專利名稱：用于檢測(cè)病原微生物的寬視域方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及化學(xué)和生物學(xué)分析領(lǐng)域，更具體地講，涉及使用寬視域拉曼(Raman)和熒光光譜學(xué)快速鑒定生物劑和病原體。
背景技術(shù)：
恐怖分子采用化學(xué)和/或傳染性生物劑作為大規(guī)模殺傷武器威脅平民的安全。公眾的關(guān)心業(yè)已增加，特別是在我國(guó)，因?yàn)榭植婪肿邮褂弥T如炭疽的生物威脅制劑正在變成現(xiàn)實(shí)。幾乎每一個(gè)人在心靈上都在出現(xiàn)數(shù)以萬(wàn)計(jì)的受感染和死亡的無(wú)辜受害者的夢(mèng)魘。生物戰(zhàn)和化學(xué)戰(zhàn)是意義重大的，不僅是因?yàn)樯膿p失，而且還由于美國(guó)經(jīng)濟(jì)的代價(jià)。據(jù)疾病控制中心估計(jì)，喪失十萬(wàn)條生命，將會(huì)產(chǎn)生290億美元的經(jīng)濟(jì)損失。生物戰(zhàn)劑(″BWAs″)和化學(xué)戰(zhàn)劑(CWAs)的大規(guī)模殺傷潛能被很多人認(rèn)為是與核武器相當(dāng)或者比核武器威脅更大。核武器具有影響有限區(qū)域的可能，盡管所述區(qū)域很大，并且使用這樣的武器在事后會(huì)馬上表現(xiàn)出來(lái)。另一方面，BWAs和CWAs幾乎是沒(méi)有邊界的，并且具有在從爆心投影點(diǎn)無(wú)聲地?cái)U(kuò)散并且通過(guò)人群不受控制的擴(kuò)散的潛力。同樣，快速檢測(cè)并且定量很低水平的放射性污染的技術(shù)被廣泛地使用。不幸的是，用于類似水平的BWAs和CWAs的所述技術(shù)是不確定的、不能廣泛利用的并且在很多場(chǎng)合下不是非常快速的。
這種類型的威脅在心理學(xué)上的影響同樣是非常重要的。公眾正越來(lái)越了解新出現(xiàn)的病原體。對(duì)BWAs和CWAs看不見(jiàn)的性質(zhì)的擔(dān)心，使得這種性質(zhì)以及所述微生物本身成為非常有效的威懾武器。除了感覺(jué)之外，由于生物技術(shù)的難于置信的發(fā)展，存在非常現(xiàn)實(shí)的危險(xiǎn)?，F(xiàn)在可以改變毒性最強(qiáng)的細(xì)菌或病毒，或者增強(qiáng)它的致命性和對(duì)常規(guī)治療的耐受性。分子生物學(xué)革命業(yè)已進(jìn)行了超過(guò)30年時(shí)間，并且具有專門(mén)技能的制造這種大規(guī)模殺傷武器的專業(yè)技能的人員的數(shù)量因此也在增加。在這種發(fā)達(dá)的全球旅行的年代，任何類型的BWA在世界范圍內(nèi)在極短的時(shí)間內(nèi)快速擴(kuò)散的可能性是很大的，并且普通公眾也十分清楚這一事實(shí)。
使用諸如特異性抗體、遺傳學(xué)標(biāo)記或在培養(yǎng)物中繁殖的生物學(xué)工具鑒定病原體的常規(guī)方法基本上是緩慢的，并且需要大量的手工操作。另外，由于新的BWAs和CWAs是通過(guò)工程方法制造的，上述常規(guī)工具變得越來(lái)越?jīng)]有效果。隨著B(niǎo)WAs和CWAs被恐怖分子所利用變得越來(lái)越現(xiàn)實(shí)，越來(lái)越需要能夠在分子水平上快速并且準(zhǔn)確地檢測(cè)少量上述制劑并且對(duì)它們進(jìn)行分類，而又不接觸它們的方法。需要節(jié)省成本的和使用起來(lái)簡(jiǎn)單的方法，以便它們能夠被廣泛地采用。還需要有助于增加我們對(duì)所述戰(zhàn)用毒劑的生物學(xué)和化學(xué)基礎(chǔ)的了解，以及對(duì)人體的潛在影響的方法。另外，通過(guò)所述分子分析獲得的知識(shí)，有助于鑒定治療和預(yù)防劑的新的目標(biāo)。
發(fā)明概述披露了寬視域觀察和光譜學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)，還被披露為分子光譜學(xué)鑒定系統(tǒng)，該系統(tǒng)采用拉曼，熒光，W-可見(jiàn)反射/吸收和/或近紅外(NIR)反射/吸收光譜學(xué)技術(shù)，用于表征BWAs和CWAs。
光譜學(xué)是用于從化合物到有機(jī)分子的元素、分子或化學(xué)分析的廣泛使用的方法。采用振動(dòng)光譜學(xué)進(jìn)行分析，使得人們能夠確定多種材料的詳細(xì)的結(jié)構(gòu)和化學(xué)特性。所述方法在分析均質(zhì)簡(jiǎn)單材料時(shí)是理想的，如分析化學(xué)物質(zhì)，塑料，聚合物等。有機(jī)生物分子傾向于是更復(fù)雜的材料。微生物明顯更為復(fù)雜，并且即使在最小單位，即細(xì)胞水平上，也是由復(fù)雜系列的功能性生物學(xué)結(jié)構(gòu)組成，它們分別構(gòu)成了它們自身特有的，復(fù)雜的有機(jī)生物分子大分子。它們包括這樣的功能性單位，如細(xì)胞核，微絲，質(zhì)膜，色素，線粒體，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，微絨毛，溶酶體，中心粒，高爾基體和各種保護(hù)層。所述復(fù)雜的結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)/化學(xué)變化產(chǎn)生了生物可變性，它使得光學(xué)分析變得復(fù)雜。
材料的現(xiàn)有分析性光學(xué)測(cè)量通常屬于兩種類型中的任意一種。其中一種類型是將純的分批材料用于作為大塊的宏觀樣品進(jìn)行測(cè)量，即大的采樣體積，而第二種類型利用微量分析技術(shù)分析單一的小的物體。在實(shí)際場(chǎng)合下，宏觀體積的采樣不具備觀察低濃度病原體的靈敏度，這種靈敏度對(duì)于評(píng)估BWAs和CWAs來(lái)說(shuō)是特別重要的條件。另一方面，微量分析方法使得人們能夠通過(guò)使用高度聚焦的激發(fā)光束對(duì)各個(gè)用顯微鏡可見(jiàn)的物體進(jìn)行集中分析。所述聚焦光束光學(xué)方法對(duì)于無(wú)機(jī)和有機(jī)顆粒來(lái)說(shuō)是有效的，但是，對(duì)于微生物來(lái)說(shuō)可能是無(wú)效的，這是微生物的生物可變性和對(duì)照射的敏感性。生物可變性以兩種形式出現(xiàn)一種來(lái)自由于微生物的不同的定位而導(dǎo)致的信號(hào)變化，即采樣探頭小于所述生物，而另一種形式來(lái)自相同類型生物之間的小的差異。另外，生物學(xué)微生物在高度聚焦的入射光束的高能密度下可能會(huì)分解或′燃燒′。這就需要減少對(duì)所述微生物的光照，以便不破壞任何一種生物，并因此更長(zhǎng)時(shí)間收集光學(xué)發(fā)射，以便補(bǔ)償減弱的照射強(qiáng)度。為了降低生物利用度的影響，還需要采集很多小的物體的樣品。因此，使用光學(xué)微量分析方法連續(xù)采集很多生物的樣品，是非常耗費(fèi)時(shí)間的。我們的方法通過(guò)使用寬視域和光學(xué)激發(fā)的寬視域以平均來(lái)自少量病原微生物的光學(xué)發(fā)射，從而消除了上述限制。所得到的靈敏度使得我們能夠檢測(cè)并且可靠地鑒定少量微生物，即使在存在外源材料，即所謂的′掩蔽劑′的基質(zhì)的條件下也是如此。
業(yè)已將紅外、拉曼、可見(jiàn)反射、熒光和近紅外光譜學(xué)應(yīng)用于檢測(cè)微生物，并且取得了有限的成功。紅外和拉曼光譜學(xué)能夠提供光譜豐富的指紋信息，而如果產(chǎn)生特殊的熒光特征，可以使用熒光。使光學(xué)散射技術(shù)的應(yīng)用變得復(fù)雜的是以下事實(shí)，即很多材料在可見(jiàn)光照射下會(huì)產(chǎn)生寬的熒光背景。所述熒光產(chǎn)生了顯著的光譜背景，這種背景有可能使在被分析的視域中的其他物體的光譜分布圖變得模糊。這種背景通常根據(jù)基片而改變，特別是在處理包括多種成分或成分的混合物的實(shí)際樣品時(shí)更是這樣。我們發(fā)現(xiàn)，這種空間依賴型熒光背景能夠通過(guò)用光學(xué)探針束照射略大于采樣區(qū)域的區(qū)域顯著地減弱。這種減弱被稱作光致褪色。這種技術(shù)與使用寬視域補(bǔ)償少量微生物的組合，使得本發(fā)明能夠常規(guī)地并且精確地應(yīng)用于檢測(cè)上述微生物。
這種消除干擾熒光信號(hào)的方法有別于增加熒光輔助的其他方法。將可以導(dǎo)入的熒光配體工程改造成能結(jié)合生物體中的某些生物分子特征。其中通常涉及某些生物活性劑，如抗體，它能識(shí)別并且結(jié)合特殊的生物分子特征。在這里，所述熒光配體隨后起著所述生物或生物部分的標(biāo)記，標(biāo)簽或標(biāo)志的作用。盡管所述外部熒光標(biāo)記/標(biāo)志可能增加有助于特殊生物學(xué)特征、生物或生物材料的光學(xué)檢測(cè)的反差，它們?cè)斐闪丝上牡?，有?wèn)題的試劑，這些試劑增加了成本、時(shí)間和對(duì)檢測(cè)過(guò)程的額外的操作。
諸如拉曼和紅外線的光學(xué)方法同樣具有比純化合物顯著更弱的來(lái)自生物學(xué)大分子的信號(hào)，因此因?yàn)閷?duì)檢測(cè)低濃度的某些類型的信號(hào)放大而獲益。在紅外線中，它可能包括樣品的多次反射，以便增加所得到的信號(hào)。不過(guò)，這隨后需要某些特化的樣品大小或采樣方式，這有可能制約應(yīng)用和增加采樣裝置的成本。在拉曼光譜學(xué)中，可以通過(guò)使用特殊的底物增強(qiáng)信號(hào)，所述底物能將拉曼信號(hào)增加3-7個(gè)數(shù)量級(jí)。不過(guò)，并非所有的分子都能結(jié)合SERS活性表面，這限制了這種方法的應(yīng)用。我們的發(fā)明不需要特殊的底物，并且通過(guò)使用寬視域改善了信噪比。
為了增強(qiáng)拉曼信號(hào)，業(yè)已將共振拉曼應(yīng)用于生物學(xué)系統(tǒng)，這是通過(guò)使用高能量光照(波長(zhǎng)小于大約400nm)激發(fā)生物分子或生物體而實(shí)現(xiàn)的。盡管拉曼信號(hào)在共振條件下得到增強(qiáng)，較高的激發(fā)能量激發(fā)了生物分子的電狀態(tài)，從而產(chǎn)生了更大的激光能量吸收，并且通過(guò)樣品加熱，這樣可降解或破壞所述微生物。另外，所述光學(xué)元件和UV檢測(cè)器需要支持UV發(fā)光，并且檢測(cè)更加昂貴，并且比常用的可見(jiàn)光光學(xué)元件更加特殊。
本發(fā)明披露如何利用寬視域光譜學(xué)檢測(cè)病原微生物，這種方法避免了很多可能的光譜學(xué)的很多缺陷和限制，這種方法可應(yīng)用于檢測(cè)低濃度的微生物。我們的寬視域分子光譜學(xué)方法減弱了若干偽跡，以及固有的采樣問(wèn)題，因此能夠進(jìn)行高度可靠的檢測(cè)，這是現(xiàn)有研究所無(wú)法預(yù)期的，并且是迄今為止尚未認(rèn)識(shí)到的，盡管當(dāng)今拉曼光譜學(xué)已經(jīng)被廣泛地使用。我們的方法使用了光譜學(xué)系統(tǒng)，我們的寬視域發(fā)光方法和數(shù)字光譜分布圖識(shí)別系統(tǒng)，能識(shí)別病原微生物。與現(xiàn)有方法不同，該方法提供了高靈敏度，并且使得病原微生物的識(shí)別可靠而且可行。
本發(fā)明的關(guān)鍵因素是將寬視域用于觀察并且照射目標(biāo)基片的受控制的區(qū)域，同時(shí)采集并且分析來(lái)自所述寬視域的相同區(qū)域的光發(fā)射。我們將寬視域確定為這樣的區(qū)域，它等于或小于接受研究的微生物。我們的發(fā)明使用若干種方法解決了用于鑒定微生物的常規(guī)光學(xué)方法所產(chǎn)生的若干關(guān)鍵問(wèn)題。
在用于顯微鏡生物學(xué)研究的最廣泛使用的拉曼方法中，使用了顯微-拉曼光譜學(xué)。在這里，業(yè)已校正的激光的緊湊的聚焦光束導(dǎo)致了大約1微米和更小的發(fā)光點(diǎn)尺寸，以便增加感興趣的目標(biāo)上的拉曼信號(hào)強(qiáng)度。這種高度焦距的光束在試圖測(cè)量微生物時(shí)有可能破壞微生物。減弱照射光束的能量，會(huì)導(dǎo)致需要更長(zhǎng)的數(shù)據(jù)采集時(shí)間。另外，這種小點(diǎn)尺寸的使用，可能導(dǎo)致賦予微生物的生物可變性的不可再現(xiàn)的信號(hào)，因?yàn)樗鼈兎植荚诒环治龅臉?biāo)本上的不同的區(qū)域。另外，熒光背景信號(hào)通常隨著時(shí)間和在不同的樣品區(qū)域而改變，這進(jìn)一步干擾了對(duì)病原微生物的檢測(cè)。
本發(fā)明涉及一種替代的方法，用于靶定、照射并且檢測(cè)微生物，并因此構(gòu)成了微生物檢測(cè)的新方法。所述靶定包括發(fā)現(xiàn)具有若干種推測(cè)特征的基片的區(qū)域，所述特征是病原體掩蔽材料的特征或病原體本身的各種特征，如孢子、粉末、團(tuán)聚物或團(tuán)塊的形狀、大小或顏色，以及在上述物體內(nèi)的熒光特征。這一目的可以通過(guò)人工檢查或使用自動(dòng)化圖像識(shí)別技術(shù)通過(guò)光學(xué)觀察裝置而實(shí)現(xiàn)。一旦靶定結(jié)束，強(qiáng)度會(huì)增強(qiáng)，并且選擇較小的區(qū)域，以便能夠收集通過(guò)靶定的區(qū)域內(nèi)的拉曼或熒光激發(fā)產(chǎn)生的光發(fā)射的更大的立體角。該區(qū)域在通過(guò)光學(xué)觀察裝置觀察時(shí)，仍然能發(fā)現(xiàn)所述目標(biāo)材料的寬視域，而不是單個(gè)顯微鏡可見(jiàn)的物體。光譜學(xué)的所述激發(fā)光源然后照亮該寬視域周?chē)膮^(qū)域，它具有足夠高的能量密度，以便使該區(qū)域光致褪色，并且能夠獲得穩(wěn)定的光譜。稍微的超量裝載是有利的，因?yàn)樗伺c稍微的偏移相關(guān)的光譜變化或在采集光譜期間樣品位置的改變，以及在照射區(qū)的相鄰區(qū)域的隨后的數(shù)據(jù)采集期間的樣品位置的變化。在明顯大于寬視域區(qū)域使用寬范圍照射的照射方法，不能提供產(chǎn)生適當(dāng)光致褪色的足夠能量。拉曼散射光的采集，是在寬視域上進(jìn)行的，以便有效地收集并且平均來(lái)自少量微生物的光譜，然后對(duì)病原微生物的光譜特征進(jìn)行分析。這種寬視域采樣方法與用于拉曼光譜學(xué)的點(diǎn)或線聚焦激發(fā)光源相比提供了若干關(guān)鍵優(yōu)點(diǎn)。與很多光學(xué)微量分析方法不同，我們采用了非共焦無(wú)限校正光學(xué)系統(tǒng)，并且在寬視域中觀察目標(biāo)區(qū)，使用具有大量孔的物鏡。與將能量集中在研究物體上的其他方法不同，我們將光束分散在所使用的視域中。該方法可以對(duì)目前使用的光譜學(xué)方法提供以下改進(jìn)
1.接受研究的樣品的較大區(qū)域的有效的光致褪色，降低了總體熒光背景信號(hào)，以便增強(qiáng)信噪比，并且避免局部熒光波動(dòng)，這種波動(dòng)可能降低信噪比，這種現(xiàn)象通常出現(xiàn)在常規(guī)微量分析儀器上。
2.照射的寬視域降低了生物學(xué)信號(hào)波動(dòng)，改善了熱控制，增強(qiáng)了信號(hào)水平和可再現(xiàn)性。
3.發(fā)光的寬視域改善了目標(biāo)病原微生物的信噪比。
4.基于標(biāo)本或目標(biāo)微生物的某些客觀參數(shù)，例如，所述生物的固有尺寸的人工或自動(dòng)觀察并且選擇基片區(qū)域的能力，增強(qiáng)了信噪比。
5.將類似的寬視域用于觀察、照射和發(fā)射，確保了在基片上選擇確定的和合適的區(qū)域用于分析。
6.使用的構(gòu)型和方法使得可以采用低成本緊湊分光光度計(jì)，例如，具有簡(jiǎn)單的波長(zhǎng)分散元件的分光光度計(jì)，具有足夠的分辨度以便檢測(cè)能接受研究的標(biāo)本中發(fā)射的光譜成分。所述可放大的光學(xué)元件與這種寬視域方法的有效使用使得所述檢測(cè)系統(tǒng)能夠按比例縮小到更小的尺寸，從而能夠形成便攜式手持單元。
7.可以將多種基片用于通過(guò)該分析方法分析微生物，以便能夠使該方法具有更大的靈活性。在它上面能夠產(chǎn)生所述材料的很多材料也可用作基片，例如紙張。
大范圍照射和檢測(cè)需要某些簡(jiǎn)單的樣品制備。樣品制備涉及采集樣品，并且將樣品放置成薄的均勻的層。選擇目標(biāo)區(qū)域用于這種制備，需要建立正確的圖像輪廓，如大小和形狀。目標(biāo)密度將決定所使用的視域，以及所需要的照射強(qiáng)度，這兩者都基于獲得的或事先計(jì)算的校正數(shù)據(jù)。所述校正曲線可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員方便地建立。
在一種實(shí)施方案中，可以將拉曼顯微光譜學(xué)和/或熒光顯微光譜學(xué)用于檢測(cè)、分類、和/或鑒定BWAs，CWAs和非威脅化合物。顯微分散光譜學(xué)檢測(cè)、分類并且鑒定包括單一細(xì)菌的材料。對(duì)所得到的拉曼光譜進(jìn)行適當(dāng)?shù)臄?shù)字分析，可以分辯在存在非威脅性的‘掩蔽’化合物的條件下來(lái)自BWAs和CWAs的目標(biāo)微生物信號(hào)。
在另一種實(shí)施方案中，可以將熒光和拉曼放大光譜學(xué)用于檢測(cè)、分類、和/或鑒定BWAs、CWAs和非威脅性化合物。所述放大光譜學(xué)技術(shù)可以進(jìn)行BWAs和CWAs的亞微米大小的顆粒檢測(cè)、分類、鑒定(即，聚集的細(xì)菌和內(nèi)生孢子檢測(cè)和鑒定)。另外，如果采用合適的數(shù)據(jù)分析技術(shù)，熒光和拉曼放大光譜學(xué)可以在存在非威脅性‘掩蔽’化合物的條件下，對(duì)BWAs和CWAs進(jìn)行檢測(cè)、分類和鑒定。
在另一種實(shí)施方案中，在采用合適的數(shù)據(jù)分析技術(shù)時(shí)，基于拉曼光導(dǎo)纖維的光譜學(xué)可以檢測(cè)、分類和/或鑒定BWAs，CWAs和非威脅性化合物。
上述所有不同的實(shí)施方案可以采用計(jì)算機(jī)分析方法比較觀察到的光學(xué)光譜和在類似條件下獲得的已知光學(xué)光譜，以便鑒定微生物。
上述系統(tǒng)和方法是以多種方式使用的。該系統(tǒng)是作為實(shí)驗(yàn)室或可運(yùn)輸?shù)囊巴饫@微鏡使用的，它集成了分散的拉曼分光光度計(jì)和數(shù)字?jǐn)?shù)據(jù)分析模塊。該系統(tǒng)還可用作UV/Vis/NIR熒光、拉曼、或UV/Vis/NIR/Mid-IR吸收/反射低倍放大鏡(macroscope)系統(tǒng)，如ChemImage′s CONDOR低倍放大鏡系統(tǒng)。另外，該系統(tǒng)還可用作實(shí)驗(yàn)室或野外顯微鏡，如Chemlmage′s RAVEN內(nèi)窺鏡。上述用途的每一種模式是單獨(dú)使用的或者彼此組合使用，以便獲得需要的速度和結(jié)果。另外，所述大面積檢測(cè)方法的特性是能夠成比例地縮小接受研究的大范圍的尺寸，以便能夠?qū)⑺枰挠布⌒突沟眯纬删哂芯植坎蓸雍?或遙控分析能力的手持裝置。
將光譜學(xué)技術(shù)應(yīng)用在被設(shè)計(jì)用于檢測(cè)、分類、鑒定環(huán)境空氣中的BWAs、CWAs和非威脅化合物的傳感器。在

圖1中示出了這種傳感器的示意圖。通過(guò)空氣采樣泵產(chǎn)生的真空，通過(guò)樣品入口，并且通過(guò)過(guò)濾器吸出環(huán)境空氣。過(guò)濾器材料可以包括多孔聚丙烯或纖維素，是圓盤(pán)或卷筒形式的?？諝鈽悠分械念w粒物被捕獲在過(guò)濾介質(zhì)的表面上，并且保持在光譜成像系統(tǒng)的視域中。使用專門(mén)選擇用于分子光譜學(xué)類型的光源，照射大范圍的捕獲的顆粒物，并且誘導(dǎo)從所述樣品上發(fā)射拉曼光或熒光。收集發(fā)出的光線，并且重新聚焦到檢測(cè)器上，由檢測(cè)器測(cè)量一系列波長(zhǎng)的發(fā)射光，并且產(chǎn)生用于進(jìn)一步分析的數(shù)據(jù)文件。該檢測(cè)器的入口可以是成像光纖或常規(guī)光纖。將先進(jìn)的化學(xué)計(jì)量技術(shù)和已知光譜的數(shù)據(jù)庫(kù)用于檢測(cè)，分類，和/或鑒定BWAs，CWAs和非威脅化合物。
所述系統(tǒng)可以通過(guò)使用機(jī)器人技術(shù)或組合的低倍放大/顯微儀器自動(dòng)化，以便靶定BWAs，CWAs和非威脅性制劑。使用激光消融和/或化學(xué)消融方法，該系統(tǒng)還可以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，以便根除BWAs和CWAs后定向。
可以將多種數(shù)據(jù)處理方法用于該系統(tǒng)?？梢詫⒓訖?quán)光譜數(shù)據(jù)扣除常規(guī)方法用于抑制由基片或顯微鏡載玻片產(chǎn)生的影響。另外，涉及主要因素分析的多變量圖像分析，以及隨后的因素輪換可用于區(qū)分BWAs、CWAs和非威脅性“掩蔽”化合物的純的分子特征。
附圖簡(jiǎn)述圖1是基于光譜學(xué)檢測(cè)的環(huán)境空氣BWA和CWA傳感器的示意圖。
圖2表示三種不同的細(xì)菌孢子類型，包括炭疽模擬物的寬視域分散拉曼光譜。
圖3是兩種不同的細(xì)菌孢子類型的顯微成像視域熒光-光譜學(xué)。
圖4A-4Q表示由US Armed Forces Institute of Pathology(AFIP)送檢樣品的分散光譜學(xué)檢查的初步結(jié)果，專家對(duì)生物威脅檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行客觀評(píng)估。所述樣品包括六種未知粉末和一種BG孢子樣品。
圖4A表示通過(guò)管形瓶的6種未確定的粉末的分散的拉曼光譜(綠色激光激發(fā))。
圖4B表示6種未確定的粉末的分散的拉曼光譜(紅色激光激發(fā))。
圖4C-4E(樣品1331-002)表示6種未確定的粉末中第一種粉末的分散的拉曼、IR和SEM-EDS結(jié)果。所述樣品是無(wú)機(jī)樣品，并且最有可能是滑石。
圖4E-4F(樣品1325-002)表示6種未確定樣品中的第二種粉末的分散的拉曼、IR和SEM-EDS結(jié)果。所述樣品是有機(jī)的，并且最有可能是淀粉，可能是玉米淀粉。
圖4G-4H(樣品1303-002)表示6種未確定樣品中的第三種粉末的分散的拉曼、IR和SEM-EDS結(jié)果。所述樣品是有機(jī)的，并且最有可能是淀粉，可能是玉米淀粉。
圖4I-4N(樣品1291-006)表示其余未確定粉末的分散的拉曼、IR和SEM-EDS結(jié)果。在該樣品中存在三種不同類型的粉末。所有三種粉末都具有有機(jī)成分，同時(shí)三種粉末中有兩種還富含硅鋁酸鹽。所述粉末之一可能是復(fù)雜的芳香烴。
圖4O表示用作掩蔽劑的常見(jiàn)白色粉末的拉曼光譜。
圖4P表示各種芽孢桿菌屬孢子的拉曼光譜差異。
圖4Q表示寬視域拉曼圖像，其中兩種類似的孢子是根據(jù)自發(fā)熒光差異區(qū)分的。
圖5A-5F表示來(lái)自其他孢子樣品的結(jié)果，這些樣品是由于區(qū)分這些物種的固有難度而專門(mén)選擇的。它們可能包括蘇云金芽孢桿菌(BT)，蠟狀芽孢桿菌(BC)和BG。來(lái)自這三種孢子的拉曼光譜是不同的。這些差異表明了區(qū)分炭疽和非威脅物質(zhì)的很大可能。
細(xì)節(jié)為圖5A表示BT和懸浮液殘余物的原始分散拉曼光譜。所述殘余物來(lái)自所述懸浮液。
圖5B表示BT和殘余物的背景校正光譜。孢子光譜和殘余物光譜是通過(guò)顯微鏡載玻片的光譜分離的。
圖5C表示BC和懸浮液殘余物的原始分散拉曼光譜。
圖5D表示BC和殘余物的背景校正的分散光譜。
圖5E表示用顯微鏡載玻片背景校正的樣品BT，BC和BG分散光譜的匯編。所述光譜是不同的。所述差異在指紋區(qū)最大。
圖5F表示在基線扣除和對(duì)CH區(qū)光譜特征歸一化之后的三種孢子的匯編(大約2950cm-1)。
圖6表示如何將拉曼光譜用于區(qū)分單一物種中的多種不同的細(xì)菌菌株。
圖7表示如何將拉曼光譜用于區(qū)分在不同條件下生長(zhǎng)的細(xì)菌的相同的菌種和菌株。
圖8表示炭疽芽孢桿菌(炭疽)孢子的不同區(qū)域的測(cè)量的可再現(xiàn)性。
圖9表示如何將分散拉曼光譜用于區(qū)分存活的和非存活的內(nèi)生孢子，它是確定實(shí)際威脅水平的關(guān)鍵參數(shù)。
圖10表示使用這種寬視域方法通過(guò)熒光或拉曼光譜檢測(cè)獲得的S/N。通過(guò)它對(duì)檢測(cè)低濃度微生物的能力進(jìn)行定量。
圖11表示使用這種寬視域方法和我們的數(shù)字光譜分析通過(guò)分散光譜儀獲得的ROC曲線，它證實(shí)了在檢測(cè)炭疽方面的高靈敏度和選擇性。
圖12表示基于本發(fā)明的寬視域拉曼方法的手持式病原微生物檢測(cè)單元。
優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)說(shuō)明在以下被轉(zhuǎn)讓給本發(fā)明受讓人的美國(guó)專利和專利申請(qǐng)中廣泛地披露了拉曼化學(xué)成像和光譜學(xué)方法美國(guó)專利號(hào)6,002,476；美國(guó)非臨時(shí)申請(qǐng)09/619,371，申請(qǐng)日為7/19/2000；美國(guó)非臨時(shí)申請(qǐng)09/800,953，申請(qǐng)日為3/7/2001；美國(guó)非臨時(shí)申請(qǐng)09/976,391，申請(qǐng)日為10/12/2001；美國(guó)非臨時(shí)申請(qǐng)10/185,090，申請(qǐng)日為6/28/2002；美國(guó)非臨時(shí)申請(qǐng)10/184,580，申請(qǐng)日為6/28/2002；美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/144,518，申請(qǐng)日為1999年7月19日；美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/347,806，申請(qǐng)日為01/10/2002；美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/187,560，申請(qǐng)日為3/7/2000；美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/239,969，申請(qǐng)日為10/13/2000；美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/301,708，申請(qǐng)日為6/28/2001；美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/422,604，申請(qǐng)日為10/31/02。
上述專利和專利申請(qǐng)被收作本文參考，包括所引用的材料。
光譜學(xué)是對(duì)光和物質(zhì)相互作用的研究。在受到外部能源激發(fā)時(shí)，光能夠被處于電磁譜(包括γ射線，X射線，紫外線(UV)，可見(jiàn)光，紅外線，微波，和射頻照射)的特征性波長(zhǎng)(即，顏色)的物質(zhì)吸收、反射、傳輸、發(fā)射、或散射。上述特征性波長(zhǎng)隨后可以導(dǎo)致對(duì)材料元素和/或分子組成的鑒定。實(shí)驗(yàn)通常由光源、光反射元件(即，棱鏡或光柵)組成，以便產(chǎn)生光譜和檢測(cè)裝置。
在拉曼光譜學(xué)中，感興趣的光子是通過(guò)材料散射的。如果入射光是單色的(單一波長(zhǎng))，在它被用作激光光源時(shí)，小部分的散射會(huì)不同于激光的頻率(波長(zhǎng))。另外，對(duì)于所存在的分子類型來(lái)說(shuō)，散射光的頻率是獨(dú)一無(wú)二的，這種現(xiàn)象被稱作拉曼效應(yīng)。
在拉曼光譜學(xué)中，通過(guò)監(jiān)測(cè)存在于散射光中的頻率偏移，檢測(cè)分子的能量水平。典型的實(shí)驗(yàn)包括單色光源(通常是激光)，所述光源被導(dǎo)向樣品。然后會(huì)發(fā)生若干種現(xiàn)象，包括使用諸如分光光度計(jì)和電荷耦合器件(CCD)檢測(cè)器進(jìn)行監(jiān)測(cè)的拉曼散射。
與紅外光譜類似，拉曼光譜揭示了材料的分子組成，包括存在于有機(jī)和無(wú)機(jī)分子中的特殊的官能團(tuán)?？梢允褂美庠?，因?yàn)楣庾V反應(yīng)表現(xiàn)出特征性的“指紋”光譜，使它服從各種選擇規(guī)則。還可以將波峰形狀，波峰位置，和對(duì)選擇規(guī)則的順應(yīng)性用于確定分子構(gòu)像信息(晶相，有序程度，張力，粒度等)。與紅外光譜學(xué)不同，單個(gè)拉曼分光光度計(jì)可用于同時(shí)對(duì)有機(jī)和無(wú)機(jī)材料進(jìn)行分子表征。拉曼相對(duì)常規(guī)紅外光譜學(xué)的其他優(yōu)點(diǎn)包括分析水相材料的能力，和分析少有或沒(méi)有樣品制劑的材料的能力。與紅外光譜學(xué)不同，對(duì)使用拉曼光譜學(xué)的阻礙包括拉曼現(xiàn)象的相對(duì)弱的性質(zhì)，和由于熒光造成的干擾。在過(guò)去若干年中，業(yè)已將多種關(guān)鍵技術(shù)引入多種用途，這些技術(shù)使得科學(xué)家能夠在很大程度上克服拉曼光譜學(xué)所固有的問(wèn)題。所述技術(shù)包括高頻固態(tài)激光，有效的激光排斥過(guò)濾器，和硅CCD檢測(cè)器。
在熒光光譜學(xué)中，光子是在激發(fā)步驟之后從材料中發(fā)射的，其中，發(fā)生光子的吸收。實(shí)驗(yàn)通常包括多色激發(fā)光源，如水銀(Hg)或氙(Xe)燈或單色光源，如用于樣品激發(fā)的激光。然后可以將一部分發(fā)射光導(dǎo)入分散單色儀，諸如CCD的檢測(cè)器裝置連接在它上面。通過(guò)測(cè)定來(lái)自材料的熒光光譜，可以推測(cè)來(lái)自無(wú)機(jī)和有機(jī)物質(zhì)的定性和定量信息。與拉曼光譜學(xué)相比，熒光本身更靈敏。十億分之幾的檢測(cè)極限是常見(jiàn)的。另一方面，熒光比拉曼光具有更弱的選擇性，并且不是所有的化學(xué)系統(tǒng)都能發(fā)出熒光。
分子UV/可見(jiàn)和NIR吸收光譜學(xué)涉及分別通過(guò)UV/可見(jiàn)光(185-780nm(54,054-12,800cm-1)和NIR(780nm-2.5m(12,800-4,000cm-1))光譜區(qū)的光子吸收。典型的儀器包括多色光源，如氘或石英鎢鹵素?zé)?，諸如單色儀或干涉儀的分散元件，以及諸如Si CCD或InGaAs聚集平面陣列檢測(cè)器的檢測(cè)裝置。基于UV-可見(jiàn)或NIR照射的吸收測(cè)量具有多種用途，可用于對(duì)無(wú)機(jī)和有機(jī)物質(zhì)進(jìn)行定性和定量測(cè)定。NE光譜來(lái)自基本中-紅外(MIR)波段的諧波和組合波段。與熒光類似，吸收光譜學(xué)是高度敏感的，但是只具有中等的選擇性。
拉曼光譜學(xué)是多用途的技術(shù)，它十分適合對(duì)簡(jiǎn)單的和復(fù)雜的異質(zhì)材料進(jìn)行分析。光譜學(xué)分析的應(yīng)用范圍涉及分析聚合物混合物，對(duì)半導(dǎo)體進(jìn)行缺陷狀態(tài)分析，包括在人類乳腺組織中，表征腐蝕樣品和檢測(cè)分類，以及現(xiàn)在用于鑒定BWAs和CWAs。寬視域拉曼光譜學(xué)與數(shù)字光譜分析組合，提供了比其他光譜學(xué)方法和成像或′濕′化學(xué)方法成本更低或更快速獲得有關(guān)分子組成的定性和定量信息的潛在的解決方案。
寬視域拉曼光譜學(xué)和數(shù)字光譜處理分別組合了拉曼，熒光，UV/可見(jiàn)吸收/反射和NIR吸收/反射光譜學(xué)與對(duì)材料的分子特異性分析的數(shù)字加工。這使得這種技術(shù)能夠使樣品的光譜在分散的波長(zhǎng)(能量)下記錄。光譜是從樣品表面的所有點(diǎn)通過(guò)在一定波長(zhǎng)范圍內(nèi)調(diào)整拉曼分光光度計(jì)，并且間斷性地收集信號(hào)而產(chǎn)生的。根據(jù)選擇的材料和光譜學(xué)方法，還可以通過(guò)使用不同的激發(fā)波長(zhǎng)或通過(guò)于增加的聚焦平面而獲得光譜學(xué)信息。根據(jù)樣品中不同類型的物質(zhì)產(chǎn)生的相對(duì)量的拉曼散射，熒光發(fā)射，UV/可見(jiàn)吸收/反射或NIR吸收/反射，在接受研究的材料中產(chǎn)生反差。由于光譜是一次從若干種成分材料中產(chǎn)生的，將數(shù)字分析方法用于光譜數(shù)據(jù)，以便提取有可能被普通的單變量測(cè)定所忽略的相關(guān)信息，所述數(shù)字分析方法如使用相關(guān)分析，主要成分分析(PCA)和因素輪換，包括多變量曲線解析(MCR)的化學(xué)計(jì)量分析。
基于寬視域拉曼光譜學(xué)儀器的即時(shí)炭疽檢測(cè)系統(tǒng)有多種基于寬視域拉曼光譜學(xué)的即時(shí)儀器構(gòu)造能滿足關(guān)鍵的儀器要求，前面所提到所述要求是有效的即時(shí)炭疽檢測(cè)系統(tǒng)所必須的。上述構(gòu)造包括基于顯微鏡、低倍放大鏡、內(nèi)窺鏡、空氣取樣器設(shè)計(jì)或手持式設(shè)計(jì)的平臺(tái)。上述每一種構(gòu)造在下面將進(jìn)行簡(jiǎn)單地說(shuō)明。
基于顯微鏡的系統(tǒng)所述寬視域顯微-光譜學(xué)系統(tǒng)在單一平臺(tái)上組合了用于樣品激發(fā)的固態(tài)激光(僅為拉曼和激光誘導(dǎo)的熒光)，折射光學(xué)顯微鏡底座，它裝有無(wú)限校正的顯微鏡物鏡，自動(dòng)化的XYZ平移顯微鏡載物臺(tái)和石英鎢鹵素(QTH)燈和/或水銀(Hg)燈。所述顯微鏡系統(tǒng)的另一部分是模擬顏色電荷耦合器件(CCD)檢測(cè)器，用于普通光學(xué)圖像收集和分光光度計(jì)電介質(zhì)或其他帶通過(guò)濾器，和裝有用于光譜采集的CCD檢測(cè)器的光學(xué)單色器。所述光學(xué)單色器以多種形式出現(xiàn)，涉及可調(diào)過(guò)濾器，線或點(diǎn)聚焦分散元件或傅里葉變換分光光度計(jì)。還包括室溫或任選冷卻的IR FPA，用于IR圖像捕獲或熱電冷卻的(TE)Si CCD檢測(cè)器，用于UV/可見(jiàn)、和熒光光譜捕獲。使用QTH光源或其他寬帶白色光源，包括金屬鹵化物，Hg弧光燈或Xe弧光燈或使用QTH的透射光構(gòu)造，或折射光學(xué)顯微鏡平臺(tái)的其他合適的光源，將遙控的、UV、可見(jiàn)或NIR發(fā)光導(dǎo)向反射光構(gòu)造中的樣品。在拉曼或激光誘導(dǎo)的熒光實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)使用拉曼發(fā)光器將激光照射導(dǎo)入樣品。通過(guò)無(wú)限校正的顯微鏡物鏡收集來(lái)自放置在自動(dòng)化XYZ平移顯微鏡載物臺(tái)上的樣品的散射、發(fā)射、反射或透射光。在每一種照射方案中，選擇照射的寬視域，以便優(yōu)化接受研究的樣品的質(zhì)量和可靠性以及完整性。
發(fā)射的普通光學(xué)圖像可以使用插入顯微鏡鉆臺(tái)輪中的鏡子或分光器或棱鏡結(jié)構(gòu)獲得，并且通過(guò)模擬或數(shù)字顏色或單色電荷耦合器件(CCD)或CMOS檢測(cè)器采集圖像?？梢栽趯挼囊曈?區(qū)域內(nèi)獲得完整的光譜，或者通過(guò)成像分光光度計(jì)連接放大的光學(xué)圖像，并且收集在NIR或中-IR聚焦平面陣列(FPA)檢測(cè)器(用于IR光譜成像)或SiCCD檢測(cè)器(用于UV/可見(jiàn)吸收/反射、熒光和拉曼光譜成像)。IR FPA通常包括砷化銦鎵(InGaAs)，不過(guò)，可以包括其他IR敏感材料，包括硅化鉑(PtSi)，銻化銦(InSb)或碲化汞鎘(HgCdTe)。
將中央處理器，通常是奔騰計(jì)算機(jī)用于光譜學(xué)強(qiáng)度與波長(zhǎng)收集和處理。用商業(yè)化軟件，如與ChemAnalyze(ChemImage Corporation.)組合的ChemAcquire(ChemImage Corporation)操縱模擬顏色CCD、IR FPA和/或Si CCD、通過(guò)控制器控制的自動(dòng)化XYZ平移顯微鏡載物臺(tái)和液晶或其他成像光譜儀(通過(guò)合適的成像分光光度計(jì)控制器)。
還可以使用以下類型的分光光度計(jì)固定的濾器分光光度計(jì)；基于光柵的分光光度計(jì)；傅里葉變換分光光度計(jì)；或聲-光分光光度計(jì)。不依賴于極化的干涉儀如Michelson干涉儀；Sagnac干涉儀；Twynam-Green干涉儀；Mach-Zehnder干涉儀，可以用作過(guò)濾器。優(yōu)選能夠進(jìn)行小規(guī)模光學(xué)標(biāo)度的分光光度計(jì)設(shè)計(jì)，以便能夠獲得便攜性更好的野外使用的裝置。
可以將寬視域光譜學(xué)方法用于厚度測(cè)量，這是通過(guò)沿軸向Z方向的焦點(diǎn)移動(dòng)樣品，在聚焦平面上和聚焦平面外收集數(shù)據(jù)，并且在軟件中重建樣品的容量譜。對(duì)于具有某種體積的樣品(填充材料，表面，界面，間相)來(lái)說(shuō)，業(yè)已證實(shí)測(cè)定容量的光譜成像可用于故障分析，產(chǎn)品開(kāi)發(fā)和常規(guī)質(zhì)量監(jiān)測(cè)。還存在同時(shí)進(jìn)行定量分析和厚度分析的潛力。還能夠以非接觸方式進(jìn)行容量的成像，不需要通過(guò)使用數(shù)字共聚焦技術(shù)改變樣品，所述技術(shù)需要在分散的聚焦平面上進(jìn)行測(cè)量。對(duì)所得到的光譜分布圖進(jìn)行處理，重建，和顯現(xiàn)。業(yè)已證實(shí)了基于多種策略的計(jì)算性光學(xué)截面重建技術(shù)，包括最近鄰分析法和迭代解卷積法。
基于顯微鏡的寬視域光譜學(xué)系統(tǒng)具有例如能夠?qū)我患?xì)菌的BWAs進(jìn)行檢測(cè)，分類，鑒定和觀察的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)。該系統(tǒng)推廣的光譜分辨率在8cm-1的數(shù)量級(jí)，并且空間厚度分辨為大約200nm，采用數(shù)字解卷積法。
基于低倍放大鏡的系統(tǒng)寬視域低倍放大鏡-光譜學(xué)系統(tǒng)將照射組件組合在單個(gè)平臺(tái)上，所述組件由照射光源(通常為QTH，Xe，Hg或其他金屬鹵素?zé)?，屏障濾光器和光導(dǎo)向模塊(即，定向光束，光學(xué)纖維或液體光導(dǎo)照射)組成。將模擬顏色電荷耦合器件(CCD)檢測(cè)器用于普通的光學(xué)和數(shù)字圖像采集。拉曼波長(zhǎng)選擇是使用成像或非-成像分光光度計(jì)進(jìn)行的。所述檢測(cè)器是室溫或任選冷卻的NIR FPA，用于NIR圖像捕獲，或熱電冷卻的(TE)Si CCD檢測(cè)器，用于UV/可見(jiàn)和熒光圖像捕獲。
在反射光構(gòu)造中，使用QTH光源或其他寬帶白色光源，包括金屬鹵化物，Hg弧光燈或Xe弧光燈或透射光構(gòu)造，或使用QTH或其他合適的光源，通過(guò)直接照射、光學(xué)纖維或液體光導(dǎo)，將UV、可見(jiàn)或NIR照射導(dǎo)向樣品。通過(guò)大鏡頭采集放置在低倍放大鏡樣品底座上的樣品的發(fā)射，反射，或透射光。
樣品的普通光學(xué)圖像可以使用插入低倍放大鏡收集疊層的鏡子或分光器或棱鏡結(jié)構(gòu)獲得，并且使用模擬或數(shù)字顏色或單色電荷耦合器件(CCD)或CMOS檢測(cè)器采集圖像。在拉曼光譜學(xué)模式下，通過(guò)成像或非-成像光譜儀獲得光譜學(xué)信息。還可用于補(bǔ)充它的是聚焦平面陣列(FPA)檢測(cè)器(用于NIR光譜成像)或Si CCD檢測(cè)器(用于UV/可見(jiàn)吸收/反射、熒光和拉曼光譜成像)。NIR FPA通常包括砷化銦鎵(InGaAs)，不過(guò)，可以包括其他NIR敏感材料，包括硅化鉑(PtSi)，銻化銦(InSb)或碲化汞鎘(HgCdTe)。
將中央處理器，通常是奔騰計(jì)算機(jī)用于光譜學(xué)強(qiáng)度與波長(zhǎng)收集和處理。用商業(yè)化軟件，如與ChemAnalyze(ChemImage Corporation.)組合的ChemAcquire(ChemImage Corporation)操縱模擬顏色CCD、NIR FPA和/或Si CCD和液晶或其他成像光譜儀(通過(guò)合適的成像分光光度計(jì)控制器)。
基于低倍放大鏡的系統(tǒng)的使用具有能夠在甚至更大范圍內(nèi)對(duì)潛在的BWAs和CWAs進(jìn)行快速檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)。以前的研究業(yè)已證實(shí)了使用低倍放大鏡系統(tǒng)對(duì)200mm半導(dǎo)體晶片上的0.01mm圖像缺損進(jìn)行檢測(cè)的能力。
基于內(nèi)窺鏡的系統(tǒng)拉曼光譜學(xué)在很大程度上是在實(shí)驗(yàn)室設(shè)置中進(jìn)行的，使用研究級(jí)光學(xué)顯微鏡技術(shù)作為圖像采集平臺(tái)。不過(guò)，拉曼光譜學(xué)還可用于原位工業(yè)加工監(jiān)測(cè)和體內(nèi)臨床分析。工業(yè)和臨床設(shè)置通常需要緊湊的，重量輕的儀器，適合在常規(guī)光譜學(xué)裝置無(wú)法接近的遙遠(yuǎn)區(qū)域進(jìn)行檢查。
業(yè)已開(kāi)發(fā)出了具有數(shù)字分析能力的可靠的寬視域光譜學(xué)系統(tǒng)。與這種光譜學(xué)系統(tǒng)集成的成像內(nèi)窺鏡提供了具有光譜分析的實(shí)時(shí)視頻檢查能力。所述內(nèi)窺鏡與視頻CCD結(jié)合，用于對(duì)分析區(qū)域進(jìn)行實(shí)時(shí)視頻成像。這使得能夠?qū)悠愤M(jìn)行快速肉眼篩選。業(yè)已將內(nèi)窺鏡頂端工程改造成過(guò)濾激光照射并且采集拉曼散射和熒光發(fā)射(用于拉曼和熒光用途)。對(duì)來(lái)自激光輸送纖維的光進(jìn)行過(guò)濾，以便在樣品中只存在激光波長(zhǎng)。將所述激光從采集的光中除掉，以便拉曼信息在激光曲線的200cm-1的范圍內(nèi)是可見(jiàn)的。拉曼內(nèi)窺鏡的遠(yuǎn)端是對(duì)環(huán)境具有抵抗能力的，并且能夠承受在高溫下連續(xù)工作，并且業(yè)已證實(shí)了能夠在0-315℃下工作，同時(shí)保持高的信號(hào)與背景(S/B)性能。所述遠(yuǎn)端可以與基于顯微鏡的系統(tǒng)結(jié)合，以便能夠遙控進(jìn)行分散光譜學(xué)和光譜成像。
基于內(nèi)窺鏡的寬視域拉曼光譜學(xué)系統(tǒng)的使用，具有能夠在諸如盒子或信封內(nèi)的遙遠(yuǎn)區(qū)域檢測(cè)懷疑的BWAs和CWAs的優(yōu)點(diǎn)。
環(huán)境空氣傳感器系統(tǒng)環(huán)境空氣傳感器系統(tǒng)由兩部分，即采樣系統(tǒng)和光譜成像系統(tǒng)組成。采樣系統(tǒng)的關(guān)鍵是光學(xué)模塊，在圖1中示意性地示出。該模塊必須支撐一部分過(guò)濾介質(zhì)并且在采樣區(qū)域周?chē)峁┝送耆目諝饷芊?。該模塊還必須便于打開(kāi)，以便可以將新的過(guò)濾器(分散過(guò)濾器)或新的過(guò)濾器部分(連續(xù)過(guò)濾器)放入采樣/光學(xué)通道。
所述采樣系統(tǒng)具有入口，該入口是通向要檢測(cè)的大氣的。對(duì)它的尺寸進(jìn)行優(yōu)化，以便適應(yīng)采樣流速和預(yù)期的粒度范圍。對(duì)于顆粒或氣溶膠采樣來(lái)說(shuō)，重要的是，所述入口沒(méi)有銳彎或低線性速度區(qū)域，這些區(qū)域可能導(dǎo)致顆粒物在收集過(guò)濾器之前沉降。所述采樣系統(tǒng)還具有采樣泵，提供真空，以便通過(guò)過(guò)濾器抽環(huán)境空氣。預(yù)期的流速在0.5-2.0L/分鐘范圍內(nèi)，并且預(yù)期的真空為100-H2O(180mm-Hg)范圍內(nèi)。
采樣系統(tǒng)通常不是連續(xù)運(yùn)行的，而是以一系列不連續(xù)的采樣周期運(yùn)行的。在每一個(gè)周期結(jié)束時(shí)，可能必須更換過(guò)濾介質(zhì)。這一目的可以通過(guò)操作者完成或自動(dòng)地完成。為了進(jìn)行連續(xù)采樣，過(guò)濾介質(zhì)可以是帶樣構(gòu)型，并且可以通過(guò)類似于盒式錄音磁帶的帶傳送機(jī)制將過(guò)濾器的新的樣品放置在光學(xué)模塊上。
一旦顆粒物被捕捉在過(guò)濾介質(zhì)上，利用寬視域光譜學(xué)檢測(cè)存在的BWA或CWA，并且進(jìn)行分類。如果激發(fā)光源是使用常規(guī)或光學(xué)纖維與所述光學(xué)模塊連接的激光(它的光是在整個(gè)采樣區(qū)域均勻地分布的)，可以使用拉曼成像。在另一種構(gòu)造中，可以使用包括寬帶UV/Vis，過(guò)濾的UV/Vis，或UV/Vis激光的光源激發(fā)自發(fā)熒光。所述成像器可以是液晶可調(diào)類型的或其他成像分光光度計(jì)類型，正如以前所披露的，CCD或其他陣列照相機(jī)可用于對(duì)多種波長(zhǎng)的采樣區(qū)域進(jìn)行成像。檢測(cè)器與光學(xué)模塊的連接可以通過(guò)基于纖維的或常規(guī)光學(xué)元件完成。使用化學(xué)計(jì)量學(xué)和圖像分析工具，如存在于ChemAnalyze軟件(ChemImageCorporation)中的那些，處理所述檢測(cè)器數(shù)據(jù)。
這種類型的環(huán)境空氣監(jiān)測(cè)器的典型的操作模式通常是一系列的采樣周期，在此期間，定期進(jìn)行光譜學(xué)圖像測(cè)量。通過(guò)系統(tǒng)計(jì)算機(jī)分析來(lái)自以前的和當(dāng)前的采樣周期的結(jié)果，所述計(jì)算機(jī)能夠顯示結(jié)果，并且啟動(dòng)報(bào)警和危險(xiǎn)警報(bào)，或啟動(dòng)某些動(dòng)作，如關(guān)閉建筑物外部進(jìn)風(fēng)口。
手持式生物威脅檢測(cè)器現(xiàn)有的基于光譜學(xué)的生物威脅檢測(cè)系統(tǒng)在尺寸和重量上受到產(chǎn)生并聚焦照射、采集發(fā)射光或散射光、以及進(jìn)行所需要的光譜分析的所需各個(gè)組件的限制。檢測(cè)病原微生物的寬視域方法的優(yōu)點(diǎn)之一是該方法的簡(jiǎn)單性，允許對(duì)激發(fā)和檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行設(shè)計(jì)、配置和集成。
該方法的功能和結(jié)構(gòu)要求，允許實(shí)現(xiàn)若干可小型化的部件，而又沒(méi)有顯著的性能降低或限制。例如，能夠設(shè)計(jì)包括波長(zhǎng)可調(diào)過(guò)濾器或MOEMS裝配的波長(zhǎng)分散元件的低成本緊湊分光光度計(jì)，并且以足夠的分辨率裝配，以便檢測(cè)由被研究的標(biāo)本發(fā)射的光譜成分。工作像素CMOS CCD檢測(cè)器或雪崩式光電二極管的發(fā)展，同樣使得能夠用小的緊湊傳感器檢測(cè)所得到的光譜特征并進(jìn)行空間解析。這種可縮放的光學(xué)元件與這種寬視域方法的有效使用，使得它能夠?qū)⑦@種檢測(cè)系統(tǒng)的總體尺寸和重量按比例地縮小，從而能夠生產(chǎn)出便攜式手持裝置。
結(jié)果使用傳統(tǒng)光譜學(xué)方法產(chǎn)生的光譜能夠有效地揭示有關(guān)BWAs和CWAs的分子特征的大量的信息。目前所述的寬視域光譜學(xué)使得這種分析更可行和可靠，甚至在必要時(shí)能夠檢測(cè)存在的單個(gè)細(xì)菌。它還使得能夠用于在存在非威脅′掩蔽′劑的情況下鑒定細(xì)菌孢子，并且體現(xiàn)在檢測(cè)和鑒定BWAs和CWAs時(shí)的關(guān)鍵的組織。在試圖分辨來(lái)自不同的細(xì)菌菌種的孢子時(shí)存在困難。圖2表示三種不同細(xì)菌孢子類型的分散寬視域拉曼光譜。盡管存在遺傳學(xué)和形態(tài)學(xué)相似性，業(yè)已將寬視域拉曼光譜學(xué)用于充分地分辨不同的細(xì)菌孢子。
圖3表示如何將通過(guò)成像分光光度計(jì)獲得的寬視域熒光光譜成像用于分辨不同類型的細(xì)菌孢子。附圖中下面部分的熒光光譜是從上面的濃縮熒光光譜圖像的顏色編碼的加方框的區(qū)域獲得的?？梢钥闯?，枯草桿菌孢子和短小芽胞桿菌孢子分別在540和630nm波長(zhǎng)下表現(xiàn)出熒光波峰。
圖4表示對(duì)由US Armed Forces Institute of Pathology(AFIP)提供的未確定的樣品進(jìn)行快速寬視域光譜學(xué)檢查的結(jié)果。所述樣品包括四個(gè)樣品，包括六種未知的粉末和BG孢子樣品。
圖4A表示通過(guò)管形瓶的6種未確定的粉末的寬視域拉曼光譜(綠色激光激發(fā))。
圖4B表示6種未確定的粉末的寬視域拉曼光譜(紅色激光激發(fā))。
圖4C-4D(樣品1331-002)表示6種未確定的粉末中的第一種樣品的寬視域拉曼、IR和SEM-EDS結(jié)果。所述樣品是無(wú)機(jī)的，并且極有可能是滑石。
圖4E-4F(樣品1325-002)表示6種未確定的粉末中的第二種樣品的寬視域拉曼、IR和SEM-EDS結(jié)果。所述樣品是有機(jī)樣品，并且極有可能是淀粉，可能是玉米淀粉。
圖4G-4H(樣品1303-002)表示6種未確定的粉末中的第三種樣品的寬視域拉曼、IR和SEM-EDS結(jié)果。所述樣品是有機(jī)樣品，并且極有可能是淀粉，可能是玉米淀粉。
圖4I-4N(樣品1291-006)表示其余未確定的粉末的寬視域拉曼、IR和SEM-EDS結(jié)果。在該樣品中存在三種不同類型的粉末。所有三種粉末都具有有機(jī)成分，同時(shí)三種粉末中有兩種還富含硅鋁酸鹽。所述粉末之一可能是復(fù)雜的芳香烴。
圖4O表示兩種普通白色粉末的寬視域拉曼光譜和圖像，這兩種粉末通過(guò)拉曼化學(xué)成像能夠方便地區(qū)分。
圖4P表示樣品BG孢子與通過(guò)商業(yè)渠道獲得的BG孢子的寬視域拉曼光譜的比較。同樣示出了兩種樣品的混合物的拉曼光譜。拉曼光譜表明，所述樣品是相似的，幾乎相同的。
圖4Q表示寬視域拉曼圖像，其中兩種類似的孢子是根據(jù)自發(fā)熒光差異區(qū)分的。
圖5表示來(lái)自其他孢子樣品的結(jié)果，所述樣品是因?yàn)閰^(qū)分這些菌種的固有的難度而專門(mén)選擇的。這些菌種包括蘇云金芽孢桿菌(BT)，蠟狀芽孢桿菌(BC)和BG。來(lái)自3種孢子的寬視域拉曼光譜是不同的。以上差異表明了，對(duì)區(qū)分炭疽和非威脅物質(zhì)的良好的改善。細(xì)節(jié)如下圖5A表示BT和懸浮液殘余物的原始寬視域拉曼光譜。所述殘余物來(lái)自懸浮液。
圖5B表示BT和殘余物的背景校正寬視域光譜。業(yè)已通過(guò)顯微鏡載玻片的光譜分開(kāi)了孢子光譜和殘余物光譜。
圖5C表示BC和懸浮液殘余物的原始拉曼光譜。
圖5D表示BC和懸浮液殘余物的背景校正光譜。
圖5E表示樣品BT，BC和BG光譜與顯微鏡載玻片背景校正的匯編。所述光譜是不同的。所述差異在指紋區(qū)最大。
圖5F表示在基線扣除之后3種孢子的匯編，和對(duì)CH區(qū)光譜特征(約2950cm-1)的歸一化。
圖6表示如何將寬視域拉曼光譜學(xué)應(yīng)用于區(qū)分同一菌種內(nèi)的多種不同的細(xì)菌菌株。
圖7表示如何將寬視域拉曼光譜學(xué)應(yīng)用于在不同條件下區(qū)分在不同條件下生長(zhǎng)的相同菌種和細(xì)菌菌株。
圖8表示感興趣的炭疽芽孢桿菌(炭疽)孢子的寬視域拉曼光譜學(xué)的各個(gè)區(qū)域，和可再現(xiàn)性地區(qū)分類似材料的能力。
圖9表示如何將寬視域拉曼光譜學(xué)用于區(qū)分存活的和未存活的內(nèi)生孢子，它是決定實(shí)際威脅水平的關(guān)鍵參數(shù)。
圖10表示作為存在的孢子的函數(shù)的寬視域熒光和拉曼信噪比，以及該方法的總的靈敏度。
圖11表示寬視域拉曼光譜學(xué)結(jié)果的ROC分析，示出了該方法區(qū)分炭疽和其他模擬物的特異性。
圖12表示手持式病原微生物檢測(cè)單元，它能測(cè)量大約6英寸×3英寸×1英寸的面積，并且是基于寬視域拉曼方法的。這種特殊單元具有疊層的或組件式功能層，包括包含顯示器和用戶界面的頂層，容納發(fā)光器，分光光度計(jì)，傳感器和控制電子元件的中間層，以及支持采樣模塊的下層。每一層都可以改變，以便滿足特殊需要和功能要求。例如，所述采樣模塊可以針對(duì)不同環(huán)境中的病原體采樣而不同，并且是以環(huán)境空氣監(jiān)測(cè)或表面檢測(cè)模式示出的。該下部采樣模塊還可以更換成其他形式，以便采集各種流體，如水或血液中的病原體。
業(yè)已將炭疽孢子應(yīng)用于在可靠的生物危害實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行寬視域拉曼分析(圖8)。業(yè)已通過(guò)寬視域拉曼方法區(qū)分了不同的炭疽孢子的菌株(圖6)。另外，業(yè)已將寬視域拉曼光譜學(xué)用于區(qū)分在不同環(huán)境條件下和/或生長(zhǎng)培養(yǎng)基生長(zhǎng)的相同的菌種和菌株(圖7)。這種能力可用于研究目的。并且，業(yè)已將寬視域拉曼光譜學(xué)用于區(qū)分存活的和未存活的內(nèi)生孢子(圖9)。懷疑的孢子的存活力是決定構(gòu)成實(shí)際威脅的關(guān)鍵參數(shù)。
本發(fā)明人期望以下病原微生物可以通過(guò)寬視域拉曼方法和所得到的光譜分布圖進(jìn)行菌種、菌株和存活力的檢測(cè)和分類cryptosporidia；大腸桿菌；瘟疫(鼠疫耶爾森氏菌；天花(重型天花)；野兔熱(土拉熱弗朗西斯氏菌；布魯氏菌病(布魯氏菌；產(chǎn)氣莢膜梭菌；鼻疽(鼻疽伯克氏菌；類鼻疽(類鼻疽伯克氏菌；鸚鵡熱(鸚鵡熱衣原體；Q熱(伯氏考克斯氏體；斑疹傷寒(普氏立克次氏體；弧菌；賈第鞭毛蟲(chóng)；白色假絲酵母；糞腸球菌；表皮葡萄球菌；金黃色葡萄球菌；產(chǎn)氣腸桿菌；白喉棒狀桿菌；綠膿假單胞菌；醋酸鈣不動(dòng)桿菌；肺炎克雷伯氏菌；粘質(zhì)沙雷氏菌；線狀病毒(如埃博拉和馬爾堡病毒)，naviruses病毒(如拉薩熱和Machupo病毒)和甲病毒(如委內(nèi)瑞拉馬腦炎，東方馬腦炎，和西方馬腦炎)。
先進(jìn)的光譜分析和化學(xué)計(jì)量學(xué)工具利用拉曼或熒光光譜的差異而鑒定菌種，如圖11所示?？梢詫㈩愃品椒ㄓ糜诮D像，包括依次從接受研究的基片表面的至少兩個(gè)不同區(qū)域獲得光譜的圖像。以下是用于進(jìn)行這種分析的典型的算法1)通過(guò)背景圖象(在沒(méi)有樣品的條件下獲得)劃分原始圖像
2)被所得到的圖像進(jìn)行大范圍過(guò)濾(對(duì)像素進(jìn)行中等過(guò)濾，它的值與局部相鄰的區(qū)域的平均值顯著不同)3)利用排列方法校正在數(shù)據(jù)采集期間樣品的輕微運(yùn)動(dòng)4)采用空間平均過(guò)濾器5)進(jìn)行光譜歸一化(有助于糾正通過(guò)樣品的變化的照射)6)對(duì)每一組的三個(gè)光譜點(diǎn)進(jìn)行光譜運(yùn)行平均7)提取相當(dāng)于550-620nm的一組圖象。在該范圍內(nèi)，兩種細(xì)菌孢子(枯草芽孢桿菌黑色變種和短小芽胞桿菌)的光譜大體上是線性的?？莶菅挎邨U菌黑色變種具有正的斜率，而短小芽胞桿菌具有負(fù)的斜率。
8)建立單幀圖像，其中，每一個(gè)強(qiáng)度值是光譜亞區(qū)的斜率(從最后的圖像)。所述斜率是通過(guò)最小二乘法擬合確定的。
9)放大0-4095之間的所得到的圖像，保持從0→4095的點(diǎn)的軌跡，它相當(dāng)于先前圖像中的0(″零點(diǎn)″)。
10)根據(jù)下面一系列步驟產(chǎn)生掩蔽圖像a)根據(jù)排列的圖像(第三個(gè)步驟)計(jì)算單幀“最亮”圖像，其中，每一個(gè)像素的強(qiáng)度是每一種光譜的最大強(qiáng)度值。
b)對(duì)0-4095之間的最亮的圖像進(jìn)行標(biāo)度。
c)根據(jù)所述標(biāo)度的圖像產(chǎn)生二進(jìn)制圖像，其中，將強(qiáng)度大于900的每一個(gè)像素在新的圖像中設(shè)定為1，并且將強(qiáng)度小于900的每一個(gè)像素在新的圖像中設(shè)定為0。900的值是通過(guò)檢查與標(biāo)度的圖像相關(guān)的直方圖選擇的。所述算法的未來(lái)的改進(jìn)是通過(guò)對(duì)特定圖像的直方圖進(jìn)行數(shù)字分析自動(dòng)選擇閾值。
11)通過(guò)來(lái)自步驟10的掩蔽圖像倍增來(lái)自步驟9的標(biāo)度的影像。這將視覺(jué)顯示僅局限于相當(dāng)于孢子的區(qū)域。所述結(jié)果是灰色標(biāo)尺圖像，其中，在步驟9中確定的低于零點(diǎn)的強(qiáng)度相當(dāng)于短小芽胞桿菌，而高于零點(diǎn)的強(qiáng)度值相當(dāng)于枯草芽孢桿菌黑色變種。
12)然后通過(guò)將所有的″負(fù)″值設(shè)定為紅色，將所有的″正″值設(shè)定為綠色產(chǎn)生最終的RGB圖像。
應(yīng)用存在對(duì)光譜學(xué)和數(shù)字分析系統(tǒng)的巨大需求，該系統(tǒng)能夠提供對(duì)BWAs和CWAs的高處理量，非接觸，實(shí)時(shí)檢測(cè)，分類和鑒定，具有高的精確性，并且需要有限的或不需要樣品制備。適合對(duì)BWAs和CWAs進(jìn)行客觀評(píng)估的儀器的用戶基礎(chǔ)包括有害材料(HAZMAT)工作組；政府和私人機(jī)構(gòu)，在這里存在較高的潛在威脅，郵件處理機(jī)構(gòu)，學(xué)術(shù)機(jī)構(gòu)，工業(yè)和醫(yī)學(xué)研究實(shí)驗(yàn)室等。
對(duì)即時(shí)炭疽或其他微生物威脅檢測(cè)系統(tǒng)的目標(biāo)用戶的好處是明顯的。在低倍放大鏡形式的技術(shù)中，可以利用光譜成像對(duì)懷疑有BWAs和CWAs的大的區(qū)域進(jìn)行快速評(píng)估，這種評(píng)估是基于它們的熒光，NIR和/或UV/可見(jiàn)光反應(yīng)。在顯微鏡模式下，可以進(jìn)行懷疑的BWAs和CWAs的陽(yáng)性檢測(cè)、分類、鑒定和觀察。在內(nèi)窺鏡模式下，可以對(duì)BWAs和CWAs進(jìn)行遙控檢測(cè)、分類、鑒定和觀察。在FAST模式下，可以在遠(yuǎn)處對(duì)BWAs和CWAs進(jìn)行檢測(cè)、分類、鑒定和觀察或在顯微鏡下進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)。對(duì)于空氣取樣器結(jié)構(gòu)來(lái)說(shuō)，可以對(duì)BWAs和CWAs進(jìn)行明確的檢測(cè)。
在以組合方式進(jìn)行時(shí)，有可能增強(qiáng)表征BWAs和CWAs的效果。優(yōu)點(diǎn)包括，但不局限于以下所列舉的·快速大面積篩選，以便檢測(cè)懷疑的BWAs和CWAs。
·懷疑的BWAs和CWAs的陽(yáng)性檢測(cè)，分類，鑒定和觀察。
·無(wú)接觸·需要有限的或不需要樣品制備。
·懷疑的BWAs和CWAs的遙控檢測(cè)，分類，鑒定和觀察。
·對(duì)固體或氣體樣品中懷疑的BWAs和CWAs的實(shí)時(shí)檢測(cè)，分類，鑒定和觀察。
用于即時(shí)炭疽檢測(cè)的寬視域成像和光譜學(xué)系統(tǒng)的具體用途包括以下所列舉的·分辨威脅和非威脅′掩蔽′劑·BWAs和CWAs的空間分布·低到單個(gè)細(xì)菌孢子的BWAs和CWAs的空間分布相對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)檢測(cè)BWAs和CWAs的傳統(tǒng)方法包括接種方法，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)方法，生物威脅報(bào)警(BTA)檢測(cè)條，基于DNA的檢測(cè)，DNA芯片分析和質(zhì)譜分析。接種方法涉及將懷疑的培養(yǎng)物或標(biāo)本接種到動(dòng)物體內(nèi)，然后觀察疾病的發(fā)展。除了動(dòng)物殘酷問(wèn)題之外，這些方法存在的缺陷包括需要大量時(shí)間達(dá)到檢測(cè)點(diǎn)。
ELISA測(cè)驗(yàn)涉及抗體檢測(cè)。該技術(shù)同樣是緩慢的，并且存在高假陽(yáng)性(不相關(guān)的抗體與抗原非特異性性反應(yīng))和較差的，高假陰性(存在于血液中的干擾化合物或濃度不足以檢測(cè)的抗體)。另外，患者可以在患者恢復(fù)之后長(zhǎng)時(shí)間檢測(cè)出抗體是陽(yáng)性的。
BTA檢測(cè)條是小的塑料裝置，它的作用與家庭妊娠試驗(yàn)非常類似。所述檢測(cè)條包括特異性抗體，它能改變檢測(cè)條的顏色，表明生物威脅制劑的存在。陰性結(jié)果意味著在所述檢測(cè)條的檢測(cè)極限內(nèi)不存在生物威脅劑。盡管結(jié)果能夠在較短的時(shí)間(15分鐘)內(nèi)獲得，假陰性和假陽(yáng)性的幾率很高。
基于DNA的檢測(cè)通過(guò)識(shí)別它們的遺傳序列檢測(cè)各種物質(zhì)。盡管比BTA檢測(cè)條更靈敏，基于DNA的檢測(cè)更容易受掩蔽劑的影響，并且涉及長(zhǎng)的分析時(shí)間。DNA芯片分析涉及將DNA鏈固定在Si或玻璃晶片芯片上。DNA能夠結(jié)合或者與雜交于檢測(cè)樣品中的互補(bǔ)的DNA鏈。特別設(shè)計(jì)的顯微鏡能夠檢測(cè)DNA在何處雜交。擴(kuò)增是通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)完成的。據(jù)報(bào)道生物威脅劑的檢測(cè)可以在數(shù)分鐘內(nèi)完成。
基于DNA的方法的限制是雙倍的。首先，將DNA方法設(shè)計(jì)成能通過(guò)它的獨(dú)特的DNA序列檢測(cè)特殊的威脅劑。因此，每一次DNA檢測(cè)對(duì)一種物質(zhì)是專一的，如果需要檢測(cè)其他物質(zhì)，必須開(kāi)發(fā)其他的檢測(cè)試劑。第二種限制涉及由于環(huán)境污染造成的假陰性和假陽(yáng)性問(wèn)題。眾所周知的是，DNA檢測(cè)在″現(xiàn)實(shí)世界″樣品中產(chǎn)生正確結(jié)果中存在問(wèn)題。
當(dāng)細(xì)胞或孢子在高真空下進(jìn)行離子化處理以便鑒定生物體，質(zhì)譜分析(MS)利用了大量片段模式。它具有能夠進(jìn)行非常靈敏的檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，但是需要復(fù)雜的采樣系統(tǒng)，以便將代表性的樣品輸入到離子發(fā)生器。MS的主要限制是它需要使用高真空泵，這種泵本身是精密的和昂貴的。其他的限制是，與光譜學(xué)化學(xué)成像相比，它是一種破壞性的技術(shù)，而化學(xué)成像是完全無(wú)破壞性的技術(shù)。
其他技術(shù)/機(jī)會(huì)包括基于顯微-光譜學(xué)方法的顯微-探頭或顯微鏡方法，包括拉曼，熒光，NIR等，用于對(duì)BWAs和CWAs進(jìn)行快速，非接觸和精確檢測(cè)。這些類型的工具提供了在局部或遙遠(yuǎn)環(huán)境中存在其他BWAs，CWAs和/或非威脅′掩蔽′劑的條件下對(duì)BWAs和CWAs的分布進(jìn)行檢測(cè)，分類，鑒定和觀察的能力，所述特征是傳統(tǒng)方法不能提供的。所述工具能夠大大降低假陽(yáng)性和假陰性的可能性，并且提供了能夠在幾分鐘內(nèi)確定是否存在真正的生物威脅的方法。
其他基于光譜學(xué)的方法能夠與上述方法競(jìng)爭(zhēng)的光譜學(xué)技術(shù)包括紅外(IR)光譜學(xué)。IR光譜學(xué)由于在IR中強(qiáng)的水吸收導(dǎo)致的困難而無(wú)法競(jìng)爭(zhēng)。因此，BWA IR光譜可能具有非常強(qiáng)的水信號(hào)。
很顯然，在閱讀以上說(shuō)明之后，可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行很多改進(jìn)和改變。因此，應(yīng)當(dāng)理解的是，在所附權(quán)利要求書(shū)的范圍內(nèi)，本發(fā)明能夠以除了具體所述方式以外的形式實(shí)施。
權(quán)利要求
1.一種用于研究炭疽(炭疽芽孢桿菌)在基片上的存在的方法，包括a)從所述基片的表面上選擇第一區(qū)域，所述第一區(qū)域大到足以包括少量炭疽生物，b)在所述第一區(qū)域內(nèi)選擇寬視域，用于進(jìn)一步研究，然后c)用足夠的能量照射寬視域加上所述寬視域周?chē)膮^(qū)域，以便對(duì)所述照射區(qū)域進(jìn)行光致褪色，d)收集來(lái)自所述寬視域的拉曼偏移光，e)分析所述拉曼偏移光中的炭疽微生物的特征性分布圖。
2.如權(quán)利要求1的方法，還包括在第二區(qū)域重復(fù)步驟a)-e)。
3.如權(quán)利要求1的方法，其中，所述分析步驟包括分析炭疽微生物的菌株。
4.如權(quán)利要求1的方法，其中，所述分析步驟包括分析炭疽微生物的存活力。
5.如權(quán)利要求1的方法，其中，所述分析步驟包括分析炭疽微生物業(yè)已在其中生長(zhǎng)的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。
6.一種用于研究病原微生物在基片上的存在的方法，包括a)從所述基片的表面上選擇第一區(qū)域，所述第一區(qū)域大到足以包括少量病原微生物，b)在所述第一區(qū)域內(nèi)選擇寬視域，用于進(jìn)一步研究，然后c)用足夠的能量照射所述寬視域加上所述寬視域周?chē)膮^(qū)域，以便對(duì)所述照射區(qū)域進(jìn)行光致褪色，d)收集來(lái)自所述寬視域的拉曼偏移光，e)分析所述拉曼偏移光中的病原微生物的特征性分布圖。
7.如權(quán)利要求6的方法，還包括在第二區(qū)域重復(fù)步驟a)-e)。
8.如權(quán)利要求6的方法，其中，所述分析步驟包括分析所述病原微生物的菌株。
9.如權(quán)利要求6的方法，其中，所述分析步驟包括分析所述病原微生物的存活力。
10.如權(quán)利要求6的方法，其中，所述分析步驟包括分析其中業(yè)已生長(zhǎng)了病原微生物的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。
11.如權(quán)利要求6的方法，其中，來(lái)自所述寬視域的拉曼偏移光穿過(guò)點(diǎn)、線或圖像聚焦型的分光光度計(jì)。
12.如權(quán)利要求6的方法，其中，所述病原微生物是炭疽孢子。
13.如權(quán)利要求6的方法，其中，所述病原微生物是原生動(dòng)物。
14.如權(quán)利要求6的方法，其中，所述病原微生物是cryptosporidia微生物。
15.如權(quán)利要求6的方法，其中，所述病原微生物是大腸桿菌微生物。
16.如權(quán)利要求6的方法，其中，所述病原微生物是大腸桿菌157微生物。
17.如權(quán)利要求6的方法，其中，所述病原微生物是瘟疫(鼠疫耶爾森氏菌)微生物。
18.如權(quán)利要求6的方法，其中，所述病原微生物是天花(重型天花)微生物。
19.如權(quán)利要求6的方法，其中，所述病原微生物是野兔熱(土拉熱弗朗西斯氏菌)微生物。
20.如權(quán)利要求6的方法，其中，所述病原微生物是布魯氏菌病(布魯氏菌屬物種)微生物。
21.如權(quán)利要求6的方法，其中，所述病原微生物是產(chǎn)氣莢膜梭菌微生物。
22.如權(quán)利要求6的方法，其中，所述病原微生物是沙門(mén)氏菌屬微生物。
23.如權(quán)利要求6的方法，其中，所述病原微生物是志賀氏菌屬微生物。
24.如權(quán)利要求6的方法，其中，所述病原微生物是鼻疽(鼻疽伯克氏菌)微生物。
25.如權(quán)利要求6的方法，其中，所述病原微生物是類鼻疽(類鼻疽伯克氏菌)微生物。
26.如權(quán)利要求6的方法，其中，所述病原微生物是鸚鵡熱(鸚鵡熱衣原體)微生物。
27.如權(quán)利要求6的方法，其中，所述病原微生物是Q熱(伯氏考克斯氏體)微生物。
28.如權(quán)利要求6的方法，其中，所述病原微生物是斑疹傷寒(普氏立克次氏體)微生物。
29.如權(quán)利要求6的方法，其中，所述病原微生物是霍亂弧菌微生物。
30.如權(quán)利要求6的方法，其中，所述病原微生物選自下組線狀病毒(如埃博拉和馬爾堡病毒)，naviruses(如拉薩熱和Machupo病毒)和甲病毒(如委內(nèi)瑞拉馬腦炎，東方馬腦炎，和西方馬腦炎)。
31.如權(quán)利要求6的方法，其中，所述病原微生物是賈第鞭毛蟲(chóng)微生物。
32.如權(quán)利要求6的方法，其中，所述病原微生物是白色假絲酵母微生物。
33.如權(quán)利要求6的方法，其中，所述病原微生物是糞腸球菌微生物。
34.如權(quán)利要求6的方法，其中，所述病原微生物是表皮葡萄球菌微生物。
35.如權(quán)利要求6的方法，其中，所述病原微生物是金黃色葡萄球菌微生物。
36.如權(quán)利要求6的方法，其中，所述病原微生物是產(chǎn)氣腸桿菌微生物。
37.如權(quán)利要求6的方法，其中，所述病原微生物是白喉棒狀桿菌微生物。
38.如權(quán)利要求6的方法，其中，所述病原微生物是銅綠假單胞菌微生物。
39.如權(quán)利要求6的方法，其中，所述病原微生物是醋酸鈣不動(dòng)桿菌微生物。
40.如權(quán)利要求6的方法，其中，所述病原微生物是肺炎克雷白桿菌微生物。
41.如權(quán)利要求6的方法，其中，所述病原微生物是粘質(zhì)沙雷氏菌微生物。
42.如權(quán)利要求6的方法，其中，所述照射光在紫外光譜區(qū)內(nèi)，波長(zhǎng)小于410nm。
43.如權(quán)利要求6的方法，其中，所述照射光在可見(jiàn)光譜區(qū)內(nèi)，波長(zhǎng)小于780nm并且大于410nm。
44.如權(quán)利要求6的方法，其中，所述照射光在近紅外光譜區(qū)內(nèi)，波長(zhǎng)小于2500nm，并且大于780nm。
45.如權(quán)利要求6的方法，其中，所述分析步驟包括分析所述病原微生物的菌株。
46.如權(quán)利要求6的方法，其中，所述分析步驟包括分析所述病原微生物的存活力。
47.如權(quán)利要求6的方法，其中，使用小型元件，以便能夠?qū)崿F(xiàn)手持式檢測(cè)儀。
全文摘要
病原微生物是在寬視域中檢測(cè)的，并且通過(guò)來(lái)自所述微生物的拉曼光散射光以及它們的光譜分布圖的數(shù)字分布圖識(shí)別而進(jìn)行分類。
文檔編號(hào)G01N21/64GK1842696SQ200480024628
公開(kāi)日2006年10月4日 申請(qǐng)日期2004年6月24日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月27日
發(fā)明者C·W·小加納, J·S·邁爾, M·P·納爾遜, R·C·施維策爾, P·J·特里多, G·S·文尼, J·沃爾夫 申請(qǐng)人:坎米馬吉公司