。復(fù)蘇時取出凍存管，立即放入37℃水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。
單克隆抗體的制備與純化采用體內(nèi)誘生法，將BALB/c小鼠(8周齡)腹腔注入滅菌石蠟油0.5ml/只，7-14天后腹腔注射多拉菌素的單克隆雜交瘤細胞株A-3-1CGMCC No.1611 5×105-106個/只，7-10天后采集腹水。用辛酸—飽和硫酸銨法進行腹水純化，小瓶分裝，-20℃保存。
三、酶標抗抗體的制備以鼠源抗體對無病原體山羊進行免疫接種，得到羊抗鼠抗抗體。
戊二醛為一種雙功能試劑，通過其醛基分別與酶和免疫球蛋白上的氨基共價結(jié)合，形成酶—戊二醛—免疫球蛋白結(jié)合物。采用戊二醛法將堿性磷酸酯酶與羊抗鼠抗抗體偶聯(lián)并純化提取，得到酶標羊抗鼠抗抗體。
酶標羊抗鼠抗抗體具體步驟如下1)稱取堿性磷酸酯酶25mg溶于1.25％戊二醛溶液中，于室溫靜置過夜。
2)反應(yīng)后的酶溶液經(jīng)Sephadex G-25層析柱，用生理鹽水洗脫。流速控制在1ml/1min，收集棕色流出液。如體積大于5ml，則以聚己二醇濃縮至5ml。放置25ml小燒杯中，緩慢攪拌。
3)取羊抗鼠抗抗體12.5mg用生理鹽水稀釋至5ml，攪拌下逐滴加入酶溶液中。
4)用1M pH9.5碳酸緩沖液0.25ml，繼續(xù)攪拌3h。
5)加0.2M賴氨酸0.25ml，混勻后，置室溫2h。
6)在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨，置4℃1h。
7)3000rpm離心半小時，棄上清。沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M pH7.4的磷酸鹽緩沖液中。
8)將上述溶液裝入透析袋中，用0.15M pH7.4的磷酸鹽緩沖液透析，去除銨離子后(用萘氏試劑檢測)，10,000rpm離心30min去除沉淀，上清液即為酶結(jié)合物，分裝后，冰凍保存。
利用該試劑盒檢測樣品中殘留的多拉菌素的方法如下一、樣品前處理動物組織用均質(zhì)器均質(zhì)樣本，稱取5g樣本，加入10ml無水甲醇混合，渦動1min后于振蕩器上振蕩，3000g以上，15℃離心10min，取上清液20μl，用上述稀釋了的濃縮復(fù)溶液(按V濃縮復(fù)溶液∶V水＝1∶2稀釋)稀釋5倍后，取50μl進行分析。
血漿將血樣靜置半小時，在3000g以上，15℃離心10min，取上清液加入2ml稀釋了的復(fù)溶液(按V濃縮復(fù)溶液∶V水＝1∶2稀釋)，取50μl進行分析。
二、檢測方法a、向多拉菌素半抗原與兔血清白蛋白偶聯(lián)物包被的酶標板微孔中加系列標準品溶液或樣品溶液(各2孔)50μl，然后加入多拉菌素鼠單克隆抗體工作液50μl，用蓋板膜封板，37℃恒溫箱中反應(yīng)30min。
b、倒出孔中液體，每孔加入250μl稀釋了的濃縮洗滌液(按V濃縮洗滌液∶V水＝1∶19稀釋)，30s后倒出孔中液體，用吸水紙拍干，如此重復(fù)操作共洗板5次。加入堿性磷酸酯酶標記的羊抗鼠抗抗體工作液100μl，用蓋板膜封板，37℃恒溫箱中反應(yīng)30min。
c、取出酶標板，如前述洗板5次。每孔加入底物顯色液100μl，輕輕振蕩混勻，37℃恒溫箱避光顯色15-30min。
d、每孔加入終止液50μl，輕輕振蕩混勻，用酶標儀將波長范圍設(shè)定在400nm波長處，測定每孔吸光度值(OD值)。
三、結(jié)果分析所獲得的每個濃度標準品溶液或樣本吸光度值的平均值(B)除以第一個標準(0標準)的吸光度值(B0)再乘以100％，即百分吸光度值。
公式中B為標準品溶液或樣本溶液的平均吸光度值，B0為0μg/L標準溶液的平均吸光度值。以多拉菌素濃度的自然對數(shù)值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標準曲線圖，如圖1所示。相對應(yīng)每一個樣品中多拉菌素的濃度可以從標準曲線上讀出。也可以用回歸方程法，計算出樣本溶液中多拉菌素的濃度。利用計算機專業(yè)軟件，更便于大量樣品的快速分析。整個檢測過程只需1.5小時就可以完成，最低檢測限為0.5μg/L。
實施例2、以抗抗體作為包被原的酶聯(lián)免疫試劑盒及其制備方法以抗抗體作為包被原的酶聯(lián)免疫試劑盒包括(1)包被有抗抗體的酶標板；(2)堿性磷酸酯酶標記的多拉菌素半抗原工作液用含有0.5‰甘油，2％新生牛血清的溶液將堿性磷酸酯酶標記的多拉菌素半抗原稀釋成蛋白濃度為2μg/L的溶液，12ml/瓶。
(3)多拉菌素標準品溶液多拉菌素系列標準溶液6瓶，0μg/L、0.5μg/L、1.5μg/L、4.5μg/L、13.5μg/L、40.5μg/L，1-3ml/瓶。多拉菌素標準品溶液的稀釋液為0.1M pH值為8.0的磷酸鹽緩沖液。
(4)顯色液顯色液為4-硝基酚磷酸鹽緩沖液，7ml/瓶。
(5)多拉菌素兔多克隆抗體工作液含有5‰(質(zhì)量濃度)DMF，2％卵清蛋白的磷酸鹽緩沖液將多拉菌素兔多克隆抗體稀釋成蛋白濃度為5.0μg/L，12ml/瓶，1瓶。
(6)濃縮洗滌液0.01M，pH 7.4，含有0.8％～1.2％吐溫80和0.5％硫柳汞防腐劑的磷酸鹽緩沖液，50ml/瓶，1瓶。為正常使用濃度的20倍。
(7)終止液2mol/L氫氧化鈉溶液，8ml/瓶，1瓶。
(8)濃縮復(fù)溶液0.05mol/L含有1％酪蛋白和1％明膠的的磷酸鹽緩沖液，分裝50ml/瓶，1瓶，為正常使用濃度的3倍。
(9)包被緩沖液pH 8.2 0.05mol/L含有0.5％卵清蛋白的硼砂—硼酸緩沖液。
(10)封閉液pH 7.4，0.01mol/L含有20％新生牛血清，0.05％吐溫20的磷酸鹽緩沖液。
其中，多拉菌素抗抗體包被原、多拉菌素特異性抗體、堿性磷酸酯酶標記的多拉菌素半抗原的制備方法如下一、酶標板的制備1、包被原的制備以兔源抗體為免疫原對無病原體山羊進行免疫得到羊抗兔抗抗體。
2、包被有羊抗兔抗抗體的酶標板制備方法酶標板的材料為聚苯乙烯，用包被緩沖液將羊抗兔抗抗體稀釋成1μg/ml，每孔加入100μl，37℃溫育2h或4℃過夜，傾去包被液，每孔加稀釋了的濃縮洗滌液250μl(按V濃縮洗滌液∶V水＝1∶19稀釋)洗滌3次，每次30s，拍干，然后在酶標板的每孔中加入200μl封閉液，37℃溫育2h，傾去孔內(nèi)液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。
二、多拉菌素兔多克隆抗體的制備采用新西蘭大白兔作為免疫動物，以多拉菌素半抗原與兔血清白蛋白偶聯(lián)物為免疫原，免疫劑量為1mg/kg，將免疫原與等量的弗氏完全佐劑混合制成乳化劑，頸背部皮下多點注射，間隔3～4周取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加強免疫一次，共免疫5次，最后一次不加佐劑。最后一次免疫7～10d后采血，測定血清抗體效價，心臟采血，經(jīng)硫酸銨分級沉淀得到純化的兔多克隆抗體。
三、酶標半抗原的制備堿性磷酸酯酶標記半抗原的制備將多拉菌素半抗原和堿性磷酸酯酶采用混合酸酐法進行偶聯(lián)，得到堿性磷酸酯酶標記的多拉菌素。
具體方法如下(1)取5.8g合成的多拉菌素的半抗原，用0.1ml二甲基甲酰胺溶解，冷卻至10℃，加2μl氯甲酸異丁酯，10℃攪拌反應(yīng)30分鐘。
(2)1.5g堿性磷酸酯酶2ml 50mmol/LNa2CO3溶解。
(3)10℃反應(yīng)4小時(維持pH值為9.0)，然后4℃過夜。
(4)過Sephadex 6-25層析柱，柱中含NaCl100mmol/L、MgCl210mmol/L、2-巰基乙醇10mmol/L的50mmol/L Tris-醋酸緩沖液(pH7.5)平衡和洗脫，合并含堿性磷酸酯酶的洗脫管內(nèi)液體，進一步純化后，保存于含0.1％BSA、0.02％NaN3的緩沖液中。
利用該試劑盒檢測樣品中殘留的多拉菌素的方法如下樣品前處理的具體步驟同實施例1中的樣品前處理步驟檢測方法1)向包被有羊抗兔抗抗體的酶標板微孔中加入多拉菌素兔多克隆抗體工作液100μl，37℃反應(yīng)30min；2)倒出孔中液體，每孔加入洗滌液，30s后倒出孔中液體，如此重復(fù)操作共洗板5次，用吸水紙拍干。加入系列標準品溶液或樣品溶液50μl，同時加入堿性磷酸酯酶標記的多拉菌素半抗原工作液50μl，然后，37℃反應(yīng)30min。
3)重復(fù)上述洗板步驟，每孔加入顯色液50μl，輕輕振蕩混勻，37℃恒溫箱避光顯色15～30min。
4)每孔加入終止液50μl，輕輕振蕩混勻，用酶標儀，測定每孔吸光度值(OD值)。
結(jié)果分析的方法同實施例1中的結(jié)果分析方法，該試劑盒的標準曲線圖，如圖2所示。結(jié)果分析表明，制備的試劑盒整個檢測過程只需1.5小時就可以完成，最低檢測限為0.5μg/L。
實施例3、試劑盒精密度、準確度和保存期試驗1、試劑盒精密度試驗(1)標準品精密度試驗將實施例1和實施例2中制備的試劑盒分別取三批進行精密度實驗，每批試劑盒抽取10個試劑盒，再從每個試劑盒的酶聯(lián)板中各抽出20個微孔，測定4.5μg/L標準品溶液的吸光度值(OD值)，計算變異系數(shù)。實施例1中的三批試劑盒的測定結(jié)果如表1所示，結(jié)果表明變異系數(shù)范圍在5.6％～10.9％之間。均小于25％，此標準為農(nóng)業(yè)部《農(nóng)辦醫(yī) 3號文件》關(guān)于試劑盒備案標準。
表1標準可重復(fù)性試驗(CV％)

實施例2中的三批試劑盒的測定結(jié)果如表2所示，結(jié)果表明變異系數(shù)范圍在5.1％～14.9％之間。
表2標準可重復(fù)性試驗

(2)樣本可重復(fù)性試驗每個樣本按20μg/kg濃度添加多拉菌素標準品，分別取實施例1和實施例2中制備的三個不同批次的試劑盒各三個，每個濃度重復(fù)5次，分別計算變異系數(shù)。實施例1中的三批試劑盒的測定結(jié)果如表3-表6所示，結(jié)果表明雞肉樣本變異系數(shù)均低于20％，雞血樣本的變異系數(shù)均低于25％。
表3雞肉樣品可重復(fù)性試驗

表4雞血樣品可重復(fù)性試驗


實施例2中的三批試劑盒的測定結(jié)果如表5-表6所示。結(jié)果表明雞肉樣本變異系數(shù)均小于25％，雞血樣本的變異系數(shù)均小于20％。
表5雞肉樣品可重復(fù)性試驗

表6雞血樣品可重復(fù)性試驗

2、試劑盒的準確度測定實施例1中的三批試劑盒的測定結(jié)果如表7、表8所示，結(jié)果表明雞肉樣本的回收率在66％～92.5％，雞血樣本的回收率在64％～104％。
表7雞肉添加樣本的準確度


表8雞血添加樣本的準確度

實施例2中的三批試劑盒的測定結(jié)果如表9、表10所示，結(jié)果表明雞肉樣本的回收率在62％～103.5％，雞血樣本的回收率在60％～97.5％。
表9雞肉添加樣本的準確度

表10雞血添加樣本的準確度

3、試劑盒保存期試驗將實施例1和實施例2制備的試劑盒分別保存在2-8℃，6個月后，測定試劑盒的最大吸光度值(零標準)、50％抑制濃度、多拉菌素添加實際測定值，結(jié)果表明實施例1的試劑盒的最大吸光度值(零標準)、50％抑制濃度；實施例2的試劑盒的最大吸光度值(零標準)、50％抑制濃度，均在正常范圍之內(nèi)。考慮在運輸和使用過程中，會有非正常保存條件出現(xiàn)，將上述試劑盒在37℃保存的條件下放置6天，進行加速老化實驗，結(jié)果表明實施例1和實施例2制備的試劑盒各項指標完全符合要求。考慮到試劑盒冷凍情況發(fā)生，將試劑盒放入-20℃冰箱冷凍5天，測定結(jié)果也表明實施例1和實施例2制備的試劑盒各項指標完全正常。從以上結(jié)果可得出試劑盒可以在2-8℃至少可以保存6個月以上。
權(quán)利要求
1.一種檢測多拉菌素的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括多拉菌素特異性抗體及包被原和酶標記物；所述包被原為多拉菌素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物或抗抗體；所述酶標記物為酶標抗抗體或酶標多拉菌素半抗原；當所述包被原為多拉菌素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物時，所述酶標記物為酶標抗抗體；當所述包被原為多拉菌素抗抗體時，所述酶標記物為酶標多拉菌素半抗原；所述多拉菌素半抗原是將多拉菌素的5位羥基用琥珀酰酐酰化，從而在分子中引入羧基，合成多拉菌素半抗原。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括多拉菌素標準品溶液、顯色劑、濃縮洗滌液、終止液、濃縮復(fù)溶液；所述載體蛋白為鼠血清蛋白、兔血清蛋白或卵清蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述多拉菌素特異性抗體為多拉菌素單克隆抗體或多拉菌素多克隆抗體；它們均是用多拉菌素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物作為免疫原得到的；所述多拉菌素半抗原是將多拉菌素的5位羥基用琥珀酰酐?；?，從而在分子中引入羧基，合成多拉菌素半抗原；所述載體蛋白為鼠血清蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白或血蘭蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述酶標記物的標記酶為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酯酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述抗抗體為羊抗鼠或羊抗兔抗抗體；所述多拉菌素單克隆抗體為多拉菌素的單克隆雜交瘤細胞株A-3-1 CGMCC No.1611分泌的抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述濃縮洗滌液為0.01M，pH 7.4，含有0.8％～1.2％吐溫80和0.5％硫柳汞防腐劑的磷酸鹽緩沖液；所述百分含量為質(zhì)量百分含量。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于當標記酶為辣根過氧化物酶時顯色劑由顯色液A液和顯色液B液組成，所述顯色液A液為過氧化氫或過氧化脲，所述顯色液B液為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺；當標記酶為堿性磷酸酯酶時，顯色液為4-硝基酚磷酸鹽緩沖液。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述濃縮復(fù)溶液為0.01mol/L含有1％酪蛋白和1％明膠的磷酸鹽緩沖液；所述百分含量為質(zhì)量百分含量。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述制備酶標板所用的包被緩沖液為pH 8.2、0.05mol/L含有0.5％卵清蛋白的硼砂一硼酸緩沖液；所述終止液為1-2mol/L硫酸、鹽酸或氫氧化鈉；所述封閉液為pH 7.4，0.01mol/L含有20％新生牛血清，0.05％酪蛋白的磷酸鹽緩沖液；所述百分含量為質(zhì)量百分含量。
10.一種檢測多拉菌素的方法，包括以下步驟1)樣品前處理當樣品為動物組織時，稱取5g均質(zhì)樣本，加入10ml無水甲醇混合，渦動1min后于振蕩器上振蕩，3000g以上，15℃離心10min，取上清液20μl，用稀釋2倍的濃縮復(fù)溶液稀釋5倍后，取20μl進行分析；當樣品為血液樣本時，將血樣靜置半小時，在3000g以上，15℃離心10min，取上清液加入2ml稀釋2倍的濃縮復(fù)溶液；2)利用權(quán)利要求1-9中任一所述的檢測多拉菌素的酶聯(lián)免疫試劑盒檢測樣品。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測多拉菌素的方法及其專用酶聯(lián)免疫試劑盒。該檢測多拉菌素的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括多拉菌素特異性抗體及包被原和酶標記物；所述包被原為多拉菌素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物或多拉菌素抗抗體；所述酶標記物為酶標多拉菌素抗抗體或酶標多拉菌素半抗原；當所述包被原為多拉菌素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物時，所述酶標記物為酶標多拉菌素抗抗體；當所述包被原為多拉菌素抗抗體時，所述酶標記物為酶標多拉菌素半抗原；所述多拉菌素半抗原是將多拉菌素的5位羥基用琥珀酰酐?；瑥亩诜肿又幸媵然?，合成多拉菌素半抗原。本發(fā)明的方法操作簡便、靈敏度高、能夠現(xiàn)場監(jiān)控且適合大量樣本篩查的檢測動物組織、血清、牛奶及飼料中多拉菌素藥物殘留量。
文檔編號G01N33/577GK1811438SQ20061000725
公開日2006年8月2日 申請日期2006年2月16日 優(yōu)先權(quán)日2006年2月16日
發(fā)明者沈建忠, 史為民, 何繼紅, 何方洋, 丁雙陽, 江海洋, 萬宇平, 張素霞, 馮才偉 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)