專利名稱：運(yùn)用復(fù)合熒光pcr技術(shù)檢測食源性病原微生物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)菌檢驗(yàn)技術(shù)，具體地說是運(yùn)用熒光PCR反應(yīng)來檢測致病細(xì)菌，特別是食源 性病原微生物的技術(shù).
背景技術(shù)：
食品中常見的致病菌是引起食物中毒的主要原因之一，可導(dǎo)致多種疾病發(fā)生，嚴(yán)重威脅 著人們的健康?？焖?、準(zhǔn)確的檢測食品中的致病菌是有效預(yù)防和控制病原菌感染的前提條件。 隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，食品檢驗(yàn)檢疫工作中的細(xì)菌鑒定方法已經(jīng)從傳統(tǒng)的簡單生化實(shí)驗(yàn)水 平上向分子生物學(xué)的方法如PCR、探針雜交等技術(shù)發(fā)展，但是分子生物學(xué)的檢測方法在短期 內(nèi)仍然難以代替?zhèn)鹘y(tǒng)的生化鑒定，目前分子生物學(xué)方法主要用于大量樣品的初篩。需要檢測 的食源性病原微生物主要包括以下幾種金黃色葡萄球菌、單核增生李斯特氏菌、副溶血弧 菌、霍亂弧菌、創(chuàng)傷弧菌、志賀氏菌、沙門氏菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、出血性大腸桿菌 和大腸桿菌0157: H7等。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述目標(biāo)菌，本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)中的缺點(diǎn)，提供一種運(yùn)用復(fù)合熒光PCR技術(shù)快 速低成本的檢測金黃色葡萄球菌、單核增生李斯特氏菌、腸桿菌科細(xì)菌和弧菌屬細(xì)菌的方法。
該方法包括應(yīng)用該方法檢測食源性病原微生物的所使用的引物組和與之配套的PCR反 應(yīng)條件，其中引物、探針的全部序列如下
引物
弓I物序列一5 'TTTCTGACATAAGAAATACAAATAATCATA 引物序列二 5'GTTTTGAATGTTTGTTCATTCAAATTAAT 弓l物序列三5TGGTGGAGCCTAGCGGGATC 弓I物序列四5' CCGTGTACGCTTAGTCGCTTAACCTC 引物序列五5'GCTCTTTAACAATTTGGAAAGCTGA 引物序列六5'TTCCCAAGAACACTTGAATGTGTT
本發(fā)明提供了更加快速和低成本通過熒光PCR方法檢測食源性病原微生物的方法。 本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的
(1) 設(shè)計(jì)特異性寡核苷酸引物用于熒光染料嵌合熒光PCR技術(shù)檢測；
(2) 整合各引物使之不相互干擾.
(3) 以引物序列組，擴(kuò)增待測樣品模板，進(jìn)行目的基因的特異性擴(kuò)增
(4) 擴(kuò)增過程中使用熒光PCR儀進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光光強(qiáng)度測量并在PCR反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行所
合成DNA片段的熔解曲線的測定，并將數(shù)據(jù)傳輸至電腦通過配套軟件進(jìn)行分析可以觀察到 各種病原微生物的特異性熔解曲線的峰值.
本發(fā)明用特異性的引物組擴(kuò)增金黃色葡萄球菌、單核增生李斯特氏菌、15種腸桿菌和5 種弧菌的基因組均產(chǎn)生熒光信號(hào)，并生成相應(yīng)的熔解曲線峰值，均未發(fā)現(xiàn)假陽性和假陰性的 結(jié)果，
本發(fā)明中熒光PCR反應(yīng)體系中各組分構(gòu)成比例如下:
成分濃度加樣量
PCR體系預(yù)混合物2倍12.5fiL
熒光嵌合法所用引物序列一:10,oI/L0.3pL
熒光嵌合法所用引物序列二:0舉
熒光嵌合法所用引物序列三:10拜I/L0.6^L
熒光嵌合法所用引物序列四:10^mol/L0.34
熒光嵌合法所用引物序列五:10拜ol/L0.3nL
熒光嵌合法所用引物序列六:10拜ol/L0單
DNA樣品
雙蒸水9.1nL
總體積25jiL
熒光PCR擴(kuò)增程序及測定擴(kuò)增片段的熔解溫度程序?yàn)?br> (1) 95*C IO分鐘
(2) 95*C15秒；
(3) 30秒
(4) 回到第(2)步，重復(fù)40次
(5) 95"C 2分
(6) 梯度升溫60"C至95*0每秒上升0.2"。
熒光PCR結(jié)果在擴(kuò)增過程中使用熒光PCR儀進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光光強(qiáng)度測量，并在PCR擴(kuò)增 程序結(jié)束后進(jìn)行梯度升溫測定擴(kuò)增片段的熔解溫度。將數(shù)據(jù)傳輸至電腦通過配套軟件進(jìn)行分 析可以觀察到進(jìn)行特異性擴(kuò)增產(chǎn)生的熒光，并得到對(duì)金黃色葡萄球菌的特異性片段所特有的 熔解曲線(761C士0.3iC):單核增生李斯特氏菌的特異性片段所特有的熔解曲線(79"C士0.3t:); 弧菌屬細(xì)菌的特異性片段所特有的熔解曲線(74X:i03"C):腸桿菌科細(xì)菌的特異片段所特 有的溶解曲線(85TC=t0.3TC),
如果得到對(duì)金黃色葡萄球菌的特異性片段所特有的熔解曲線(76TC±0.3"C)則證明待測
樣品中存在金黃色葡萄球菌；如果得到對(duì)單核增生李斯特氏菌的特異性片段所特有的熔解曲 線(791C±0.31C)則證明待測樣品中存在單核增生李斯特氏菌如果得到對(duì)弧菌屬的特異性 片段所特有的熔解曲線(741C±0.31C)則證明待測樣品中存在弧菌如果得到對(duì)腸桿菌科的 特異性片段所特有的熔解曲線(85"C±0.3r)則證明待測樣品中存在腸桿菌如出現(xiàn)其他結(jié) 果則表明此次檢驗(yàn)失敗不能確定是否存在金黃色葡萄球菌，單核增生李斯特氏菌，弧菌和腸 桿菌，霜重新檢驗(yàn).
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是基于熒光PCR的鑒定方法適用于直接從患者 含菌體液、食品和體液培養(yǎng)物等臨床樣品中擴(kuò)增靶基因，從而細(xì)菌，而且使用本方法只需要 一次一管熒光PCR反應(yīng)就能夠檢測出金黃色葡萄球菌，單核增生李斯特氏菌，弧菌和腸桿 菌是否存在，能夠節(jié)約檢溯成本和時(shí)間.熒光PCR方法具有檢測準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)、靈敏度 高的特點(diǎn)，可以快速、準(zhǔn)確地鑒定特異的目標(biāo)細(xì)菌.它用PCR的方法擴(kuò)增細(xì)菌耙基因，避 免了反復(fù)培養(yǎng)，節(jié)約時(shí)間；PCR鑒定方法不受培養(yǎng)條件和細(xì)菌生理狀態(tài)的影響，較生理生化 鑒定方法更為準(zhǔn)確。


圖1某待測鮮牛肉樣品中復(fù)合熒光PCR技術(shù)檢測待測樣品DNA， SYBRGreen熒光信號(hào) 強(qiáng)度。
圖2某待測鮮牛肉樣品中復(fù)合熒光PCR技術(shù)檢測待測樣品DNA,擴(kuò)增產(chǎn)物熔解溫度峰值。
圖3某待淵鮮豬肉樣品中復(fù)合熒光PCR技術(shù)檢測待測樣品DNA, SYBR Green熒光信號(hào) 強(qiáng)度.
圖4某待測鮮豬肉樣品中復(fù)合熒光PCR技術(shù)檢測待測樣品DNA,擴(kuò)增產(chǎn)物熔解溫度峰值.
圖5某待測餅干樣品中復(fù)合熒光PCR技術(shù)檢測待測樣品DNA, SYBR Green熒光信號(hào)強(qiáng)度。
圖6某待測餅干樣品中復(fù)合熒光PCR技術(shù)檢測待測樣品DNA,擴(kuò)增產(chǎn)物熔解溫度峰值。 圖7某待測帶魚樣品中復(fù)合熒光PCR技術(shù)檢測待測樣品DNA, SYBR Green熒光信號(hào)強(qiáng)
度，
圖8某待測帶魚肉樣品中復(fù)合熒光PCR技術(shù)檢測待測樣品DNA,擴(kuò)增產(chǎn)物熔解溫度峰值。
圖9某待測蘿卜樣品中復(fù)合熒光PCR技術(shù)檢測待測樣品DNA, SYBR Green熒光信號(hào)強(qiáng)度。
圖IO某待測蘿卜樣品中復(fù)合熒光PCR技術(shù)檢測待測樣品DNA,擴(kuò)增產(chǎn)物熔解溫度峰值。 圖11某待測嬰兒米粉樣品中復(fù)合熒光PCR技術(shù)檢擁待測樣品DNA, SYBR Green熒光
信號(hào)強(qiáng)度.
圖12某待測嬰兒米粉樣品中復(fù)合熒光PCR技術(shù)檢測待測樣品DNA,擴(kuò)增產(chǎn)物熔解溫度 峰值。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖與具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述， 實(shí)施例1
樣本某處出口鮮牛肉。
用常規(guī)生理、生化方法檢測出金黃色葡萄球菌疑似菌落，然后進(jìn)行如下復(fù)合熒光PCR技 術(shù)檢測食源性致病菌的檢測
1. 樣品處理
(1) 取100克待檢樣品，粉碎。
(2) 溶解于1升營養(yǎng)肉湯中37"C培養(yǎng)8小時(shí)，
2. DNA抽提
取營養(yǎng)肉湯lmL在冰浴中靜置5分鐘，然后在室溫下12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，棄 上清液，加入100nL溶菌酶溶液，37"C保溫10分鐘，補(bǔ)加TE緩沖液500nL，振蕩混勻。加 同體積Tris飽和酚(pH8.0),強(qiáng)烈振蕩，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心3分鐘，取上清液，重復(fù)酚抽提。 取上清液，加入0.1倍體積的乙酸鈉(2mol/L),混勻，再加等體積的冰乙醇，混勻后低溫靜 置30分鐘，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，棄上清，加70%冷乙醇洗滌一次，室溫下12000轉(zhuǎn) /分鐘，離心5分鐘，棄上清,加入50nLTE溶液，置-20r保存，
3. PCR擴(kuò)增
PCR反應(yīng)體系中各組分構(gòu)成比例如下
成分濃度加樣量
PCR體系預(yù)混合物2倍12.5jiL
熒光嵌合法所用引物序列一0舉
熒光嵌合法所用引物序列二1O拜ol/L0.3hL
熒光嵌合法所用引物序列三0.6|iL
熒光嵌合法所用引物序列四0.3}iL
熒光嵌合法所用引物序列五10阿ol/L0.3jiL
熒光嵌合法所用引物序列六10萍o(jì)l/L0.6(iL
DNA樣品
雙蒸水 9.1jiL 總體積 25 jiL
熒光PCR擴(kuò)增程序及測定擴(kuò)增片段的熔解溫度程序?yàn)?br> (1) 951C IO分鐘；
(2) 95^015秒；
(3) 65"C30秒
(4) 回到第(2)步，重復(fù)40次
(5) 951C 2分
(6) 梯度升溫601C至95TC每秒上升0.210,
PCR共進(jìn)行2管PCR實(shí)驗(yàn)，其中DNA樣品所加入的分別為本待測樣品DNA:無樣 品的陰性對(duì)照，
4.被檢測樣品熒光PCR圖譜觀察
熒光PCR過程中可以觀察到本待測樣品產(chǎn)生了明顯的SYBR Green熒光，結(jié)果如圖1。 陰性對(duì)照在PCR過程中沒有產(chǎn)生SYBR Green熒光結(jié)果，在通過觀測擴(kuò)增產(chǎn)物熔解溫度的熒 光曲線，可以發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌的特征峰值76.210如圖2*
圖1中的曲線所代表的SYBR Green熒光強(qiáng)度信號(hào)是樣品中DNA擴(kuò)增結(jié)果，
圖2中的曲線所代表的熔解溫度峰值是樣品中金黃色葡萄球菌的特征峰值76.21C*
實(shí)驗(yàn)表明樣品中含有金黃色葡萄球菌，
3天后，通過常規(guī)微生物培養(yǎng)和生化檢測證明，所檢驗(yàn)的目的菌落為金黃色葡萄球菌， 將其中一個(gè)菌株命名為CIQ061011*熒光PCR檢驗(yàn)結(jié)果與生化檢測結(jié)果一致。 實(shí)施例2
樣本某處出口鮮豬肉。
用常規(guī)生理、生化方法檢測出金黃色葡萄球菌疑似菌落，然后進(jìn)行如下復(fù)合熒光PCR技 術(shù)檢測食源性致病菌的檢測
1. 樣品處理
(1) 取100克待檢樣品，粉碎，
(2) 溶解于1升營養(yǎng)肉湯中37"C培養(yǎng)8小時(shí)，
2. DNA抽提
取營養(yǎng)肉湯lmL在冰浴中靜置5分鐘，然后在室溫下12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，棄 上清液，加入100^L溶菌酶溶液，37"C保溫10分鐘，補(bǔ)加TE緩沖液500^L,振蕩混勻*加
同體積Tris飽和酚(pH8.0),強(qiáng)烈振蕩，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心3分鐘，取上清液，重復(fù)酚抽提。 取上清液，加入0.1倍體積的乙酸鈉(2mol/L)，混勻，再加等體積的冰乙醇，混勻后低溫靜 置30分鐘，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘,棄上清，加70%冷乙醉洗滌一次，室溫下12000轉(zhuǎn) /分鐘，離心5分鐘，棄上清,加入5(HiLTE溶液，置-20lC保存， 3. PCR擴(kuò)增
PCR反應(yīng)體系中各組分構(gòu)成比例如下
成分濃度加樣量
PCR體系預(yù)混合物2倍12早
熒光嵌合法所用引物序列一10拜1/L0.3nL
熒光嵌合法所用引物序列二1O萍o(jì)l/L0早
熒光嵌合法所用引物序列三1O拜ol/L0.6fiL
熒光嵌合法所用引物序列四(UjiL
熒光嵌合法所用引物序列五10阿ol/L0早
熒光嵌合法所用引物序列六-0單
DNA樣品l^iL
雙蒸水
總體積25 nL
熒光PCR擴(kuò)增程序及測定擴(kuò)增片段的熔解溫度程序?yàn)?br> (1) 951C IO分鐘；
(2) 95"C15秒；
(3) 30秒；
(4) 回到第(2)步，重復(fù)40次 (5〉 951C 2分
(6〉梯度升溫60*0至95"每秒上升0.2*0* PCR共進(jìn)行2管PCR實(shí)驗(yàn)，其中DNA樣品所加入的分別為本待溯樣品DNA:無樣 品的陰性對(duì)照，
4.被檢測樣品熒光PCR圖譜觀察
熒光PCR過程中可以觀察到本待測樣品產(chǎn)生了明顯的SYBR Green熒光，結(jié)果如圖3。 陰性對(duì)照在PCR過程中沒有產(chǎn)生SYBRGreen熒光結(jié)果，在通過觀測擴(kuò)增產(chǎn)物熔解溫度的熒 光曲線，可以發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌的特征峰值76.210如圖4.
圖3中的曲線所代表的SYBR Green熒光強(qiáng)度信號(hào)是樣品中DNA擴(kuò)增結(jié)果，
圖4中的曲線所代表的熔解溫度峰值是樣品中金黃色葡萄球菌的特征峰值76.2*0。 實(shí)驗(yàn)表明樣品中含有金黃色葡萄球菌，
3天后，通過常規(guī)微生物培養(yǎng)和生化檢測證明，所檢驗(yàn)的目的菌落為金黃色葡萄球菌， 將其中一個(gè)菌株命名為CIQ061018。熒光PCR檢驗(yàn)結(jié)果與生化檢測結(jié)果一致. 實(shí)施例3
樣本某處進(jìn)口餅干.
用常規(guī)生理、生化方法檢測出單核增生李斯特氏菌疑似菌落，然后進(jìn)行如下復(fù)合熒光PCR 技術(shù)檢測食源性致病菌的檢測
1. 樣品處理
(1) 取100克待檢樣品，粉碎，
(2) 溶解于1升營養(yǎng)肉湯中37'C培養(yǎng)8小時(shí).
2. DNA抽提
取營養(yǎng)肉湯lmL在冰浴中靜置5分鐘，然后在室溫下12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，棄 上清液，加入100jiL溶菌酶溶液，37"保溫10分鐘，補(bǔ)加TE緩沖液500jiL，振蕩混勻。加 同體積Tris飽和酚(pH8.0),強(qiáng)烈振蕩，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心3分鐘，取上清液，重復(fù)酚抽提。 取上清液，加入0.1倍體積的乙酸鈉(2mol/L),混勻，再加等體積的冰乙醇，混勻后低溫靜 置30分鐘，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘,棄上清，加70%冷乙醇洗滌一次，室溫下12000轉(zhuǎn) /分鐘，離心5分鐘，棄上清,加入50jiLTE溶液，置-2(TC保存，
3. PCR擴(kuò)增
PCR反應(yīng)體系中各組分構(gòu)成比例如下
成分濃度加樣量
PCR體系預(yù)混合物2倍12.5^
熒光嵌合法所用引物序列一10拜ol/L
熒光嵌合法所用引物序列二0.3 iL
熒光嵌合法所用引物序列三10拜I/L0單
熒光嵌合法所用引物序列四1Opmol/L0.3jiL
熒光嵌合法所用引物序列五10[unol/L0.3nL
熒光嵌合法所用引物序列六10pmol/L0單
DNA樣品l^L
雙蒸水9.1^L
總體積25 nL
熒光PCR擴(kuò)增程序及測定擴(kuò)增片段的熔解溫度程序?yàn)?br> (1) 95*C IO分鐘
(2) 15秒；
(3) 65"30秒；
(4) 回到第(2)步，重復(fù)40次；
(5) 951C 2分
(6) 梯度升溫601C至95"每秒上升0.2*0.
PCR共進(jìn)行2管PCR實(shí)驗(yàn)，其中DNA樣品所加入的分別為本待測樣品DNA;無樣 品的陰性對(duì)照，
4.被檢測樣品熒光PCR圖譜觀察
熒光PCR過程中可以觀察到本待測樣品產(chǎn)生了明顯的SYBR Green熒光，結(jié)果如圖5, 陰性對(duì)照在PCR過程中沒有產(chǎn)生SYBRGreen熒光結(jié)果，在通過觀測擴(kuò)增產(chǎn)物熔解溫度的熒 光曲線，可以發(fā)現(xiàn)單核增生李斯特氏菌的特征峰值78.9"C如圖6,
圖5中的曲線所代表的SYBR Green熒光強(qiáng)度信號(hào)是樣品中DNA擴(kuò)增結(jié)果.
圖6中的曲線所代表的熔解溫度峰值是樣品中單核增生李斯特氏菌的特征峰值76.2*C,
實(shí)驗(yàn)表明樣品中含有單核增生李斯特氏菌，
5天后，通過常規(guī)微生物培養(yǎng)和生化檢測證明，所檢驗(yàn)的目的菌落為單核增生李斯特氏 菌，將其中一個(gè)菌株命名為CIQ061007,熒光PCR檢驗(yàn)結(jié)果與生化檢測結(jié)果一致， 實(shí)施例4
樣本某處出口帶魚。
用常規(guī)生理、生化方法檢測出副溶血弧菌疑似菌落，然后進(jìn)行如下復(fù)合熒光PCR技術(shù)檢 測食源性致病菌的檢測
1. 樣品處理
(1) 取100克待檢樣品，粉碎。
(2) 溶解于1升營養(yǎng)肉湯中37"C培養(yǎng)8小時(shí)。
2. DNA抽提
取營養(yǎng)肉湯lmL在冰浴中靜置5分鐘，然后在室溫下12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，棄 上清液，加入100nL溶菌酶溶液，37^C保溫10分鐘，補(bǔ)加TE緩沖液500jiL,振蕩混勻.加 同體積Tris飽和酚(pH8.0),強(qiáng)烈振蕩，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心3分鐘，取上清液，重復(fù)酚抽提。 取上清液，加入O.l倍體積的乙酸鈉(2mol/L),混勻，再加等體積的冰乙醇，泡勻后低溫靜 置30分鐘，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘,棄上清，加70%冷乙醇洗滌一次，室溫下12000轉(zhuǎn)
/分鐘，離心5分鐘，棄上清,加入50nLTE溶液，置-201C保存。 3.PCR擴(kuò)增
PCR反應(yīng)體系中各組分構(gòu)成比例如下
成分濃度加樣量
PCR體系預(yù)混合物2倍12單
熒光嵌合法所用引物序列一0.3jiL
熒光嵌合法所用引物序列二t10拜ol/L0.3jiL
熒光嵌合法所用引物序列三10pmol/L0早
熒光嵌合法所用引物序列四10拜ol/L0.3^L
熒光嵌合法所用引物序列五10拜1/L0舉
熒光嵌合法所用引物序列六0単
DNA樣品 ljtL 雙蒸水 9.1jiL 總體積 25 jiL
熒光PCR擴(kuò)增程序及測定擴(kuò)增片段的熔解溫度程序?yàn)?br> (1) 951C IO分鐘；
(2) 15秒
(3) 30秒；
(4) 回到第(2)步，重復(fù)40次；
(5) 951C 2分,
(6) 梯度升溫6(TC至95*0每秒上升0.2卩。
PCR共進(jìn)行2管PCR實(shí)驗(yàn)，其中DNA樣品所加入的分別為本待測樣品DNA:無樣 品的陰性對(duì)照.
4.被檢測樣品熒光PCR圖譜觀察
熒光PCR過程中可以觀察到本待測樣品產(chǎn)生了明顯的SYBR Green熒光，結(jié)果如圖7. 陰性對(duì)照在PCR過程中沒有產(chǎn)生SYBR Green熒光結(jié)果，在通過觀測擴(kuò)增產(chǎn)物熔解溫度的熒 光曲線，可以發(fā)現(xiàn)弧菌的特征峰值73.810如圖8。
圖7中的曲線所代表的SYBR Green熒光強(qiáng)度信號(hào)是樣品中DNA擴(kuò)增結(jié)果*
圖8中的曲線所代表的熔解溫度峰值是樣品中弧菌的特征峰值73.81C.
實(shí)驗(yàn)表明樣品中含有弧菌，
3天后，通過常規(guī)微生物培養(yǎng)和生化檢測證明，所檢驗(yàn)的目的菌落為副溶血弧菌，將其
中一個(gè)菌株命名為CIQ060卯3.熒光PCR檢驗(yàn)結(jié)果與生化檢測結(jié)果一致. 實(shí)施例5
樣本某處出口蘿卜.
用常規(guī)生理、生化方法檢測出大腸桿菌疑似菌落，然后進(jìn)行如下復(fù)合熒光PCR技術(shù)檢測 食源性致病菌的檢測
1. 樣品處理
(1) 取100克待檢樣品，粉碎.
(2) 溶解于1升營養(yǎng)肉湯中371C培養(yǎng)8小時(shí).
2. DNA抽提
取營養(yǎng)肉湯lmL在冰浴中靜置5分鐘，然后在室溫下12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，棄 上清液，加入10(HiL溶菌酶溶液，37C保溫10分鐘，補(bǔ)加TE緩沖液500jiL,振蕩混勻。加 同體積Tris飽和酚(pH8.0),強(qiáng)烈振蕩，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心3分鐘，取上清液，重復(fù)酚抽提* 取上清液，加入0.1倍體積的乙酸鈉(2mol/L),混勻，再加等體積的冰乙醇，混勻后低溫靜 置30分鐘，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，棄上清，加70%冷乙醇洗滌一次，室溫下12000轉(zhuǎn) /分鐘，離心5分鐘，棄上清,加入50nLTE溶液，置-20"C保存，
3. PCR擴(kuò)增
PCR反應(yīng)體系中各組分構(gòu)成比例如下
成分濃度加樣量
PCR體系預(yù)混合物2倍12.5jiL
熒光嵌合法所用引物序列一10拜ol/L
熒光嵌合法所用引物序列二10pmol/L0.3jiL
熒光嵌合法所用引物序列三10拜1/L0.6pL
熒光嵌合法所用引物序列四0.3^L
熒光嵌合法所用引物序列五0.3jiL
熒光嵌合法所用引物序列六
DNA樣品14
雙蒸水9.1jiL
總體積25 nL
熒光PCR擴(kuò)增程序及測定擴(kuò)增片段的熔解溫度程序?yàn)?
(1) 95*C IO分鐘；
(2) 95"C15秒(3) 65XJ30秒
(4) 回到第(2)步，重復(fù)40次
(5) 2分
(6) 梯度升溫至每秒上升0.210,
PCR共進(jìn)行2管PCR實(shí)驗(yàn)，其中DNA樣品所加入的分別為本待測樣品DNA;無樣 品的陰性對(duì)照。
4.被檢測樣品熒光PCR圖譜觀察
熒光PCR過程中可以觀察到本待測樣品產(chǎn)生了明顯的SYBR Green熒光，結(jié)果如圖9。 陰性對(duì)照在PCR過程中沒有產(chǎn)生SYBR Green熒光結(jié)果，在通過觀測擴(kuò)增產(chǎn)物熔解溫度的熒 光曲線，可以發(fā)現(xiàn)腸桿菌的特征峰值85"C如圖10。
圖9中的曲線所代表的SYBR Green熒光強(qiáng)度信號(hào)是樣品中DNA擴(kuò)增結(jié)果.
圖10中的曲線所代表的熔解溫度峰值是樣品中腸桿菌的特征峰值851C.
實(shí)驗(yàn)表明樣品中含有腸桿菌.
2天后，通過常規(guī)微生物培養(yǎng)和生化檢測證明，所檢驗(yàn)的目的菌落為大腸桿菌，將其中 一個(gè)菌株命名為CIQ061101.熒光PCR檢驗(yàn)結(jié)果與生化檢測結(jié)果一致， 實(shí)施例6
樣本某處進(jìn)口嬰兒米粉，
用常規(guī)生理、生化方法發(fā)現(xiàn)變形桿菌疑似菌落，然后進(jìn)行如下復(fù)合熒光PCR技術(shù)檢測食 源性致病菌的檢測
1. 樣品處理
(1) 取100克待檢樣品，
(2) 溶解于1升營養(yǎng)肉湯中371C培養(yǎng)8小時(shí).
2. DNA抽提
取營養(yǎng)肉湯lmL在冰浴中靜置5分鐘，然后在室溫下12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，棄 上清液，加入100jiL溶菌酵溶液，37X:保溫10分鐘，補(bǔ)加TE緩沖液5(KHiL，振蕩混勻，加 同體積Tris飽和酚(pH8.0),強(qiáng)烈振蕩，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心3分鐘，取上清液，重復(fù)酚抽提. 取上清液，加入0.1倍體積的乙酸鈉(2mol/L)，混勻，再加等體積的冰乙醉，混勻后低溫靜 置30分鐘，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘,棄上清，加70%冷乙醇洗滌一次，室溫下12000轉(zhuǎn) /分鐘，離心5分鐘，棄上清，加入5(HiLTE溶液，置-2(TC保存.
3. PCR擴(kuò)增
PCR反應(yīng)體系中各組分構(gòu)成比例如下
成分濃度加樣量
PCR體系預(yù)混合物2倍12單
熒光嵌合法所用引物序列一10pmol/L0.3^L
熒光嵌合法所用引物序列二10pmol/L0.3tiL
熒光嵌合法所用引物序列三10拜ol/L0単
熒光嵌合法所用引物序列四10拜ol/L0.3jiL
熒光嵌合法所用引物序列五10拜ol/L0.3jiL
熒光嵌合法所用引物序列六lOpmol/L0單
DNA樣品叫
雙蒸水9.14
總體積25
熒光PCR擴(kuò)增程序及測定擴(kuò)增片段的熔解溫度程序?yàn)?br> (1) 95" IO分鐘
(2) 951C15秒
(3) 65*C30秒
(4) 回到第(2)步，重復(fù)40次
(5) 95"C 2分；
(6) 梯度升溫60"C至每秒上升0.2*€。
PCR共進(jìn)行2管PCR實(shí)驗(yàn)，其中DNA樣品所加入的分別為本待測樣品DNA:無樣 品的陰性對(duì)照.
4.被檢測樣品熒光PCR圖譜觀察
熒光PCR過程中觀察到本待測樣品產(chǎn)生了明顯的SYBRGreen熒光，結(jié)果如圖11.陰性 對(duì)照在PCR過程中沒有產(chǎn)生SYBR Green熒光結(jié)果，在通過觀測擴(kuò)增產(chǎn)物熔解溫度的熒光曲 線，發(fā)現(xiàn)腸桿菌特征峰值各種細(xì)菌的特征峰值85.1如圖12,
圖11中的曲線所代表的SYBR Green熒光強(qiáng)度信號(hào)是樣品中DNA擴(kuò)增結(jié)果。
圖12中的曲線所代表的熔解溫度曲線是樣品DNA擴(kuò)增的結(jié)果，
實(shí)驗(yàn)表明樣品中不含有腸桿菌.
3天后，通過常規(guī)微生物培養(yǎng)和生化檢測證明，所檢驗(yàn)的目的菌落為普通變形桿菌，將 其中一個(gè)菌株命名為CIQ060810.熒光PCR檢驗(yàn)結(jié)果與生化檢測結(jié)果一致， 序列列表
SEQUENCE LISTING
<110>中華人民共和國天津出入境檢驗(yàn)檢疫局 <120>運(yùn)用復(fù)合熒光PCR技術(shù)檢測食源性病原微生物的方法
<130> 2007112
<160> 6
<170> Patentln version 3.3
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213>人工合成
<220>
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ttcccaagaa cacttgaatg tgtt
權(quán)利要求
1.一種運(yùn)用復(fù)合熒光PCR技術(shù)檢測食源性病原微生物的方法，其特征在于，所使用的引物組序列如下引物引物序列一5’TTTCTGACATAAGAAATACAAATAATCATA引物序列二5’GTTTTGAATGTTTGTTCATTCAAATTAAT引物序列三5’TGGTGGAGCCTAGCGGGATC引物序列四5’CCGTGTACGCTTAGTCGCTTAACCTC引物序列五5’GCTCTTTAACAATTTGGAAAGCTGA引物序列六5’TTCCCAAGAACACTTGAATGTGTT。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種運(yùn)用復(fù)合熒光PCR技術(shù)檢測食源性病原微生物的方法,其 特征在于，PCR反應(yīng)體系中各組分構(gòu)成比例如下成分 濃度 加樣量PCR體系預(yù)混合物2倍引物序列一10拜1/L0.3nL引物序列二1O拜ol/L引物序列三10,ol/L0単引物序列四10拜ol/L0.3^L引物序列五10junol/L0.3ftL引物序列六0.64DNA樣品雙蒸水9.1jiL總體積25fiL 。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種運(yùn)用復(fù)合熒光PCR技術(shù)檢測食源性病原微生物的方法， 其特征在于，熒光PCR擴(kuò)增程序及測定擴(kuò)增片段的熔解溫度程序?yàn)?1) 951C IO分鐘(2) 95匸15秒；(3) 65*030秒；(4) 回到第(2)步，重復(fù)40次；(5) 95"C 2分(6) 梯度升溫60"至95*C每秒上升0,2"C,
4.權(quán)利要求1所述的一種運(yùn)用復(fù)合熒光PCR技術(shù)在檢測食源性病原微生物方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種運(yùn)用復(fù)合熒光PCR技術(shù)檢測食源性病原微生物的方法，屬于細(xì)菌檢驗(yàn)技術(shù)領(lǐng)域，主要的技術(shù)方案是設(shè)計(jì)了引物組序列。食品中常見的致病菌嚴(yán)重威脅著人們的健康。快速、準(zhǔn)確的檢測食品中的致病菌是有效預(yù)防和控制病原菌感染的前提條件。需要檢測的食源性病原微生物主要包括以下幾種金黃色葡萄球菌、單核增生李斯特氏菌、以及弧菌包括和腸桿菌。針對(duì)上述目標(biāo)菌，本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)中的缺點(diǎn)，提供一種運(yùn)用復(fù)合熒光PCR技術(shù)快速低成本的檢測金黃色葡萄球菌、單核增生李斯特氏菌、腸桿菌科細(xì)菌和弧菌屬細(xì)菌的方法。該方法可以使用一管PCR反應(yīng)，能夠初篩出上述幾種病原微生物。
文檔編號(hào)G01N33/52GK101113472SQ200710057579
公開日2008年1月30日 申請(qǐng)日期2007年6月7日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月7日
發(fā)明者佳 于, 寅 劉, 葉露萌, 唐丹舟, 張宏偉, 李永君, 鄭文杰, 魏亞東, 黃熙泰 申請(qǐng)人:天津出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢測中心;南開大學(xué)