專利名稱：過氧化物酶體增殖物激活受體α靶基因的使用方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及用于治療或監(jiān)控代謝異常的治療方法和組合物。本發(fā)明也涉及用于鑒定代謝異常治療用化合物的方法和組合物。具體地講，本發(fā)明的方法包括Pa9、Pa13和Pa21三種PPARα靶基因的用途。
背景技術(shù)：
肥胖癥、糖尿病、高血壓和高脂血癥等代謝異常，在大多數(shù)工業(yè)化社會中是一個重要的公共衛(wèi)生問題。這類代謝異常使個體易患冠狀動脈病、中風和其它心血管疾病。越來越多的數(shù)據(jù)表明，過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)在脂質(zhì)代謝和葡萄糖代謝中起到關鍵作用并參與代謝障礙。
PPAR是配體激活轉(zhuǎn)錄因子，隸屬于核受體亞家族。激活PPAR與其它核受體即類視黃醇X受體形成異質(zhì)二聚體，并改變靶基因的轉(zhuǎn)錄。激活PPAR與稱為過氧化物酶體增殖物應答元件(PPRE，其位于靶基因啟動子上)的特異性DNA序列結(jié)合，增加了轉(zhuǎn)錄起始率。迄今為止所鑒定的大多數(shù)PPRE都是由間隔一個核苷酸的典型AGGTCA序列的直接重復序列組成(Schoonjans等，1996，BiochimBiophys Acta，130293-109)。三種PPAR亞型已經(jīng)表征為PPARα、PPARδ和PPARγ。在褐色脂肪組織、肝、心、腎和肌肉細胞中觀察到較高水平的PPARα表達，在此它調(diào)節(jié)脂肪酸的分解代謝。PPARδ廣泛表達，其功能現(xiàn)已闡明。PPARγ主要存在于脂肪組織、結(jié)腸和巨噬細胞中，并且參與脂肪細胞分化、脂質(zhì)貯藏和葡萄糖平衡(Lee等，2003，出處同上)。
PPAR的配體包括膳食脂肪酸以及用于治療高脂血癥或II型糖尿病的大量藥物。例如，貝特類藥物(fibrate)是一類降低血清甘油三酯的藥物，是PPARα的合成激動劑。貝特類藥物的實例包括但不限于吉非貝齊、苯扎貝特、非諾貝特、氯貝丁酯和新開發(fā)的微粉化非諾貝特。PPARα的其它合成激動劑包括但不限于GW2331、WY14643和L165041(Mukherjee等，2002，J Steroid Biochem Mol Biol.81(3)217-25)。噻唑烷二酮類(TZD)是一類胰島素敏感藥物，是高親和性PPARγ激動劑。TZD的實例包括但不限于文迪雅(羅格列酮)和Resulin(曲格列酮)。
某些PPARα激動劑(例如貝特類)的作用看來具有種屬特異性(Vosper等，2002，Pharmacology & Therapeutics，9547-62)。在嚙齒動物中給予貝特會誘導脂質(zhì)平衡的關鍵性基因，例如HD(3-酰烯基CoA脫氫酶)基因、ACOX(脂酰CoA氧化酶)基因和ME(蘋果酸酶(MalicEnzyme))基因(Castelein等，1994 J.Biolo.Chem.26926754-758)。這與PPARα-裸鼠的研究結(jié)果是一致的，表明PPARα在維持嚙齒動物的肝、脂肪細胞和骨骼肌等葡萄糖代謝和脂質(zhì)代謝的主要靶組織的β-氧化途徑的組成型活性上起到關鍵性作用(Leone等，1999，Proc.Natl.Acsd.Sci.U.S.A.967473-7478)。在人和若干其它“非敏感”物種(例如豚鼠和狨猴(marmoset))中給予貝特類，所誘導的基因看來不如貝特類在嚙齒動物中誘導的那么多(Stael等，1997，Current PharmaceuticalDesign 31-14)。在人肝細胞或幾種其它“非敏感”物種的肝中，沒有觀察貝特類對過氧化物酶體脂肪酸氧化的調(diào)節(jié)。但是，這些“非敏感”動物確實對貝特類表現(xiàn)出有效的降脂反應。
對PPARα所調(diào)節(jié)的新的人體基因進行鑒定，是理解貝特類在病人中的治療機制的關鍵。新的PPARα靶基因?qū)τ谪愄仡惡推渌黀PARα激動劑活性的臨床監(jiān)測來說具有價值。另外，新的PPARα靶基因?qū)⒂兄诳焖勹b定和開發(fā)用于治療代謝異常的新化合物。此外，新的PPARα靶基因還將有助于開發(fā)治療代謝異常的新方法。
發(fā)明概述目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，本文所說的基因Pa9、Pa13和Pa21是人過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)的靶基因。
因此，就一般方面而言，本發(fā)明提供測定患者PPARα的生物活性的方法。該方法包括測定患者基因表達水平的步驟，所述基因選自人Pa9基因、Pa13基因和Pa21基因。
就另一個一般方面而言，本發(fā)明提供評價患者代謝異常的治療有效性的方法。該方法包括下述步驟a)測定治療期間或治療之后患者體內(nèi)選自人Pa9基因、Pa13基因和Pa21基因的基因表達水平；和b)將步驟a)中測定的表達水平與治療之前患者體內(nèi)所述基因表達水平進行比較；其中，治療期間或治療之后患者體內(nèi)所述基因表達水平增加，表明對患者代謝異常的治療是有效的。
本發(fā)明的特征也在于試劑盒，該試劑盒用于評價患者代謝異常的治療有效性。試劑盒可包括核酸探針，該探針在嚴格性雜交條件下與選自以下的核酸分子雜交SEQ ID NO1、SEQ ID NO3和SEQID NO5或其互補序列。試劑盒也可包括抗體，該抗體與選自以下的多肽分子特異性結(jié)合SEQ ID NO2、SEQ ID NO4和SEQ ID NO6。試劑盒還可包括使用說明書，該說明書用于確定對患者代謝異常的治療是否有效。
就另一個一般方面而言，本發(fā)明提供用于治療患者代謝異常的化合物的鑒定方法。該方法的一個實例包括下述步驟a)使PPARα-反應系統(tǒng)與包含緩沖劑和試驗化合物的溶液接觸；b)測定PPARα-反應系統(tǒng)受到人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因調(diào)節(jié)序列控制的基因表達水平；和c)將步驟(b)的結(jié)果與其中PPARα-反應系統(tǒng)僅與緩沖液接觸的對照的結(jié)果進行比較。該方法的其它實例包括下述步驟a)使人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因所編碼的多肽與包含緩沖劑和候選化合物或試驗化合物的溶液接觸；b)測定試驗化合物對多肽活性的影響；和c)將步驟(b)的結(jié)果與其中多肽僅與緩沖液接觸的對照進行比較。
本發(fā)明的另一個一般方面涉及患者代謝異常的治療方法。該方法包括給予患者治療有效量的組合物的步驟，該組合物能改變患者細胞內(nèi)人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因的基因表達模式或生物活性。
就又一個基本方面而言，本發(fā)明提供PPARα-反應系統(tǒng)，該系統(tǒng)包含功能性PPARα蛋白和核酸分子，該核酸分子包含與人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因調(diào)節(jié)序列操作性連接的報道基因編碼序列。本發(fā)明也包括分離的核酸分子，該核酸分子包含與人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因調(diào)節(jié)序列操作性連接的報道基因編碼序列。
就其它方面而言，根據(jù)以下公開內(nèi)容(包括發(fā)明詳述及其優(yōu)選實施方案和所附權(quán)利要求書)，本發(fā)明的特征和優(yōu)勢將會是顯而易見的。
附圖簡述

圖1顯示Pa9微陣列注釋(annotation)序列(GenBank檢索號W30988)與人FDRG基因序列(GenBank檢索號AX278133)之間的DNA序列比對。
圖2顯示Pa13微陣列注釋序列(GenBank檢索號N26311)與人TGF-β超家族蛋白質(zhì)基因序列(GenBank檢索號AB000584)之間的DNA序列比對。
圖3顯示Pa21微陣列注釋序列(GenBank檢索號H49601)與人C20orf139基因序列(GenBank檢索號NM_080725)之間的DNA序列比對。
圖4說明在SKMU細胞中，PPARα特異性siRNA降低PPARα基因表達水平。
圖5說明在PPARα表達降低的SKMU細胞中，WY14643減少了對Pa9基因表達的誘導。
圖6說明在PPARα表達降低的SKMU細胞中，沒有檢測到WY14643對Pa13基因表達的誘導。
圖7說明在PPARα表達降低的SKMU細胞中，沒有檢測到WY14643對Pa21基因表達的誘導。
發(fā)明詳述本文所用的術(shù)語“包括”、“含有”、“具有”和“包含”均使用其開放式、非限制性含義。
下面是本說明書中有時使用的縮寫詞bp＝堿基對cDNA＝互補DNAC20orf139＝染色體20可讀框139ELISA＝酶聯(lián)免疫吸附測定FDRG＝血纖蛋白原結(jié)構(gòu)域相關蛋白kb＝千堿基；1000堿基對nt＝核苷酸PAGE＝聚丙烯酰胺凝膠電泳PBMC＝外周血單核細胞PCR＝聚合酶鏈式反應PPARα＝過氧化物酶體增殖物激活受體αPPRE＝過氧化物酶體增殖物應答元件RT PCR＝逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應SDS＝十二烷基硫酸鈉SiRNA＝小干擾RNASKMU＝骨骼肌SSC＝氯化鈉/檸檬酸鈉TZDs＝噻唑烷二酮UTR＝非翻譯區(qū)
WAT＝白色脂肪組織。
多肽或核酸的“活性”、“生物活性”或“功能活性”，是指按照標準技術(shù)在體內(nèi)或體外進行測定時多肽或核酸分子所具有的活性。這類活性可以是直接活性或間接活性，前者例如與第二種蛋白質(zhì)的酶活性相關或?qū)Φ诙N蛋白質(zhì)的酶活性，后者例如由該蛋白質(zhì)與第二種蛋白質(zhì)相互作用所介導的細胞信號傳導活性。
本文所用的“生物樣品”是指含有細胞或組織物的樣品或者由細胞或組織物組成的樣品，例如分離自患者的細胞或生物流體?！盎颊摺笨梢允遣溉閯游?，例如大鼠、小鼠、猴子或人，它們作為治療、觀察或試驗的對象。生物樣品的實例包括例如痰液、血液、血細胞(例如白細胞)、羊水、血漿、精液、骨髓、組織或穿刺活檢樣品、尿液、腹膜液、胸腔積液和細胞培養(yǎng)物。生物樣品也可包括組織切片，例如用于組織學目的的冷凍切片。
在優(yōu)選的實施方案中，生物樣品是來自病人的“臨床樣品”。生物樣品也可以稱為“患者樣品”。試驗生物樣品是作為分析、監(jiān)測或觀察對象的生物樣品。對照生物樣品是試驗生物樣品的陽性對照或陰性對照。通常，對照生物樣品含有與試驗生物樣品類型相同的靶組織、細胞和生物流體。
“細胞”是指適于檢測方法靈敏度的至少一個細胞或多個細胞。適于本發(fā)明的細胞可以是細菌細胞，但優(yōu)選真核細胞，最優(yōu)選哺乳動物細胞。
“克隆”是由單細胞或共同祖先經(jīng)有絲分裂而來的細胞群體。
“細胞系”是原代細胞的克隆，其在體外能穩(wěn)定生長多代。
“基因”是參與產(chǎn)生肽、多肽或蛋白質(zhì)的DNA區(qū)段，包括編碼區(qū)以及編碼區(qū)前(“5′UTR”)后(“3′UTR”)的非編碼區(qū)?！盎颉币部砂ǜ骶幋a區(qū)段(“外顯子”)之間的間插非編碼序列(“內(nèi)含子”)?！皢幼印笔侵竻⑴cRNA聚合酶的結(jié)合從而啟動基因轉(zhuǎn)錄的DNA調(diào)節(jié)序列。啟動子通常是基因上游(“5′-”)的轉(zhuǎn)錄起始位點?！罢{(diào)節(jié)序列”是指能控制基因表達的基因部分?！罢{(diào)節(jié)序列”可包括啟動子、增強子和其它表達控制元件，例如聚腺苷酸化信號、核糖體結(jié)合位點(用于細菌表達)和/或操縱子?！熬幋a區(qū)”是指通過三聯(lián)密碼編碼氨基酸和翻譯起始信號及終止信號的基因部分。
“基因表達微陣列分析”是指這樣的檢測方法其中使探針寡核苷酸“微陣列”與目標核酸樣品(例如靶樣品、例如來自特定組織類型的多聚腺苷酸mRNA或其逆轉(zhuǎn)錄物)接觸。參見例如Nees等(2001)，Curr Cancer Drug Targets，1(2)155-75。接觸是在雜交條件下進行，然后除去未結(jié)合核酸。所得到的雜交核酸模式提供所檢測樣品的基因特征相關信息。基因表達分析可同時檢測上千個基因的表達，提供大量的基因相互作用和功能的信息?；虮磉_分析具有各種不同用途，例如鑒定基因表達，找出基因表達與特定表型之間的關系，篩選疾病易感型體質(zhì)并鑒定特定藥物對細胞基因表達的效果(例如在毒性試驗中)。本文所用的“微陣列”是指一種基質(zhì)，例如基本上是平面的基質(zhì)，例如生物芯片或基因芯片，其空間上分布有多種聚合物分子并穩(wěn)定締合或固定在基質(zhì)表面上。示例性的微陣列模式包括寡核苷酸陣列和點陣列。基因表達微陣列分析方法是本領域技術(shù)人員已知的。有關綜述參見例如Yang等(2002)，Nat Rev genet 3(8)579-88)，或美國專利第6,004,755號，所述文獻公開了使用DNA微陣列進行定量基因表達分析的方法。
“人Pa9基因”是指這樣的基因(1)在嚴格性雜交條件下與具有SEQ ID NO1核苷酸序列的核酸分子特異性雜交；(2)編碼具有SEQID NO2氨基酸序列的蛋白質(zhì)；或(3)編碼能與抗體(例如多克隆抗體或單克隆抗體)結(jié)合的蛋白質(zhì)，該抗體針對具有SEQ ID NO2氨基酸序列的蛋白質(zhì)?！皣栏裥噪s交條件”具有本領域已知含義，描述于Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual，第二版，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，(1989)。示例性的嚴格性雜交條件包括在6x氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中、在約45℃雜交，接著在0.2xSSC和0.1％SDS中、在50-65℃洗滌一次或多次?！叭薖a9基因”包括人NL2TIE配體同源多肽基因(描述于US6348350)和人FDRG基因(描述于WO0177151)。示例性的人Pa9基因包括人Pa9結(jié)構(gòu)和功能多態(tài)性的基因。“多態(tài)性”是指群體內(nèi)個體中在特定基因座上的一系列基因變異體。
“分離的”核酸分子是基本上與其它核酸分子分離的核酸分子。“分離的”核酸分子可以是例如這樣的核酸分子不含在該核酸來源生物基因組DNA的5′和3′端天然側(cè)接該核酸分子的至少一個核苷酸序列。分離的核酸分子包括但不限于獨立于其它序列的分離的核酸分子(例如由PCR或限制性內(nèi)切核酸酶處理而產(chǎn)生的cDNA或基因組DNA片段)，以及摻入到載體、自主復制質(zhì)粒、病毒(例如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒或皰疹病毒)內(nèi)的核酸分子，或者摻入到原核生物或真核生物基因組DNA內(nèi)的先前分離的核酸。另外，分離的核酸分子可包含作為雜合或融合核酸分子組成部分的核酸分子。
“分離的”或“純化的”蛋白質(zhì)或其生物活性部分基本上不含來自其細胞或組織來源的細胞材料或其它污染蛋白，或者當化學合成時則基本上不含化學前體或其它化學品。術(shù)語“基本上不含細胞材料”包括蛋白質(zhì)制劑，其中所述蛋白從細胞中分離或重組產(chǎn)生后與該細胞組分分離。因此，基本上不含細胞材料的蛋白質(zhì)包括這樣的蛋白質(zhì)制劑其含有小于約30％、20％、10％或5％(干重)異源蛋白(在本文中也稱為“污染蛋白”)。在一個實施方案中，當?shù)鞍踪|(zhì)或其生物活性部分是重組產(chǎn)生時，也優(yōu)選基本上不含培養(yǎng)基，即培養(yǎng)基含量小于約20％、10％或5％的蛋白質(zhì)制劑體積。當?shù)鞍踪|(zhì)是通過化學合成而來的，則優(yōu)選基本上不含化學前體或其它化學品，即與參與該蛋白質(zhì)合成的化學前體或其它化學品彼此分離。因此，該蛋白制劑含有小于約30％、20％、10％、5％(干重)的并非目標多肽的化學前體或化合物。分離的生物活性多肽可具有幾種不同的物理形式。分離的多肽可以呈全長新生或為加工的多肽形式，或者是部分加工的多肽或加工多肽的組合?？梢越?jīng)特異性蛋白水解切割事件，對全長新生的多肽進行翻譯后修飾，導致形成全長新生多肽的片段。片段或片段的物理結(jié)合可具有全長多肽相關生物活性，然而，各片段相關生物活性的程度可以是不同的。
術(shù)語“標記”用于標記試劑(例如核酸探針或抗體)時，包括通過將檢測物質(zhì)與試劑偶聯(lián)從而用試劑直接標記(即物理連接)，以及用其它能直接標記的試劑進行間接標記?？芍苯訖z測的標記包括熒光標記和放射性同位素。說明性的放射性同位素標記包括例如35S、32p和3H。優(yōu)選的熒光劑是吸收光波長約為300-900nm的熒光劑，更優(yōu)選約400-800nm的熒光劑，其中最大吸收光波長范圍優(yōu)選在約500-800nm?？捎糜趩螛擞浺锏臒晒鈩嵗晒馑?、羅丹明、BODIPY、花青染料等。熒光劑進一步描述于Smith等，Nature(1986)，321647-679。間接標記的實例包括用熒光標記的第二抗體以及帶有生物素的末端標記的DNA探針來檢測第一抗體，使得可以用熒光標記的鏈霉抗生物素等來檢測它們。對于標記核酸分子來說的“末端標記”是指標記部分存在于至少鄰近末端區(qū)域。優(yōu)選的末端標記具有在核酸分子5′端的部分。標記也可在3′端，使用例如末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶。
“Pa13基因”是指這樣的基因(1)在嚴格性雜交條件下與核酸分子特異性雜交，該核酸分子與人Pa13cDNA(SEQ ID NO3)具有大于約60％的核苷酸序列同一性；(2)編碼蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)與人Pa13蛋白(SEQ ID NO4)具有大于約60％的氨基酸序列同一性；或(3)編碼能與抗體(例如多克隆抗體或單克隆抗體)結(jié)合的蛋白質(zhì)，該抗體針對本文所述的人Pa13蛋白?！叭薖a13基因”包括人TGF-β超家族蛋白(Yokoyama-Kobayashi等，1997，J Biochem(Tokyo).122(3)622-6，GenBank蛋白質(zhì)標識號BAA19151)。
“Pa13基因”可以在嚴格性雜交條件下與核酸分子特異性雜交，該核酸分子與SEQ ID NO3具有大于約65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的核苷酸序列同一性。在其它實施方案中，Pa13基因編碼蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)與SEQ ID NO4具有大于約65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的氨基酸序列同一性。示例性的“Pa13基因”包括人Pa13結(jié)構(gòu)和功能多態(tài)性的基因及其在包括大鼠、小鼠、豬、狗和猴子在內(nèi)的其它動物中的直向同源物。
“Pa21基因”是指這樣的基因(1)在嚴格性雜交條件下與核酸分子特異性雜交，該核酸分子與人Pa21cDNA(SEQ ID NO5)具有大于約60％核苷酸序列同一性；(2)編碼蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)與人Pa21蛋白(SEQ ID NO6)具有大于約60％的氨基酸序列同一性；或(3)編碼能與抗體(例如多克隆抗體或單克隆抗體)結(jié)合的蛋白質(zhì)，該抗體針對本文所述的人Pa21蛋白。人“Pa21基因”包括人C20orf139基因(Strausberg等，2002 Dec 24，Proc Natl Acad Sci USA.；99(26)16899-903.Epub 2002Dec 11.，GenBank蛋白質(zhì)標識號NP_542763)。
“Pa21基因”可以在嚴格性雜交條件下與核酸分子特異性雜交，該核酸分子與SEQ ID NO5具有大于約65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的核苷酸序列同一性。在其它實施方案中，“Pa21基因”編碼蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)與SEQ ID NO6具有大于約65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的氨基酸序列同一性。示例性的“Pa21基因”包括人Pa21結(jié)構(gòu)和功能多態(tài)性的基因及其在包括大鼠、小鼠、豬、狗和猴子在內(nèi)的其它動物中的直向同源物。
本文所用的“過氧化物酶體增殖物激活受體α”或“PPARα”是指這樣的多肽(1)與人PPARα蛋白具有大于約60％氨基酸序列同一性(Sher等，1993.Biochemistry.32(21)5598-604，GenBank蛋白質(zhì)標識號NP_005027)；(2)能與抗體(例如多克隆抗體或單克隆抗體)結(jié)合，該抗體針對本文所述的人PPARα蛋白；或(3)由多核苷酸所編碼，該多核苷酸在嚴格性雜交條件下與核酸分子特異性雜交，該核酸分子序列與人PPARαcDNA(GenBank核苷酸檢索號NM_005036)具有大于約60％核苷酸序列同一性。
“PPARα”可以是這樣的多肽與人PPARα蛋白具有大于約65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的氨基酸序列同一性。在其它實施方案中，“PPARα”是由多核苷酸所編碼的多肽，該多核苷酸在嚴格性雜交條件下與核酸分子特異性雜交，該核酸分子序列與人PPARαcDNA具有大于約65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的核苷酸序列同一性。示例性的“PPARα”蛋白包括人PPARα蛋白結(jié)構(gòu)和功能多態(tài)性以及在包括大鼠、小鼠、豬、狗和猴子在內(nèi)的其它動物中的PPARα直向同源物?！肮δ苄訮PARα”是指全長PPARα蛋白或任何保留PPARα生物活性的片段PPARα蛋白，例如當它一旦與膳食脂肪酸、貝特類或其它PPARα激動劑結(jié)合，即可激活包括本文所公開的Pa9、Pa13和Pa21在內(nèi)的宿主靶基因的轉(zhuǎn)錄。
術(shù)語“PPARα靶基因”或“PPARα的靶基因”包括其表達受PPARα調(diào)節(jié)的任何類型和來源的基因。這類基因的實例是嚙齒動物的脂肪酸?；?CoA氧化酶、3-烯酰基Co-A脫氫酶和蘋果酸酶，以及本文所述的Pa9、Pa13和Pa21基因。具體地講，術(shù)語“PPARα靶基因”包括其啟動子序列、尤其是其PPARα結(jié)合序列，例如過氧化物酶體增殖物應答元件(PPRE)。靶基因可以以任何DNA構(gòu)象的形式存在。它們可存在于細胞內(nèi)，或者可以以分離的形式存在。靶基因也可與其它序列結(jié)合在一起，尤其是與編碼報告蛋白的序列結(jié)合在一起。
“重組宿主細胞”是已被外源DNA序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細胞。當采用各種將DNA轉(zhuǎn)移到原核細胞或真核細胞中的已知技術(shù)，將外源DNA導入本文所用的細胞時，該細胞就被外源DNA“轉(zhuǎn)化”。外源DNA可以整合(共價連接)到染色體DNA上成為細胞基因組，或不整合。例如，外源DNA可以附加體(例如質(zhì)粒)形式保留?；蛘撸瑢τ诜€(wěn)定轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染細胞而言，外源DNA整合到染色體內(nèi)，使其通過染色體復制而遺傳給子細胞。該穩(wěn)定性由以下事實證明穩(wěn)定轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染細胞能夠建立由含有外源DNA的子細胞群體組成的細胞系或克隆。重組宿主細胞可以是原核細胞或真核細胞，包括細菌(例如大腸桿菌E.coli)、真菌細胞(例如酵母)、哺乳動物細胞(包括人、牛、豬、猴和嚙齒類來源的細胞系)和昆蟲細胞(例如源自果蠅屬(Drosophila)和蠶的細胞系)。可以進一步理解術(shù)語“重組宿主細胞”不僅是指特定患者細胞，而且也指該細胞的子代或潛在子代。因為在連續(xù)傳代中因突變或環(huán)境影響會發(fā)生某些修飾，所以這樣的子代實際上可能與母細胞不同，但仍然包括在本文所用的術(shù)語的范圍之內(nèi)。
“序列”是指聚合物中單體的線性順序，例如多肽中氨基酸的順序或者多核苷酸中核苷酸的順序。
正如本領域已知的，“序列同一性或相似性”是指經(jīng)序列比較而測定的兩個以上多肽序列或兩個以上多核苷酸序列之間的關系。在本領域中，“同一性”也指多肽序列或多核苷酸序列之間的序列相關程度，視情況而定，可經(jīng)所述序列鏈間比對而確定。
為了測定兩個氨基酸序列或兩個核酸的％同一性或相似性，為了最佳比較的目的，將序列進行比對(例如將空位引入第一氨基酸序列或核酸序列中，以便與第二氨基酸序列或核酸序列進行最佳比對)。然后，對相應氨基酸位或核苷酸位的氨基酸殘基或核苷酸進行比較。當?shù)谝恍蛄兄械奈恢迷诘诙蛄械南鄳恢蒙媳幌嗤蛳嗨瓢被釟埢蚝塑账嵴紦?jù)時，則這些分子在該位置是相同的或相似的。兩個序列間的％同一性或相似性是序列共享相同或相似位置數(shù)的函數(shù)(即％同一性＝相同位置數(shù)/位置總數(shù)(例如重疊位置)×100)。在一個實施方案中，兩個序列具有相同長度。
同一性和相似性都可容易地求出。在計算％同一性時，只計算準確的匹配。測定序列間同一性或相似性的常用方法包括例如公開于以下文獻的方法Carillo等(1988)，SIAM J.AppliedMath.48，1073。設計測定同一性的優(yōu)選方法，得到所測序列間的最大匹配。測定同一性和相似性的方法已經(jīng)編成了計算機程序。
用于比較兩個序列的數(shù)學算法的一個實例是以下文獻的算法Karlin等(1990)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264-2268，該算法在以下文獻中被修改Karlin等(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-5877。所述算法已經(jīng)結(jié)合到Altschul等(1990)，J Mol.Biol 215403-410的NBLAST和XBLAST程序中。為了比較目的而得到帶空位的比對，可使用以下文獻所述的Gapped BLASTAltschul等(1997)，NucleicAcids Res.253389-3402?；蛘撸梢允褂肞SI-Blast，進行迭代搜索，檢測分子間的距離關系。當使用BLAST、Gapped BLAST和PSI-Blast程序時，可以使用相關程序(例如XBLAST和NBLAST)的缺省參數(shù)。參見例如http://www.ncbi.nlm.nih.gov.。另外，也可使用FASTA方法(Atschul等(1990)，J.Molec.Biol.215，403)。
用于序列比較的數(shù)學算法的另一個實例是Myers等(1988)，CABIOS 411-17的算法。該算法結(jié)合到ALIGN程序(2.0版)中，作為GCG序列比對軟件包的組成部分(Devereux等(1984)，Nucleic AcidsResearch 12(1)，387)。
本文所用的術(shù)語“基本上相似”是指包括相同序列以及其上經(jīng)缺失、取代或添加而得到的修飾序列的多核苷酸或多肽序列，所述序列保持任何生物活性部分并具有其任何保守基序。
本文所用的術(shù)語“治療有效量”是指由研究人員、獸醫(yī)、醫(yī)學博士或其它臨床醫(yī)師所確定的活性化合物或藥物在組織系統(tǒng)、動物或人中引發(fā)生物反應或藥物反應(包括減輕所治療疾病的癥狀)的量。確定本發(fā)明藥物組合物治療有效量的方法是本領域已知的。
術(shù)語“載體”是指能夠?qū)⑵渖线B接的其它核酸轉(zhuǎn)移的核酸分子。一類載體是“質(zhì)?！保侵钙渲锌梢圆迦腩~外DNA區(qū)段的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。其它類型的載體是其中可以插入額外DNA區(qū)段的病毒載體。某些載體在所導入的宿主細胞中能夠自主復制(例如具有細菌復制起點的細菌載體和附加體哺乳動物載體)。其它載體(例如非附加體哺乳動物載體)一旦導入宿主細胞后，整合在宿主細胞基因組上并且隨宿主基因組復制而復制。此外，某些載體，例如表達載體，能夠指導與其操作性連接的基因的表達。一般而言，用于重組DNA技術(shù)的載體通常呈質(zhì)粒形式。然而，本發(fā)明包括其它形式的載體，例如病毒載體(例如復制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)，它們起到等同的作用。
評價代謝異常的治療有效性的方法就一般方面而言，本發(fā)明提供測定患者PPARα的生物活性的方法。該方法包括測定患者體內(nèi)所述基因表達水平的步驟，所述基因選自人Pa9基因、Pa13基因和Pa21基因。
本發(fā)明提供評價患者代謝異常的治療有效性的方法。代謝異?？梢允茄惓?dyslipidaernia)或與血脂異常相關疾病，例如動脈粥樣硬化、肥胖癥、血栓形成或冠狀動脈病、高血壓、絞痛、慢性腎衰竭、外周血管病、中風、II型糖尿病、葡萄糖耐量減低(IGT)和代謝綜合征(X綜合征)。
在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的方法可用于評價涉及PPARα激動劑或調(diào)節(jié)劑的治療有效性。PPARα激動劑的實例包括但不限于吉非貝齊、苯扎貝特、非諾貝特、氯貝丁酯、微粉化非諾貝特、GW2331、WY14643、L165041及其衍生物。
采自患者的生物樣品可用于測定患者體內(nèi)選自Pa9、Pa13或Pa21的PPARα靶基因的表達水平。可以使用技術(shù)人員已知的任何合適方法(例如通過穿刺活檢)，獲取生物樣品。例如，生物樣品可以得自PPARα表達集中的褐色脂肪組織、肝、心、腎或肌肉。生物樣品也可得自脂肪組織或外周血單核細胞(PBMC)。
在某些實施方案中，可以通過測定PPARα靶基因的mRNA量，來測定該靶基因的表達水平?？梢允褂酶鞣N技術(shù)，測定生物樣品中特定基因的mRNA的量。例如，可以通過使生物樣品與能夠特異性檢測mRNA的化合物或試劑接觸，從而測定mRNA。通常使用能夠與mRNA特異性雜交的標記核酸探針。例如，對人Pa9mRNA具有特異性的核酸探針可以是全長人Pa9cDNA，其具有SEQ ID NO1或其部分的核苷酸序列，例如長度至少為15、30、50、100、250或500個核苷酸的寡核苷酸，其可以在嚴格性雜交條件下與人Pa9mRNA雜交。在嚴格性條件下，對人Pa9mRNA具有特異性的核酸探針不僅將會與該mRNA雜交，而且還會與生物樣品中存在的其它mRNA雜交。用于本發(fā)明的核酸探針包括在嚴格性雜交條件下能夠與SEQ IDNO1、3或5雜交的探針。
測定生物樣品中特定基因的mRNA含量的其它技術(shù)是定量實時逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)?？梢酝ㄟ^逆轉(zhuǎn)錄，從樣品制備來自基因(例如人Pa9基因)的互補DNA(cDNA)。通過PCR，使用在嚴格性雜交條件下能夠與Pa9cDNA雜交的寡核苷酸引物，可以擴增cDNA。用于RT-PCR的試劑盒是市售的，例如來自Applied Biosystems(Foster City，CA)的“One-Step RT-PCR Master Mix Reagent”試劑盒。
最近十幾年來，原位雜交一直廣泛用于研究細胞或組織特定區(qū)室的mRNA的分布和表達。用于原位雜交的核酸探針種類包括不同長度的單鏈寡核苷酸、單鏈RNA探針(核糖核酸探針(riboprobe))或雙鏈cDNA序列?？梢詫ｉT針對任何已知表達的核酸序列來設計探針。各種不同放射性同位素和非同位素標記是市售的，可用于原位雜交。有關原位雜交方法的綜述，參見McNicol等(1997)，J.Pathol 182(3)250-61。測定生物樣品中特定基因的mRNA含量的其它有用的技術(shù)包括DNA微陣列分析、斑點印跡和RNA雜交。
在某些實施方案中，可以通過測定PPARα靶基因所編碼的多肽含量，來確定生物樣品中PPARα靶基因的表達水平?？赏ㄟ^使生物樣品與能夠特異性檢測蛋白質(zhì)的化合物或試劑接觸，來測定生物樣品中該蛋白質(zhì)含量。例如，用于檢測人Pa9蛋白的優(yōu)選試劑是能夠與該多肽部分特異性結(jié)合的抗體。在一個優(yōu)選方法中，可以使用對偶聯(lián)可檢測標記的人Pa9蛋白具有特異性的抗體，用于檢測人Pa9蛋白質(zhì)?？贵w可以是多克隆抗體或單克隆抗體?？梢允褂猛暾目贵w分子或其片段(例如Fab或F(ab′)2)?？贵w可以通過專家實驗室而得到。例如，可以在相當短的時間內(nèi)，開發(fā)出針對對Pa9、Pa13或Pa21蛋白具有特異性的合成肽序列的抗體，使得能夠更大程度地便于研究這些目的靶標。
檢測多肽(例如Pa9、Pa13或Pa21蛋白)的技術(shù)包括酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、蛋白質(zhì)印跡、免疫沉淀和免疫熒光以及免疫組織化學。實施這些方法的細節(jié)可參見例如Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，New York，(1989))。
另外，可以通過無創(chuàng)性定量方法，例如正電子發(fā)射斷層掃描(PET)造影，測定活的人體器官中PPARα靶基因的表達水平(Sedvall等，(1988)Psychopharmacol.Ser.，527-33)。例如，可以將痕量Pa9蛋白結(jié)合放射性示蹤物經(jīng)靜脈注射到患者體內(nèi)，然后對患者體內(nèi)褐色脂肪組織、肝、心、腎、肌肉或其它器官中放射性標記的分布進行造影。PET造影以及其它無創(chuàng)性定量造影的方法是本領域技術(shù)人員已知的(有關綜述參見Passchier等，(2002)Methods 27278)。
可以得到完整的檢測試劑盒，其中包含檢測PPARα靶基因表達水平所需的所有試劑，通常還有優(yōu)化方案。
確定患者代謝異常的治療有效性的試劑盒因此，本發(fā)明的特征也在于用于確定患者代謝異常的治療有效性的試劑盒。所述試劑盒優(yōu)選包括適于密封在至少一個容器中的區(qū)室化載體。載體還包括能夠測定生物樣品中人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因的多肽或mRNA的試劑，以及測定生物樣品中多肽或mRNA含量的方法(例如酶或底物)。試劑盒也可包括對照樣品或系列對照樣品，這些對照樣品可以被檢測并與所含有的試驗樣品對比。試劑盒的各組分可封裝在單獨容器中，所有不同容器可放在單一包裝中，并附有使用說明書，該說明書用于確定對患者代謝異常的治療是否有效。
對于基于抗體的試劑盒，試劑盒可包括例如(1)第一抗體(例如與固體支持物連接的抗體)，該抗體與Pa9、Pa13或Pa21基因所編碼的多肽結(jié)合；并且任選地，(2)不同的第二抗體，該抗體與多肽或第一抗體結(jié)合并且與可檢測試劑綴合；和(3)基本上純化的由Pa9、Pa13或Pa21基因所編碼的多肽，作為陽性對照。例如，基于抗體的試劑盒可包括抗體，該抗體與SEQ ID NO2、SEQ ID NO4或SEQ ID NO6的多肽特異性結(jié)合。抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體。技術(shù)人員已知的任何合適方法都可用于開發(fā)抗體。
對于基于寡核苷酸的試劑盒，該試劑盒可包括例如寡核苷酸，例如標記寡核苷酸，其可在嚴格性雜交條件下與Pa9、Pa13或Pa21基因的mRNA雜交。例如，該試劑盒可包括標記的寡核苷酸，其可在嚴格性雜交條件下與序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO2或SEQ IDNO3或其互補序列雜交?；蛘撸撛噭┖锌砂ㄒ粚σ?，用于從基因Pa9、Pa13或Pa21mRNA逆轉(zhuǎn)錄和擴增核酸分子。例如，該試劑盒可包括一對引物，用于從SEQ ID NO1、SEQ ID NO2或SEQ IDNO3擴增核酸分子。
對于基因Pa9、Pa13和Pa21作為新的PPARα靶基因的鑒定，也允許新篩選方法或測定的開發(fā)，用于鑒定化合物在治療代謝疾病中的潛在功效。
用于治療代謝異常的化合物的鑒定方法本發(fā)明的一般方面涉及用于治療患者代謝異常的化合物的鑒定方法。該方法包括化合物的鑒定，該類化合物能改變?nèi)薖a9基因、Pa13基因或Pa21基因的基因表達水平，或者能改變?nèi)薖a9基因、Pa13基因或Pa21基因所編碼多肽的生物活性。
可以采用常規(guī)實驗室模式或適于高通量的測定，實施化合物的鑒定方法。術(shù)語“高通量”是指允許同時對多個樣品進行簡便易行的篩選的測定設計，并且可以包括機器人操作能力。高通量測定的其它所需特征是經(jīng)過優(yōu)化以降低試劑用量或使操作次數(shù)最小化、以便獲得所需分析的測定設計。測定模式的實例包括96孔板或384孔板、漂浮液滴(levitating droplet)和“芯片實驗室(lab on a chip)”微通道芯片，用于液體處理實驗。正如本領域技術(shù)人員已知的，當塑料模板和液體處理裝置的微型化是先進的，或者當設計出改進的測定裝置時，使用本發(fā)明的測定可以更有效地篩選更多樣品。
用于篩選的候選化合物可選自各種化學類別，優(yōu)選選自有機化合物類。盡管候選化合物可以是大分子，但是優(yōu)選候選化合物是小分子有機化合物，即分子量大于50但小于2500的化合物。候選化合物具有一個或多個與多肽結(jié)構(gòu)相互作用所需的化學官能團。優(yōu)選候選化合物具有至少一個氨基、羰基、羥基或羧基，優(yōu)選至少兩個這樣的官能團，更優(yōu)選至少三個這樣的官能團。候選化合物可包括環(huán)碳或雜環(huán)結(jié)構(gòu)部分和/或芳族或多芳族結(jié)構(gòu)部分，所述部分被一個或多個以上示例的官能團所取代。候選化合物也可以是生物分子，例如肽、糖、脂肪酸、固醇類、類異戊二烯、嘌呤、嘧啶、以上物質(zhì)的衍生物或結(jié)構(gòu)類似物，或其組合等。當化合物是核酸時，該化合物優(yōu)選是DNA或RNA分子，盡管具有非天然鍵或亞單位的修飾核酸也包括在內(nèi)。
候選化合物可得自各種來源，包括合成或天然化合物文庫。例如許多方法可用于隨機和定向合成各種不同的有機化合物和生物分子，包括表達的隨機寡核苷酸、合成有機組合文庫、隨機肽的噬菌體展示文庫等。也可采用任何本領域已知的組合文庫的各種方法，獲取候選化合物，包括生物文庫；空間可尋址的平行固相或液相文庫；需要重疊合法的合成文庫方法；“一珠一化合物”文庫方法；以及使用親合色譜選擇的合成文庫方法(參見例如Lam(1997)，Anticancer Drug Des.12145)。或者，可以使用呈細菌、真菌、植物和動物提取物形式的天然化合物文庫，或者可以常規(guī)制備天然化合物文庫。此外，天然和合成產(chǎn)生的文庫和化合物可以經(jīng)常規(guī)化學、物理和生物化學方法進行常規(guī)修飾。
此外，可以對已知藥理學試劑進行定向或隨機化學修飾，例如?；?、烷基化、酯化、酰胺化等，以產(chǎn)生所述試劑的結(jié)構(gòu)類似物?？梢噪S機選擇候選化合物，或者可以根據(jù)與PPARα結(jié)合和/或調(diào)節(jié)PPARα活性功能的現(xiàn)有化合物，來選擇候選化合物。例如，候選試劑的一個來源是基于已知PPARα活化劑或抑制劑的分子文庫，其中在分子的一個或多個位置上改變化合物結(jié)構(gòu)，使其含有更多或更少的化學部分或不同的化學部分。在產(chǎn)生類似活化劑/抑制劑文庫中，可以對分子結(jié)構(gòu)變化進行定向、隨機取代和/或添加，或定向與隨機組合的取代和/或添加。
各種其它試劑也可包含在混合物中。這些試劑包括例如鹽、緩沖劑、中性蛋白(例如白蛋白)和去垢劑，這些試劑可用于促進優(yōu)化蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)和/或蛋白質(zhì)-核酸結(jié)合。所述試劑也可降低反應組分的非特異性或背景相互作用。也可使用改進測定效果的其它試劑，例如核酸酶抑制劑、抗微生物試劑等。
本領域中可找到合成分子文庫的方法實例，例如Zuckermann等(1994)，J Med.Chem.372678。化合物文庫可以存在于溶液中(例如Houghten(1992)，Biotechniques 13412-421)，或者在珠子(Lam(1991)，Nature 35482-84)、芯片(Fodor(1993)，Nature 364555-556)、細菌(美國專利第5,223,409號)、孢子(美國專利第5,571,698號)、質(zhì)粒(Cull等(1992)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 891865-1869)或噬菌體(參見例如Scott和Smith(1990)，Science 249386-390)中。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供用于治療患者代謝異常的化合物的鑒定方法，該方法包括下述步驟a)使PPARα-反應系統(tǒng)與包含緩沖劑和試驗化合物的溶液接觸；b)測量PPARα-反應系統(tǒng)受到人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因調(diào)節(jié)序列控制的基因表達水平；和任選將步驟(b)的結(jié)果與試驗化合物不存在時所測定的PPARα-反應系統(tǒng)的對照進行比較。
用于治療代謝異常的鑒定化合物包括可增加或降低PPARα-反應系統(tǒng)中人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因的基因表達的任何化合物。例如，該化合物可以在PPARα-反應系統(tǒng)中與PPARα結(jié)合并直接調(diào)節(jié)PPARα的生物活性，導致PPARα-反應系統(tǒng)中人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因的表達增加或降低。化合物也可與細胞組分結(jié)合，從而在PPARα-反應系統(tǒng)中與PPARα相互作用并間接調(diào)節(jié)PPARα相關生物活性，導致PPARα-反應系統(tǒng)中人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因的表達增加或降低?；衔镞€可通過與PPARα生物活性無關的機制，增加或降低PPARα-反應系統(tǒng)中人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因的表達。
“PPARα-反應系統(tǒng)”在其最廣泛含義上是指響應PPARα基因刺激(例如當使用PPARα激動劑時)的單細胞、組織和復雜多細胞生物體(例如哺乳動物)。在一個優(yōu)選的實施方案中，PPARα-反應系統(tǒng)是包含功能性PPARα蛋白和至少一種選自Pa9、Pa13和Pa21基因的PPARα靶基因的動物、組織或細胞。PPARα-反應系統(tǒng)可以是內(nèi)源PPARα和內(nèi)源PPARα靶基因Pa9、Pa13或Pa21的天然宿主。例如，人肝細胞HuH7細胞、人原代脂肪細胞和人原代骨骼肌細胞(SKMC)都是可用于本發(fā)明的天然PPARα-反應系統(tǒng)。PPARα-反應系統(tǒng)也可以是用于PPARα的重組宿主細胞。技術(shù)人員已知的任何合適方法都可用于獲取這樣的具有重組PPARα的PPARα反應系統(tǒng)。例如，對于至少一種內(nèi)源PPARα靶基因Pa9、Pa13或Pa21，可以通過將編碼功能性PPARα蛋白的外源DNA導入天然宿主細胞中，構(gòu)建PPARα-反應系統(tǒng)?？梢圆捎蒙鲜龇椒?，通過測量PPARα-反應系統(tǒng)中Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因的mRNA或蛋白含量，來確定該PPARα-反應系統(tǒng)中Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因的表達水平。
在另一個實施方案中，PPARα-反應系統(tǒng)包括功能性PPARα蛋白和核酸分子，該核酸分子包含與人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因調(diào)節(jié)序列操作性連接的報道基因編碼序列。該系統(tǒng)在響應PPARα調(diào)節(jié)劑時允許報道基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。因此，可以根據(jù)報道基因活性，間接測定PPARα靶基因的表達水平。例如，當螢光素酶(luc)基因用作報道基因時，可以根據(jù)PPARα-反應系統(tǒng)的生物發(fā)光量來測定PPARα靶基因的表達水平。其它報道基因包括但不限于綠色熒光蛋白(GFP)基因、β-半乳糖苷酶(lacZ)基因、氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶(cat)基因、β-葡糖醛酸糖苷酶基因、新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因和鳥嘌呤黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶基因。可以容易地測得報道基因的生物活性。試劑盒是市售的，便于測定報道基因活性。
技術(shù)人員已知的任何合適方法都可用于構(gòu)建包含報道基因編碼序列的核酸，該報道基因編碼序列與人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因調(diào)節(jié)序列操作性連接。人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因調(diào)節(jié)序列包括分別與人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因天然相關的或控制這些基因的基因表達的任何核苷酸序列。優(yōu)選的調(diào)節(jié)序列包括一個或多個潛在PPRE。例如，SEQ ID NO19或其部分的核苷酸序列代表人Pa13基因的調(diào)節(jié)序列；而SEQ ID NO20或其部分的核苷酸序列代表人Pa21基因的調(diào)節(jié)序列。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供用于治療患者代謝異常的化合物的鑒定方法，該方法包括下述步驟a)使人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因所編碼的多肽與包含緩沖劑和試驗化合物的溶液接觸；b)測定試驗化合物對多肽活性的影響；和c)將步驟(b)的結(jié)果與缺乏試驗化合物的對照進行比較。
結(jié)合測定可用于鑒定與人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因所編碼的多肽結(jié)合、并能潛在增加或降低多肽生物活性的化合物。一個示例性結(jié)合測定包括下述步驟(a)將試驗化合物與人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因所編碼的多肽和多肽的標記配體一起孵育；(b)將所述多肽與未結(jié)合的標記配體分離開來；和(c)通過降低標記配體與多肽結(jié)合的量，鑒定抑制配體與多肽結(jié)合的化合物。標記的多肽配體的實例是對多肽具有特異性的標記抗體?？梢允褂帽磉_人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因的宿主細胞(重組或天然)用于結(jié)合測定。優(yōu)選將由宿主細胞制備的細胞膜用于結(jié)合測定。更優(yōu)選基本上純化的人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因所編碼的多肽用于結(jié)合測定。
有多種方式可將所述多肽與未結(jié)合的標記配體分離開來。通常，將至少一種組分固定在固體基質(zhì)上，未結(jié)合組分可從該基質(zhì)上容易地分離出來。固體基質(zhì)可由許多材料制成，并且可制成各種形狀，例如微量滴定板、微珠、浸棒(dipstick)、樹脂顆粒等。優(yōu)選選擇使信噪比最大化、背景結(jié)合最小化以及便于分離和成本低廉的基質(zhì)。
例如通過從貯池中取出珠子或浸棒，倒空或稀釋貯池(例如微量滴定板孔)，或者用洗滌液或溶劑漂洗珠子、顆粒、色譜柱或濾器，來進行分離。分離步驟優(yōu)選包括多步漂洗和洗滌。例如，當固體基質(zhì)是微量滴定板時，各孔可用洗滌液洗滌數(shù)次，該洗滌液通常包含不參與特異性結(jié)合的孵育混合物的組分，例如鹽、緩沖劑、去垢劑、非特異性蛋白質(zhì)等。當固體基質(zhì)是磁珠時，該磁珠可以用洗滌液洗滌一次或多次并用磁力進行分離。
各種標記可用于標記配體，例如可直接檢測(例如放射性、發(fā)光、光密度或電密度等)或間接檢測(例如表位標記(例如FLAG表位)、酶標記(例如辣根過氧化物酶)等)的標記。
在本發(fā)明的不止一個以上測定方法的實施方案中，最好將多肽或其配體固定化，便于將多肽的結(jié)合形式與未結(jié)合形式分離開來，并且適于測定的自動化。在候選化合物存在或不存在時，可以在適于所含有的反應物的任何容器中完成試驗化合物與多肽的結(jié)合，或多肽與靶分子的相互作用。所述容器的實例包括微量滴定板、試管和微量離心管。在一個實施方案中，可以提供多肽的融合蛋白，該蛋白中添加了允許一個或兩個多肽及其配體與基質(zhì)結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。例如，具有谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的多肽的融合蛋白可以吸附在谷胱甘肽瓊脂糖凝膠珠(Sigma Chemical；St.Louis，MO)或谷胱甘肽衍生的微量滴定板上，然后將其與試驗化合物或試驗化合物和多肽的標記配體結(jié)合，再將混合物在有助于復合物形成的條件(例如在鹽和pH的生理條件下)下孵育。孵育后，珠子或微量滴定板各孔經(jīng)洗滌除去任何未結(jié)合組分，如上所述直接或間接測定復合物形成?；蛘?，可以將復合物從基質(zhì)上解離下來，用標準技術(shù)測定本發(fā)明多肽的結(jié)合或活性水平。
將蛋白質(zhì)固定在基質(zhì)上的其它技術(shù)也可用于本發(fā)明的篩選測定。例如，可使用生物素和鏈霉抗生物素綴合，將多肽或其配體固定化。
采用本領域眾所周知的技術(shù)(例如生物素化試劑盒，PierceChemicals；Rockford，IL)，可以由生物素-NHS(N-羥基-琥珀酰亞胺)制備生物素化多肽或靶分子，并固定在鏈霉抗生物素包被的96孔板(Pierce Chemical)的各孔上?；蛘?，與多肽具有反應性、但不干擾多肽與其靶分子結(jié)合的抗體，可以衍生到板的各孔上，并且多肽可以通過抗體綴合而捕獲在板的各孔上。除上述GST固定化復合物的方法之外，測定所述復合物的方法還包括使用對本發(fā)明多肽或靶分子具有反應性的抗體的復合物免疫測定，以及依賴于多肽相關酶活性檢測的酶聯(lián)測定。
基因Pa9、Pa13和Pa21作為新的PPARα靶基因的鑒定，也允許開發(fā)代謝異常的新治療方法。
代謝異常的治療方法因此，本發(fā)明的另一個一般方面涉及患者代謝異常的治療方法。該方法包括給予患者治療有效量的組合物的步驟，所述組合物能改變患者細胞內(nèi)人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因的基因表達模式或生物活性。
在一個實施方案中，該治療方法包括給予患者化合物的步驟，該化合物能夠增加或降低人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因的表達或生物活性?？墒褂蒙鲜龌衔镨b定方法，來鑒定這些化合物。
在另一個實施方案中，可以在細胞中使用靶向人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因的基因治療，治療患者代謝異常。例如，反義療法可用于降低細胞中人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因的表達，當需要降低人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因的表達或活性時。
基于反義策略的原理是根據(jù)這一假說通過mRNA和互補反義種類之間的胞內(nèi)雜交，可以達到基因表達的序列-特異性抑制。雜合RNA雙鏈體的形成可干擾靶mRNA(例如基因Pa9、Pa13或Pa21的mRNA)的加工/轉(zhuǎn)運/翻譯和/或穩(wěn)定性。雜交是發(fā)生反義效應所需的。反義策略可使用各種方法，包括使用反義寡核苷酸，注射反義RNA和反義RNA表達載體的轉(zhuǎn)染。反義鏈與有義鏈雜交所誘導的表型效應是基于例如蛋白質(zhì)水平、蛋白質(zhì)活性測定和靶mRNA水平的標準的變化。
反義核酸可以與靶基因的完整編碼鏈或其部分互補。反義核酸分子也可以與靶基因編碼鏈的全部或部分非編碼區(qū)互補。非編碼區(qū)(“5′UTR和3′UTR”)是側(cè)接編碼區(qū)的5′和3′序列，它們不能翻譯成氨基酸。優(yōu)選非編碼區(qū)是靶基因轉(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)節(jié)區(qū)。
反義寡核苷酸的長度可以是例如取自SEQ ID NO1、3或5互補序列的約15、25、35、45或65個核苷酸或更長。優(yōu)選該序列長度為至少18個核苷酸，以便與靶mRNA序列實現(xiàn)足夠強的退火，以防止序列翻譯(Izant等，1984，Cell，361007-1015；Rosenberg等，1985，Nature，313703-706)。可以采用化學合成和酶促連接反應，使用本領域已知方法，構(gòu)建反義核酸。例如，可以使用天然存在的核苷酸或不同修飾的核苷酸(其設計用來增加分子的生物穩(wěn)定性或增加反義核酸和有義核酸間形成的雙鏈體的物理穩(wěn)定性)，化學合成反義核酸(例如反義寡核苷酸)，例如可以使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。用于產(chǎn)生反義核酸的修飾核苷酸的實例包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、4-乙?；奏ぁ?-(羧基羥甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、β-D-半乳糖基Q核苷(beta-D-galactosylqueosine)、肌苷、N6-異戊烯基腺嘌呤、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、βD-甘露糖基Q核苷、5′-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-乙醇酸(v)、懷丁苷(wybutoxosine)、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-乙醇酸甲酯、尿嘧啶-5-乙醇酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w和2，6-二氨基嘌呤。反義核酸分子可以是CC-端基異構(gòu)核酸分子。CC-端基異構(gòu)核酸分子與互補RNA構(gòu)成特異性雙鏈雜合體，其中與常規(guī)P-單位不同，這些鏈彼此平行排列(Gaultier等(1987)Nucleic Acids Res.156625-6641)。反義核酸分子也可包括2′-o-甲基核糖核苷酸(Inoue等(1987)Nucleic Acids Res.156131-6148)或嵌合RNA-DNA類似物(Inoue等(1987)FEBS Lett.215327-330)。
或者，也可采用生物方法，用表達載體來產(chǎn)生反義核酸，該載體中已經(jīng)如上所述以反義方向亞克隆了核酸。反義表達載體可以是重組質(zhì)粒、噬菌粒或減毒病毒形式，其中反義核酸在高效調(diào)節(jié)區(qū)控制下產(chǎn)生，其活性可通過導入載體的細胞類型來決定。為了得到足夠胞內(nèi)濃度的反義分子，優(yōu)選載體構(gòu)建體，其中反義核酸分子處于強pol II或pol III啟動子控制之下。有關使用反義基因的基因表達調(diào)節(jié)的討論，參見Weintraub等(1985，Trends in Genetics，第1(1)卷，第22-25頁)。
通常，通過微量注射、脂質(zhì)體包被，將反義核酸給予患者，或者通過含反義序列的載體的表達原位產(chǎn)生反義核酸。反義核酸分子的給藥途徑的實例包括在組織部位直接注射。當病毒載體導入宿主細胞時，可將反義核酸連接到介導反義核酸轉(zhuǎn)移的病毒載體上。合適的病毒載體包括逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、皰疹病毒、痘苗病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒等?；蛘撸梢孕揎椃戳x核酸分子，以靶向所選細胞，然后系統(tǒng)給藥。例如，對于系統(tǒng)給藥來說，可以修飾反義分子，使其與所選細胞表面表達的受體或抗原特異性結(jié)合，例如通過將反義核酸分子與結(jié)合在細胞表面受體或抗原的肽或抗體連接在一起。
一旦進入細胞內(nèi)，反義核酸分子與編碼Pa9、Pa13或Pa21蛋白的細胞mRNA和/或基因組DNA雜交或結(jié)合，因而抑制表達，例如通過抑制轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。雜交可通過常規(guī)核苷酸互補，形成穩(wěn)定的雙鏈體，或者例如在與DNA雙鏈體結(jié)合的反義核酸分子的情況下，通過雙螺旋的大溝內(nèi)的特異性相互作用。
在一個優(yōu)選的實施方案中，該方法包括使用小干擾RNA(siRNA)。當對應于沉默基因的雙鏈RNA(dsRNA)存在于細胞內(nèi)時，許多生物體具有通過稱為RNA干擾的過程而使基因表達沉默的機制。使用dsRNA來降低特定基因活性的技術(shù)首先是用秀麗隱桿線蟲(C.elegans)而開發(fā)的，該技術(shù)被稱為RNA干擾，即RNAi(Fire等，(1998)，Nature 391806-811)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)RNAi用于許多生物體中，最近又在哺乳動物細胞中發(fā)現(xiàn)(有關綜述參見Moss，(2001)，Curr Biol 11R772-5)。當RNAi顯示出參與產(chǎn)生21-25個核苷酸的小RNA，人們有了重大進展(Hammond等，(2000)Nature 404293-6；Zamore等，(2000)Cell10125-33)。這些小的干擾RNA或siRNA可能起初來源于較大dsRNA，這些較大dsRNA開始加工并與靶RNA互補，最終使靶RNA降解。siRNA本身是在兩端具有短突出端的雙鏈。它們的作用是指導RNA，在互補區(qū)指導靶的單一切割(Elbashir等，(2001)Genes Dev 15188-200；Zamore等，(2000)Cell 10125-33)。
包含約21-25個與SEQ ID NO1、3或5的核苷酸序列互補的核苷酸的SiRNA可用于本發(fā)明的治療方法。產(chǎn)生siRNA的方法是本領域技術(shù)人員已知的。例如WO0175164 A2介紹了從體外系統(tǒng)產(chǎn)生長度為21-23個核苷酸(nt)的siRNA并用所述siRNA來干擾細胞或生物體內(nèi)基因的mRNA的方法。也可以使用穩(wěn)定的表達系統(tǒng)，從哺乳動物細胞體內(nèi)制備siRNA。例如目前報道了一個稱為pSUPER的載體系統(tǒng)，該系統(tǒng)指導哺乳動物細胞內(nèi)siRNAs的合成(Brummelkamp等，(2002)Science 296550-3)。使用siRNA來降低細胞內(nèi)基因表達的實例見實施例3。
本發(fā)明提供治療患者的代謝異常的方法，該方法包括下述步驟(a)將靶向人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因的mRNA的siRNA導入患者細胞內(nèi)，用于在患者細胞內(nèi)降解；和(b)將(a)所產(chǎn)生的細胞維持在siRNA干擾患者細胞內(nèi)人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因的mRNA的條件下。可使用本文所述的反義核酸的類似方法，將siRNA導入患者細胞內(nèi)。
在另一個實施方案中，可使用基因治療，通過將能夠表達人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因的核酸分子導入患者細胞內(nèi)，增加人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因的表達。在提高人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因的表達或生物活性是有益的情況下，所述基因治療對疾病治療尤其有用。
一種進行離體基因治療的方法概述于美國專利第5,399,346號，也見于該專利文件史所提交的文獻，所有這些文獻都是公眾可得的文件。一般而言，基因治療包括在體外將基因的功能性拷貝導入患者細胞內(nèi)，然后將基因工程細胞返還到患者體內(nèi)。基因的功能性拷貝是處于調(diào)節(jié)元件的可操作性控制之下，這允許在基因工程細胞內(nèi)表達該基因。大量轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)導技術(shù)以及合適表達載體都是本領域普通技術(shù)人員眾所周知的，其中的一些描述于PCT申請WO95/00654。體內(nèi)基因治療使用載體，例如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、痘苗病毒、牛乳頭瘤病毒和皰疹病毒，例如EB病毒。也可以使用需要體外感染的非病毒方法，實現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移。這類方法可包括磷酸鈣、DEAE葡聚糖、電穿孔和原生質(zhì)體融合。對于將DNA傳遞給細胞來說，靶向脂質(zhì)體也是潛在有益的。
作為一個實例，可將編碼靶基因的DNA分子首先克隆到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中。由載體表達靶基因的過程，可以被其內(nèi)源啟動子或逆轉(zhuǎn)錄病毒長末端重復序列或?qū)δ承┌屑毎哂刑禺愋缘膯幼域?qū)動。然后可將載體導入患者細胞內(nèi)，在靶細胞內(nèi)成功表達靶基因?；蚩蓛?yōu)選以這樣的形式傳遞給細胞該細胞可采用該基因形式來編碼足夠的蛋白質(zhì)，以提供有效功能。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體通常是優(yōu)選基因傳遞載體，尤其是用于基因治療，因為其感染的高效率和穩(wěn)定整合和表達?；蛘撸赏ㄟ^非病毒技術(shù)，包括使用配體-DNA綴合物或腺病毒-配體-DNA綴合物的受體介導靶向DNA轉(zhuǎn)移、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染膜融合或直接微量注射，將編碼靶基因的DNA分子轉(zhuǎn)移給細胞，用于基因治療。這些方法及其變化方法對于離體以及體內(nèi)基因治療來說是合適的。適用于本發(fā)明方法的基因治療分子方法學方案描述于GeneTherapy Protocols，Paul D主編，Robbins，Human press，Totowa NJ，1996。
治療期間，給予個體的本發(fā)明核酸分子的有效量可因以下各因素而異，包括患者類型、物種、年齡、體重、性別和醫(yī)學狀況；待治療病癥的嚴重程度；給藥途徑；患者的肝腎功能；和所用的具體核酸分子。具有基因治療專業(yè)技能的內(nèi)科醫(yī)師或獸醫(yī)可確定并指定預防、抵抗或阻止疾病進程所需有效量。達到既產(chǎn)生功效又無毒性的濃度范圍的最佳準確性，需要根據(jù)核酸分子對靶位點利用度的動力學的方案。這涉及到對參與基因治療的核酸分子的分布、平衡和消除方面的考慮。
本文公開的基因治療可以常規(guī)試驗所確定的合適劑量單獨使用，以便得到PPARα靶基因活性的最佳增加或降低，同時使任何潛在毒性最小化。另外，最好也可以與其它藥物聯(lián)合用藥或序貫用藥。當聯(lián)合給予幾種藥物以達到所需效果時，可以調(diào)整給藥劑量。這些不同藥物的劑量可以獨立優(yōu)化，并聯(lián)合給予以達到協(xié)同結(jié)果，其中與任一種藥物單獨使用相比，病理減少得更多。
以下實施例說明本發(fā)明，但是卻并不限制本發(fā)明。
實施例1對人體細胞中由PPARα激動劑所調(diào)節(jié)的靶基因的鑒定DNA微陣列技術(shù)用于鑒定人體細胞中由貝特類或其它PPARα激動劑所調(diào)節(jié)的靶細胞。
人肝細胞HuH7細胞是肝上皮細胞，得自Japan Health ScienceResearch Resources Bank(Osaka，Japan)。人原代脂肪細胞是專門用于脂肪合成和貯存的結(jié)締組織細胞，得自Zen-Bio，Inc(Research TrianglePark，NC)。人原代骨骼肌細胞(SKMC)得自Cambrex Bio Science(Walkersville，MD)。PPARα激動劑Wy14643(Agatha等，2000，Archivesof Biochemistry and Biophysics 380353-359)和非諾貝特分別得自Cayman Chemical(Ann Arbor，MI)和Sigma(St Louis，MO)。
將人HuH7細胞在含有10％胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(Gibco，NY)中培養(yǎng)。細胞用經(jīng)活性炭吸附脫脂的小牛血清(5％)(Sigma，St Louis，MO)處理約4-18小時。然后，將細胞用不同濃度的PPARα激動劑(Wy14643或非諾貝特)處理約20-24小時。將人SKM細胞在骨骼肌生長培養(yǎng)基(Cambrex Bio Science，Walkersville，MD)中培養(yǎng)，再用不同濃度的PPARα激動劑(Wy14643或非諾貝特)處理約18-20小時。將人原代脂肪細胞在前脂肪細胞培養(yǎng)基(Cat #PM_1，Zen-Bio，Inc.，Research Triangle Park，NC)中培養(yǎng)，再用不同濃度的PPARα激動劑(Wy14643或非諾貝特)處理約18-20小時。
從細胞中分離出總RNA，進行DNA微陣列處理。使用JJPRD版MEGA和MEGAB DNA微陣列(約6,000個基因/芯片)?？偣卜治隽思s12,000個基因。超過40片靶芯片和MEG-GA芯片用于實驗分析。從用PPARα配體處理的細胞中，測定了超過12,000個基因的表達水平，并與用溶媒對照處理的細胞的表達水平進行比較。使用軟件OMNI-Viz(OmniViz，Inc.Richland，WA)，對其基因表達水平被PPARα激動劑增加或降低的基因進行系統(tǒng)搜索。在所分析的1種、2種或所有3種細胞(人脂肪細胞、SKM細胞和HuH7細胞)中，鑒定出約24個基因由于PPARα激動劑處理而在基因表達中具有超過約1.8倍的變化。根據(jù)這些基因的cDNA序列，設計TaqMan探針，并使用實時定量PCR(RTQPCR)，以證實基因表達的變化。證實了在所有的三種人體細胞中，Pa9、Pa13和Pa21三種基因受到PPARα激動劑的調(diào)節(jié)。
按照生產(chǎn)商提供的方案，從培養(yǎng)細胞純化總RNA(Trizon methods，Invitrogen Inc.Ca)。分別根據(jù)GenBank序列檢索號W30988、AB000584和NM_080725，設計用于Pa9、Pa13和Pa21的聚合酶鏈式反應(PCR)引物和熒光探針(TagMan探針)。使用軟件PrimerDesign(AppliedBiosystems，F(xiàn)oster City，Ca)，設計引物和探針。用于Pa9的PCR引物是SEQ ID NO7(5′-CCTGCAGCCA TTCCAACCT)和SEQ ID NO8(5′-TCCCTTCTTA AGCTTCTGCCG)。用于Pa9的熒光探針是SEQ IDNO9(6FAM-CAGTACTTCC GCTCCATCCC ACAGCA)。用于Pa13的PCR引物是SEQ ID NO10(5′-AGCAGTCCTG GTCCTTCCAC T)和SEQ ID NO11(5′-AATCGGGTGT CTCAGGAACC T)。用于Pa13的熒光探針是SEQ ID NO12(6FAM-ACCTCAGTTG TCCTGCCCTGTGGAATG)。用于Pa21的PCR引物是SEQ ID NO13(5′-TGCTCGTTAC TTCATGGTCC C)和SEQ ID NO14(5′-TCCACCCCTC CTTCCTTGA)。用于Pa21的熒光探針是SEQ ID NO15(6FAM-TGGCTGCTGT ATCCCCAAGA ATCATGTC)。所有引物和探針都由Keystone實驗室(Camarillo，Ca)合成。
逆轉(zhuǎn)錄(RT)和PCR在一個步驟中進行，使用ABI PRISM 7700序列檢測系統(tǒng)(Applied Biosystems)中的“One-Step RT-PCR Master MixReagent”試劑盒(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)。每次反應在25μl總體積中進行，該總體積內(nèi)含有40ng總RNA。反應條件是48℃30分鐘，60℃30分鐘，94℃5分鐘，接著是94℃20秒和60℃1分鐘的40次循環(huán)。18S核糖體RNA的引物是由Applied Biosystems開發(fā)和提供的。人18S核糖體RNA的測定用作測定和裝入錯誤標準化的內(nèi)部控制。根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明，用Ct值(算法PCR曲線與計算域值線交叉的循環(huán)次數(shù))采集PCR數(shù)據(jù)，用該數(shù)值求出ΔCt(靶基因的Ct減去18S核糖體RNA對照的Ct)。使用如文獻所述的等式2-ΔΔCt，計算相對mRNA水平(Heid等，1996，Genome Res.6986-994)。
PPARα激動劑Wy14643或非諾貝特增加人HuH7細胞(表1)、原代SKMU細胞(表2)或原代脂肪細胞(表3)內(nèi)Pa9、Pa13或Pa21基因表達。毫不奇怪，基因表達模式在不同細胞類型中是不同的，因為基因調(diào)節(jié)極大地受細胞環(huán)境的影響。這些靶基因Pa9、Pa13和Pa21是PPARα激動劑特異性的，因為強效PPARγ激動劑羅格列酮在其有效濃度時在人HuH7肝細胞內(nèi)不能顯著增加這些基因的表達(表4)。
表1人HuH7肝細胞中的基因表達
表2人原代骨骼肌細胞中的基因表達
表3人原代脂肪細胞中的基因表達
表4人HuH7肝細胞中的基因表達
實施例2基因PA9、13和21的生物信息特征國立生物技術(shù)信息中心(National Center for BiotechnologyInformation)資助的生物信息程序(NCBI；http://www.ncbi.nlm.nih.gov)用于DNA序列分析。GenBank數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html)用于檢索DNA序列。SwissPro數(shù)據(jù)庫(http://www.ebi.ac.uk/swissprot)用于檢索蛋白質(zhì)序列。BLAST程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)用于基因搜索。Motif程序(http://motif.genome.ad ip)用于搜索功能性DNA結(jié)構(gòu)(基序、調(diào)節(jié)序列、結(jié)構(gòu)域等)。LocusLink程序(http://www.nobi.nlm.nih.gov/LocusLink)用于搜索序列和基因座的描述性信息。另外，Wisconsin軟件包(GCG，Genetics Computer Group)用于序列編輯和序列裝配(SEQED)、序列比較(GAP、BESTFIT、PILEUP)和DNA序列翻譯(TRANSLATION)。
1)Pa9用于微陣列的Pa9基因序列的原始注釋是GenBank檢索號W30988類似于人血纖蛋白原相關蛋白HFREP-1前體的智人(Homosapiens)cDNA克隆。BLAST搜索表明W30988序列(序列中的多個“n”是因為測序誤差)與幾個GenBank序列條目共享約97％(339/349；比較得分是e-162)的序列同一性，所述GenBank序列條目例如GenBank檢索號BC023647、AF202636、AF169312、AF153606、AB056477、E39784 BD075801、AX578037、AX464136、AX278133、AX201322、AX079971、AX079874、AX068560、AR243163和AR194215。這些GenBank序列條目看來是相同的并編碼約406個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)(SEQ ID NO2)。所編碼的蛋白質(zhì)在US6348350中稱為人NL2TIE配體同源多肽，而在WO0177151中稱為人血纖蛋白原結(jié)構(gòu)域相關(FDRG)蛋白。蛋白質(zhì)的其它注釋包括血管生成素樣蛋白PP1158和TIE受體酪氨酸激酶配體同源物等。
WO0177151(實施例12)公開了當用10μg/ml吡格列酮(一種PPARγ激動劑)處理穩(wěn)定表達PPARγ的NIH3T3成纖維細胞達2小時后，鼠FDRG表達水平在該細胞內(nèi)增加了10倍。另外，WO0177151(實施例13)公開了在Zucker糖尿病肥胖大鼠中，當用慢性曲格列酮(一種PPARγ激動劑)治療該動物時，鼠FDRG表達在白色脂肪組織(WAT)中被下調(diào)3-5倍。這些觀察結(jié)果與嚙齒動物中FDRG成為PPARγ的靶基因是一致的。
另外，Kersten等(2000，J.Biolo.Chem.27528488-493)表明，與鼠FDRG相同的鼠FIAF(禁食誘導脂肪因子)的表達在PPARα裸小鼠肝內(nèi)下降。他們也發(fā)現(xiàn)，經(jīng)WY14643處理后，在PPARα野生型小鼠肝細胞內(nèi)鼠FIAF的表達增加，而在PPARα裸小鼠肝細胞內(nèi)卻不增加。另外，他們表明，鼠FIAF的表達在雜合PPARγ突變小鼠WAT中減少。這些結(jié)果與FDRG在嚙齒動物中成為PPARα(肝內(nèi))和PPARγ(WAT內(nèi))的靶基因是一致的。
然而，人們不能因為FDRG是嚙齒動物體內(nèi)PPARα或PPARγ的靶基因，就簡單地下結(jié)論說它在人體內(nèi)就是PPARα或PPARγ的靶基因。貝特類或其它PPARα激動劑的作用是種屬特異性的，而在嚙齒動物體內(nèi)許多被貝特類或其它PPARα激動劑誘導的基因在人體內(nèi)卻不被誘導。另外，因為小鼠FDRG與人FDRG共享相對低的序列同一性在cDNA水平上約73％序列同一性，在蛋白質(zhì)水平上約76％序列同一性，所以小鼠和人體內(nèi)FDRG的基因調(diào)節(jié)機制可能不同。
SEQ ID NO1提供了人FDRG基因(AX278133)的核苷酸序列，W30988與FDRG基因間的序列比對見圖1。序列比對的檢測表明，W30988與人FDRG基因間的序列差異主要是因為W30988的測序誤差所致。進行定量實時RT-PCR，以測定人FDRG基因的基因表達是否受PPARα的調(diào)節(jié)。采用類似于實施例1所述的RT-PCR實驗，測定用30μM或100μM Wy14643刺激的人骨骼肌細胞中基因Pa9和基因FDRG的表達水平。用于測定Pa9基因表達的PCR引物和探針是如實施例1所述的SEQ ID NO7、8和9。這些引物和探針可在嚴格性雜交條件下與W30988雜交。設計用于測定FDRG基因表達的PCR引物和熒光探針，使得它們可與FDRG基因雜交，該基因在與W30988核苷酸序列共享序列同一性的區(qū)域之外。FDRG基因的引物和探針是SEQ ID NO16即5′-AGCCCCCTTT CTGAGTGCA、SEQ ID NO17即5′-CCCTTGGTCC ACGCCTCTA和SEQ ID NO18即6FAM-TGAGATCGAG GCTGCAGGAT ATGCTCA。如表5所示，Wy14643誘導Pa9基因表達，在30μM的濃度時達3.64倍，而在100μM的濃度時達6.45倍。對同一RNA樣品的測定表明，Wy14643誘導FDRG基因表達，在30μM的濃度時達4.37倍，而在100μM的濃度時達7.8倍。從不同系列的人SKM RNA樣品可以獲得類似結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。根據(jù)Pa9基因(W30988)和FDRG基因(NM_139314)之間的序列同源性，以及本文所述的mRNA定量測定數(shù)據(jù)，可以合理地得出以下結(jié)論1)W30988實際上是NM_139314全長cDNA序列的部分序列；2)包含W30988序列的人Pa9基因與人FDRG基因相同；和3)人FDRG基因確實被PPARα上調(diào)。
表5人原代骨骼肌細胞中的基因表達
2)Pa13用于微陣列的Pa13基因序列的原始注釋是GenBank檢索號N26311，即一種沒有其它功能性注釋的cDNA克隆。BLAST搜索表明N26311的核苷酸序列與公開于WO0194629的多個懷疑的癌細胞基因克隆共享約98％(416/424)的序列同一性，所述基因克隆例如GenBank檢索號AX329948。另外，N26311與幾個其它GenBank序列條目共享約95％(387/404)同一性，所述GenBank序列條目包括GenBank檢索號U88323、AF019770、AB000584、E09952、AX468429、AX408886、AR236374、AR127403、BC000529、AX052609、AR091376、E10038和AR107279。這些GenBank序列條目看來是相同的并編碼約308個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)(SEQ ID NO4)。該編碼蛋白質(zhì)的GenBank注釋包括TGF-β超家族蛋白質(zhì)、胎盤骨形態(tài)發(fā)生蛋白PLAB、巨噬細胞抑制細胞因子-1(MIC-1)、TGF-β超家族蛋白質(zhì)、被具有抗腫瘤特性的基因激活的非甾體抗炎藥、肝癌中表達的基因和前列腺生長因子等。先前已經(jīng)建立或描述了蛋白質(zhì)與糖尿病(或肥胖癥，或高脂血癥)之間無相關性。
這些GenBank條目AB000584的代表性核苷酸序列示于SEQ IDNO3，N26311與AB000584間的序列比對見圖2。對序列比對的檢測表明，N26311與AB000584間的序列差異主要是因為N26311的測序誤差所致。因此，包含N26311核苷酸序列的人Pa13基因可能與AB000584所述的TGF-β超家族蛋白質(zhì)基因相同(Yokoyama-Kobayashi等，1997，J Biochem(Tokyo).122(3)622-6)。采用與TGF-β超家族蛋白質(zhì)基因雜交的PCR引物和探針(SEQ ID NO10、11和12)，確實已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，人TGF-β超家族蛋白質(zhì)基因被PPARα上調(diào)，該TGF-β超家族蛋白質(zhì)基因在與N26311的核苷酸序列共享序列同源性的區(qū)域之外(參見實施例1的數(shù)據(jù))。
另外，在人Pa13基因5′非翻譯區(qū)(5′-UTR)鑒定出潛在PPRE。SEQID NO19顯示5′-UTR，從緊接TGF-β超家族蛋白質(zhì)基因ATG翻譯起始位點上游的-2538bp至-1bp，該TGF-β超家族蛋白質(zhì)基因與Pa13基因相同。5′-UTR的核苷酸序列是從人類基因組序列數(shù)據(jù)庫的GenBank檢索號AC008397的152956bp至155493bp下載的。在SEQID NO19的堿基970和2508上鑒定出兩個潛在的轉(zhuǎn)錄起始位點。在SEQ ID NO19的堿基160、564和1033上鑒定出各自包含AGGTCA序列的3個潛在PPRE。在SEQ ID NO19內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了具有TGACCT、AGGTCG或GGGTCA序列的幾個其它潛在PPRE位點。該結(jié)果與Pa13基因在人體細胞中受到PPAR的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)是一致的。
3)Pa21用于微陣列的Pa21基因序列的原始注釋是GenBank檢索號H49601類似于過敏毒素趨化性受體的cDNA克隆。BLAST搜索表明H49601的核苷酸序列與幾個GenBank序列條目共享約93％(384/410)的序列同一性，所述GenBank序列條目包括GenBank檢索號AF075053、AL833944、AL121758、BC017001、AK098418和AX368959。這些GenBank序列條目看來是相同的。大多數(shù)GenBank條目的注釋是具有未知功能的cDNA克隆。一些注釋懷疑是癌細胞基因克隆。H49601也與GenBank檢索號NM_080725(SEQ ID NO5)的互補序列共享93％(384/410)的序列同一性，該GenBank檢索號NM080725編碼137個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)(SEQ ID NO6)。該蛋白先前被稱為染色體20可讀框139(C20orf139)。先前已經(jīng)建立或描述了C20orf139與糖尿病(或肥胖癥，或高脂血癥)之間無相關性。
H49601與NM_080725間的序列比對見圖3。序列比對的檢測表明，H49601與NM_080725間的序列差異主要是因為H49601的測序誤差所致。因此，包含H49601的核苷酸序列的Pa21基因可能與NM080725中描述的C20orf139基因相同。采用與C20orf139基因雜交的PCR引物和探針(SEQ ID NO13、14和15)，確實已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，人C20orf139基因被PPARα上調(diào)，該C20orf139基因在與H49601核苷酸序列共享序列同源性的區(qū)域之外(參見實施例1的數(shù)據(jù))。
另外，在C20orf139基因5′非翻譯區(qū)(5′-UTR)鑒定出潛在PPRE。SEQ ID NO20顯示5′-UTR，從緊接C20orf139基因ATG翻譯起始位點上游的-1bp至-3000bp，該C20orf139基因與Pa21基因相同。5′-UTR的核苷酸序列是從人類基因組序列數(shù)據(jù)庫的GenBank檢索號Hs20_11544的568887bp至571886bp下載的。發(fā)現(xiàn)2個“AGGTCA”PPRE位點分別在-2201bp和-2866bp。發(fā)現(xiàn)3個“TGACCT”位點分別在-872bp、-893bp、-2344bp。該結(jié)果與C20orf139在人體細胞中受到PPAR的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)是一致的。
實施例3降低的PPARα導致降低對Pa9、Pa13或Pa21基因表達的誘導采用siRNA技術(shù)，首次建立具有降低的PPARα表達的人SKM細胞。然后測定Pa9、Pa13和Pa21在這些細胞中的基因表達，證實這些基因確實受到PPARα的調(diào)節(jié)。
按照本領域技術(shù)人員已知的方法，設計出對PPARα具有特異性的SiRNA寡聚物并用于在人SKMU細胞中敲減(knock-down)或降低PPARα表達水平(Brummelkamp等，2002，Science，296550-553)。使用GenBank檢索號S74349(人過氧化物酶體增殖物激活受體α，cDNA；PPARα)作為模板并使用軟件Target Finder(Ambion，Austin，TX)，最初設計出4套siRNA寡聚物。在這4套寡聚物中，發(fā)現(xiàn)有2套更有效，因而選擇這2套進行PPARα-敲減(knockdown)研究。這2套siRNA序列對應于相對起始密碼子的第一核苷酸的cDNA的907bp至927bp(SEQ ID NO21，5′-AACGATCAAG TGACATTGCT A)和1106bp至1126bp(SEQ ID NO22，5′-AACTGGATGA CAGTGATATC T)。寡聚物由Ambion Inc.(Austin，TX)化學合成。通用陰性對照siRNA寡聚物購自Ambion。
提前一天制備人原代骨骼肌細胞(hSKM，由Cambrex(MD)提供)，次日以4.67×104細胞/60mm碟的密度進行轉(zhuǎn)染(約20％匯合度)。將細胞在無抗生素的SKGM培養(yǎng)基(Cambrex，MD)中、在37℃、5％CO2中培養(yǎng)24小時。
按照生產(chǎn)商的使用說明，將siRNA轉(zhuǎn)染到培養(yǎng)細胞中。簡而言之，轉(zhuǎn)染前，先將siPORT胺(Ambion，TX)用無抗生素和血清的SKGM培養(yǎng)基(10μl siPORT/ml)稀釋，再將siRNA(50nM)加入到混合物中。將SKM細胞(提前在多個碟中制備)用2ml所得混合物轉(zhuǎn)染4小時。向各碟加入8ml新鮮SKGM培養(yǎng)基(無抗生素)，使細胞生長最大化并降低由轉(zhuǎn)染劑導致的潛在細胞毒性。作為對照，將細胞也用單獨siPORT胺或siPORT胺加上通用陰性對照siRNA來轉(zhuǎn)染。
用改良Qiagen RNeasy方法(Qiagen，Ca)轉(zhuǎn)染48小時后，從某些轉(zhuǎn)染碟中，分離出總RNA。用實時PCR證實PPARα表達水平確實被siRNA敲減。在所用的優(yōu)化條件下，發(fā)現(xiàn)SKM細胞內(nèi)PPARα表達水平被siRNA降低了70-80％(圖4)。
證實實驗后，將PPARα-敲減細胞用不同化合物再處理16小時。再從細胞中分理出總RNA，然后進行實時PCR，用實施例1所述的RT-PCR技術(shù)定量測定目標靶基因(例如Pa9、Pa13和Pa21)的表達水平。結(jié)果表明A)經(jīng)Wy14643處理后，在PPARα表達水平降低的SKM細胞中，Pa9表達水平僅增加了2.35倍，相比之下，在PPARα表達水平?jīng)]有降低的細胞中進行誘導，則增加了33.48倍(圖5)；B)對于Pa13基因(圖6)和Pa21基因(圖7)，也觀察到類似結(jié)果；和C)在PPARα表達水平降低的SKM細胞中，已知的非PPARα靶基因即PPARd的表達水平?jīng)]有變化。
由上文可知，本發(fā)明第一時間發(fā)現(xiàn)了本文所定義的人Pa9基因、Pa13基因和Pa21基因，是過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)的靶基因。盡管提供了以上詳述和優(yōu)選實施方案來說明本發(fā)明及其各種特征和優(yōu)勢，但是，可以理解，本發(fā)明并不是由上文限定，而是按照專利法原則之下的合理詮釋，由所附權(quán)利要求書予以限定。
權(quán)利要求
1.一種測定來自患者的生物樣品中過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)活性的方法，該方法包括測定樣品中選自人Pa9基因、Pa13基因和Pa21基因的基因表達水平的步驟。
2.一種評價患者代謝異常的治療有效性的方法，該方法包括下述步驟a.測定治療期間或治療之后患者體內(nèi)選自人Pa9基因、Pa13和Pa21的基因表達水平；和b.將步驟a)中測定的表達水平與治療之前患者體內(nèi)所述基因表達水平進行比較；其中治療期間或治療之后患者體內(nèi)所述基因表達水平增加，表明對患者代謝異常的治療是有效的。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述代謝異常是血脂異常或血脂異常相關疾病。
4.權(quán)利要求2的方法，其中所述代謝異常是動脈粥樣硬化、肥胖癥、血栓形成或冠狀動脈病、高血壓、絞痛、慢性腎衰竭、周圍血管病、中風、II型糖尿病或代謝綜合征即X綜合征。
5.權(quán)利要求2的方法，其中所述代謝異常的治療包括能夠調(diào)節(jié)過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)的生物活性的藥物。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述藥物是PPARα激動劑。
7.權(quán)利要求2的方法，該方法還包括從患者獲取生物樣品的步驟，其中測定所述生物樣品中所述基因在患者體內(nèi)的表達水平。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述來自患者的生物樣品是外周血單核細胞。
9.權(quán)利要求7的方法，其中所述來自患者的生物樣品來自脂肪組織、肝、心、腎或肌肉。
10.權(quán)利要求2的方法，其中通過測量患者體內(nèi)所述基因的mRNA含量來確定所述基因的表達水平。
11.權(quán)利要求10的方法，其中在嚴格性雜交條件下能夠與SEQ IDNO1雜交的核酸探針，用于測量患者的人Pa9mRNA含量。
12.權(quán)利要求10的方法，其中在嚴格性雜交條件下能夠與SEQ IDNO3雜交的核酸探針，用于測量患者的人Pa13mRNA含量。
13.權(quán)利要求10的方法，其中在嚴格性雜交條件下能夠與SEQ IDNO5雜交的核酸探針，用于測量患者的人Pa21mRNA含量。
14.權(quán)利要求2的方法，其中通過測量所述患者體內(nèi)所述基因編碼的多肽含量，來確定所述基因的表達水平。
15.權(quán)利要求14的方法，其中能夠與SEQ ID NO2特異性結(jié)合的抗體，用于測量患者的人Pa9蛋白含量。
16.權(quán)利要求14的方法，其中能夠與SEQ ID NO4特異性結(jié)合的抗體，用于測量患者的人Pa13蛋白含量。
17.權(quán)利要求14的方法，其中能夠與SEQ ID NO6特異性結(jié)合的抗體，用于測量患者的人Pa21蛋白含量。
18.一種用于評價患者代謝異常的治療有效性的試劑盒，該試劑盒包括在嚴格性雜交條件下與選自以下的核酸分子雜交的核酸探針SEQ ID NO1、SEQ ID NO3和SEQ ID NO5或其互補序列。
19.一種用于評價患者代謝異常的治療有效性的試劑盒，該試劑盒包括與選自SEQ ID NO2、SEQ ID NO4和SEQ ID NO6的多肽分子特異性結(jié)合的抗體。
20.權(quán)利要求18或19的試劑盒，該試劑盒還包括使用說明書，該說明書用于確定對患者代謝異常的治療是否有效。
21.一種用于治療患者代謝異常的化合物的鑒定方法，該方法包括下述步驟a.使人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因所編碼的多肽與包含緩沖劑和候選化合物或試驗化合物的溶液接觸；b.測定所述試驗化合物對所述多肽活性的影響；和c.將步驟(b)的結(jié)果與其中所述多肽僅與緩沖液接觸的對照的結(jié)果進行比較。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述多肽是由宿主細胞表達的。
23.權(quán)利要求21的方法，其中所述多肽與分離的膜制備物締合。
24.權(quán)利要求21的方法，其中所述多肽是純化的。
25.一種用于治療患者代謝異常的化合物的鑒定方法，該方法包括下述步驟a.使PPARα-反應系統(tǒng)與包含緩沖劑和候選化合物或試驗化合物的溶液接觸；b.測量PPARα-反應系統(tǒng)受到人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因調(diào)節(jié)序列控制的基因表達水平；和c.將步驟(b)的結(jié)果與缺乏試驗化合物的對照的結(jié)果進行比較。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述PPARα-反應系統(tǒng)是動物、組織或細胞。
27.權(quán)利要求25的方法，其中所述PPARα-反應系統(tǒng)包括功能性PPARα蛋白和受人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因調(diào)節(jié)序列控制的基因。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述功能性PPARα蛋白是由PPARα-反應系統(tǒng)內(nèi)源表達的。
29.權(quán)利要求27的方法，其中所述功能性PPARα蛋白是由導入所述PPARα-反應系統(tǒng)中的外源DNA分子重組表達的。
30.權(quán)利要求27的方法，其中受到人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因調(diào)節(jié)序列控制的基因分別是人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因。
31.權(quán)利要求27的方法，其中受到人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因調(diào)節(jié)序列控制的基因是報道基因。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述報道基因選自綠色熒光蛋白(GFP)基因、β-半乳糖苷酶(lacZ)基因、螢光素酶(luc)基因、氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶(cat)基因、β-葡糖醛酸糖苷酶基因、新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因和鳥嘌呤黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶基因。
33.一種PPARα-反應系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含功能性PPARα蛋白和核酸分子，所述核酸分子包含與人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因調(diào)節(jié)序列操作性連接的報道基因編碼序列。
34.一種分離的核酸分子，所述分子包含與人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因調(diào)節(jié)序列操作性連接的報道基因編碼序列。
35.權(quán)利要求34的分離的核酸分子，其中所述報道基因選自綠色熒光蛋白(GFP)基因、β-半乳糖苷酶(lacZ)基因、螢光素酶(luc)基因、氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶(cat)基因、β-葡糖醛酸糖苷酶基因、新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因和鳥嘌呤黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶基因。
36.一種治療患者代謝異常的方法，該方法包括將治療有效量的組合物給予患者的步驟，所述組合物能改變患者細胞內(nèi)人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因的基因表達或生物活性，其中所述組合物不是已知的PPARα激動劑或拮抗劑。
37.權(quán)利要求36的方法，其中所述組合物是siRNA，所述siRNA靶向人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因的mRNA，用于在患者細胞內(nèi)降解。
38.權(quán)利要求36的方法，其中所述組合物是能夠在患者細胞內(nèi)表達人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因的核酸分子。
全文摘要
本發(fā)明的特征是鑒定出新的人過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)的靶基因及該新靶基因在治療或監(jiān)測代謝異常的治療以及在鑒定用于治療代謝異常的化合物中的用途。
文檔編號G01N33/68GK1930305SQ200580007912
公開日2007年3月14日 申請日期2005年1月14日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月14日
發(fā)明者L·周, E·V·克賴恩, K·T·德馬雷斯特 申請人:詹森藥業(yè)有限公司