專利名稱：一種用于檢測(cè)病原微生物的長(zhǎng)壽命發(fā)光納米生物探針及其制備和檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)病原微生物的長(zhǎng)壽命發(fā)光納米生物探針，還涉及該探針的制 備和檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
環(huán)境中病原微生物的存在，嚴(yán)重威脅著人類的身體健康，無(wú)論在發(fā)展中國(guó)家還是發(fā)達(dá) 國(guó)家，生物性危害所占的比率均大于化學(xué)性等其他因素的危害。環(huán)境中細(xì)菌病原體的檢測(cè) 和鑒定凸現(xiàn)重要。
當(dāng)前對(duì)病原微生物進(jìn)行檢測(cè)的方法有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR， polymerase chain reaction)、熒光分析法、熒光原位雜交法(FISH， fluorescence in site hybridization)和基因 芯片(genechip)法。PCR反應(yīng)能被自然界中一些物質(zhì)所抑制，例如胡敏酸、富里酸。同 樣，環(huán)境樣品在濃縮、保存和提純過(guò)程中可能從環(huán)境及中間處理環(huán)節(jié)帶來(lái)一些潛在的PCR 反應(yīng)抑制劑，例如EDTA、十二烷基磺酸鈉和一些胍基化合物等，另外還有一些共存物質(zhì) 抑制PCR反應(yīng)，這些物質(zhì)一方面可能抑制PCR反應(yīng)，另一方面還可能造成假陽(yáng)性結(jié)果。 PCR法需要得到純化的DNA或RNA片段進(jìn)行擴(kuò)增，步驟較多，對(duì)儀器和人員的要求高。 熒光標(biāo)記法中熒光探針容易受到生物體系內(nèi)源熒光背景干擾。對(duì)于環(huán)境中常見的病原微生 物的檢測(cè)來(lái)說(shuō)，F(xiàn)ISH法是應(yīng)用廣泛、最為有效的技術(shù)之一，但FISH法中熒光探針容易受 到生物體系內(nèi)源熒光背景和用于固定微生物基質(zhì)背景的干擾，檢測(cè)時(shí)靈敏度的提高受到限 制。基因芯片法技術(shù)還不是很完善，仍有一些關(guān)鍵問(wèn)題有待解決，如特異性、樣品制備、 基因擴(kuò)增、靈敏度等方面還存在許多問(wèn)題，而且成本較高。如何采用更好的方法或較為簡(jiǎn) 單的儀器進(jìn)行高靈敏度檢測(cè)是目前研究的熱門課題。
長(zhǎng)壽命發(fā)光技術(shù)可以有效消除生物體系內(nèi)源熒光和背景信號(hào)的千擾，納米生物探針技 術(shù)具有生物敏感物的高選擇性、納米材料增強(qiáng)的高靈敏度、穩(wěn)定性與信號(hào)轉(zhuǎn)換功能以及納 米技術(shù)賦予的微型化特征，使得納米生物探針技術(shù)已逐漸成為解決復(fù)雜生命、環(huán)境等體系 分析問(wèn)題的關(guān)鍵技術(shù)，利用長(zhǎng)壽命發(fā)光納米生物探針技術(shù)構(gòu)建選擇性好、靈敏度高、快速、 簡(jiǎn)便的環(huán)境中病原微生物的檢測(cè)技術(shù)具有重要的理論與實(shí)際意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種用于檢測(cè)病原微生物的長(zhǎng)壽命發(fā)光納米生物探針。 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供長(zhǎng)壽命發(fā)光納米生物探針的制備方法。 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供長(zhǎng)壽命發(fā)光納米生物探針的檢測(cè)方法。 本發(fā)明的目的之一是通過(guò)下述方案實(shí)現(xiàn)的。
所述探針采用了捕獲探針DNA卜識(shí)別探針DNA2及待檢測(cè)病原微生物基因片段的目 標(biāo)探針DNA3，其中捕獲探針、識(shí)別探針均能與病原微生物基因片段的目標(biāo)探針互補(bǔ)雜交， 捕獲探針固定在玻璃片上；識(shí)別探針連接有核殼型結(jié)構(gòu)的稀土配合物長(zhǎng)壽命發(fā)光納米顆 粒，其中殼成分為二氧化硅，內(nèi)核材料為長(zhǎng)壽命發(fā)光稀土配合物。
所述的核殼型結(jié)構(gòu)的稀土配合物長(zhǎng)壽命發(fā)光納米顆粒中的稀土配合物是以噻吩甲酰 三氟丙酮(TTA)， 1，10-鄰菲啰啉(phen)為配體的稀土銪長(zhǎng)壽命發(fā)光配合物Eu(TTA)3phen，
結(jié)構(gòu)式<formula>formula see original document page 6</formula>
所述的核殼型結(jié)構(gòu)的稀土配合物長(zhǎng)壽命發(fā)光納米顆粒中的稀土配合物是以噻吩甲酰 三氟丙酮(TTA)， 1，10-鄰菲啰啉(phen)為配體的稀土鋱長(zhǎng)壽命發(fā)光配合物Tb(TTA)3phen，
本發(fā)明的目的之二是通過(guò)下述方案實(shí)現(xiàn) 1、稀土配合物的合成
將稀土氧化物溶于濃鹽酸或高氯酸中，加熱除去多余的濃鹽酸或高氯酸，加乙醇稀釋
得透明溶液，另以乙醇溶解噻吩甲酰三氟丙酮(TTA)，將稀土氧化物的乙醇溶液和TTA
結(jié)構(gòu)式:<formula>formula see original document page 6</formula>
的乙醇溶液徐徐加入混合，水浴加熱，磁力攪拌，控制溫度為55~65匸，用NaOH調(diào)節(jié)pH 值為5.5~6.5，反應(yīng)30 50分鐘，以乙醇溶解1,10-鄰菲羅琳(phen),滴加至反應(yīng)體系中， 控制反應(yīng)溫度在55 65'C繼續(xù)反應(yīng)4 6h，攪拌冷卻，靜置過(guò)夜，抽濾；先用乙醇水溶液洗 滌，再用蒸餾水洗滌，真空干燥，重結(jié)晶數(shù)次，得長(zhǎng)壽命發(fā)光稀土配合物； 2、稀土配合物長(zhǎng)壽命發(fā)光納米顆粒的合成'
在含有表面活性劑曲拉通X-100 (TritonX-lOO)、環(huán)己垸和正己醇的體系中，以水為 分散相，加入稀土配合物固體，制備油包水的微乳液，與氨水催化正硅酸乙酯水解所形成 的二氧化硅共聚，以上混合液在常溫下持續(xù)攪拌20 30小時(shí)后停止反應(yīng)，加入丙酮破乳， 離心，先后用無(wú)水乙醇和二次蒸餾水洗多次至上清液無(wú)發(fā)光為止，得到稀土配合物的長(zhǎng)壽 命發(fā)光納米顆粒；
3、 根據(jù)常見病原微生物的特異性片段設(shè)計(jì)合成捕獲探針DNAi、識(shí)別探針DNA2及 病原微生物基因片斷的目標(biāo)探針DNA3;
4、 玻璃芯片的制備
修飾玻片，將捕獲探針連接到玻片上構(gòu)成玻璃芯片；
5、 連有長(zhǎng)壽命發(fā)光納米顆粒的識(shí)別探針的制備
將稀土配合物的長(zhǎng)壽命發(fā)光納米顆粒分散到戊二醛溶液中，室溫下劇烈震蕩2.5~3.5h， 離心并用二次蒸餾水洗，得到的醛基修飾的顆粒重新懸于pH=7.0-7.5的PBS溶液中備用； 將識(shí)別探針DNA2用二次蒸餾水稀釋成15pmol/L;將識(shí)別探針DNA2加入到納米顆粒懸浮 的PBS溶液中，35-40。C下于震蕩培養(yǎng)箱中反應(yīng)2.5-3.5h，反應(yīng)完成后，離心，洗滌；然后 將連接有DNA2的納米顆粒分散于PBS緩沖液中，備用。
將稀土氧化物氧化銪EU203溶于濃鹽酸中或稀土氧化物氧化鋱Tb407溶于高氯酸中。
本發(fā)明的目的之三是通過(guò)下述方案實(shí)現(xiàn)的
a、 雜交，連有長(zhǎng)壽命發(fā)光納米顆粒的識(shí)別探針DNAi與待檢測(cè)的病原微生物基因片 段目標(biāo)探針DNA3在玻璃芯片雜交；
b、 雜交處理，清洗后，帶有長(zhǎng)壽命發(fā)光納米顆粒標(biāo)記的識(shí)別探針DNA2，待檢測(cè)的 病原微生物基因片段目標(biāo)探針DNA3和捕獲探針DNA,形成雜交體，檢測(cè)在激光激發(fā)下產(chǎn) 生的光信號(hào)。
所述的a步雜交是首先將目標(biāo)探針DNA3用二次蒸餾水稀釋到15nmol/L;將上述 DNAd彥飾的玻璃芯片放入雜交盒中，在玻片周圍滴加10nl 3xSSC來(lái)維持濕度；將DNA2
和DNA3樣品滴加到玻片上，蓋上蓋玻片，趕走氣泡；蓋上雜交盒，將其放入震蕩培養(yǎng)箱 中恒溫箱G8.3。C)中雜交24h;用配制好的雜交后清洗液l (lxSSC/0.03%SDS)、洗液 2 (0.2xSSC)和洗液3 (0.05xSSC);讓玻片一直留在洗液里輕輕從洗液中提起玻片， 放入，再提起，來(lái)回上下清洗幾次；
所述b步是雜交清洗后，帶有納米顆粒標(biāo)記的識(shí)別DNA2，目標(biāo)DNA3和捕獲DNA！ 探針形成一個(gè)雜交體，在激光激發(fā)下產(chǎn)生一個(gè)光信號(hào)，檢測(cè)出了玻片上的稀土長(zhǎng)壽命發(fā)光 配合物納米顆粒的光信號(hào)激發(fā)和發(fā)射狹縫分別為8.0nm，延遲時(shí)間O.lms，門時(shí)間1.0 ms; 從而根據(jù)檢測(cè)的光信號(hào)檢測(cè)樣品中待測(cè)病原微生物的存在與否。
本發(fā)明優(yōu)越于傳統(tǒng)檢測(cè)方法的特點(diǎn)在于，長(zhǎng)壽命發(fā)光納米生物探針技術(shù)具有有效消除 生物體系內(nèi)源熒光和背景信號(hào)的干擾以及生物敏感物的高選擇性等優(yōu)點(diǎn)，故有可能做到更 低濃度病原微生物的檢測(cè)，且納米材料增強(qiáng)了靈敏度、穩(wěn)定性與信號(hào)轉(zhuǎn)換功能以及納米技 術(shù)賦予的微型化特征。同時(shí)，根據(jù)已發(fā)表的專利(姚志建，于勇，馬立人等，檢測(cè)多種常 見細(xì)菌病原體的基因芯片、制備方法、試劑盒，中國(guó)專利，
公開日2007年10月3日，公 開號(hào)CN 101045945 A)中常見病原微生物的特異性片段中的金色葡萄球菌和大腸桿菌的片 段。根據(jù)所得到的特異性序列，我們用軟件Primer Premier 5.0，選擇出合適的玻璃芯片上 的捕獲探針DNA"連接在長(zhǎng)壽命發(fā)光納米顆粒上的識(shí)別探針DNA2及病原微生物基因片 斷的目標(biāo)探針DNA3，采用了納米探針的三明治雜交方法，大大提高了雜交特異性和檢測(cè) 靈敏度。構(gòu)建了一種具有高穩(wěn)定性、高選擇性、高靈敏度、快速、簡(jiǎn)便的環(huán)境中病原微生 物的檢測(cè)技術(shù)。


圖1為以配合物Eu(TTA)3phen為核的長(zhǎng)壽命發(fā)光納米顆粒透射電鏡圖； 圖2為Eu(TTA)3phen納米顆粒的長(zhǎng)壽命發(fā)光發(fā)射光譜aex=337nm，延遲時(shí)間O.lms， 門時(shí)間1.0ms);
圖3為三明治結(jié)構(gòu)的檢測(cè)模型雜交示意圖4為玻片上檢測(cè)長(zhǎng)壽命發(fā)光光譜(延遲時(shí)間0.1ms，門時(shí)間1.0ms)
具體實(shí)施例方式
現(xiàn)結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作出進(jìn)一步說(shuō)明。以下旨在說(shuō)明本發(fā)明而不是對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步限
定，本發(fā)明可以按發(fā)明內(nèi)容所述任一方式實(shí)施。
一、 以噻吩甲酰三氟丙酮(TTA)， 1,10-鄰菲啰啉(phen)為配體的稀土銪配合物 EuCTTA)3phen的制備。
合成步驟稱取0.25mmolEu2O3于0.5ml濃鹽酸中，加熱溶解，除去多余的濃鹽酸， 加水稀釋得透明溶液。另以15ml乙醇溶解1.52mmo1 TTA。將氯化銪的乙醇溶液和TTA 的乙醇溶液徐徐加入到三口瓶中，水浴加熱，磁力攪拌，控制溫度為60'C，用NaOH調(diào)節(jié) pH值6.0左右。(加堿時(shí)有固體析出，體系出現(xiàn)混濁)，反應(yīng)40min。以10ml乙醇溶解phen， 滴加至反應(yīng)體系中。隨著phen的加入，先前生成的沉淀逐漸溶解?？刂品磻?yīng)溫度在55-60°C 繼續(xù)反應(yīng)5h，攪拌冷卻。靜置過(guò)夜，有白色的固體析出，抽濾。先用24ml乙醇-水(1: 1) 溶液洗滌，再用蒸餾水洗滌，于50'C下干燥，以甲醇-氯仿混合溶液重結(jié)晶數(shù)次，得白色 固體一稀土銪長(zhǎng)壽命發(fā)光配合物Eu(TTA)3phen,其結(jié)構(gòu)式如附圖1所示。紅外光譜檢測(cè) Eu (TTA)3phen數(shù)據(jù)自由配體TTA中1637 cm"的v(c^o)特征峰，在配合物Eu(TTA)3phen 中藍(lán)移到了 1626 cm";自由配體phen位于1587cm'1處v(c = N)的特征峰，在配合物 Eu(TTA)3phen中藍(lán)移到了 1543 cm-1。元素分析EuC36H23N2F9S3:測(cè)量值Eu， 15,33; C， 42.98; H， 2.35; N， 2.76;計(jì)算值Eu， 15.21; C， 43.26; H， 2.30; N， 2.80;
二、 反相微乳液法制備稀土配合物Eu(TTA)3phen的長(zhǎng)壽命發(fā)光納米顆粒。 分別量取1.8ml正己醇，1.77ml TritonX-100和7.5ml環(huán)己垸加入三口燒瓶，再加入34(V1
二次蒸餾水和15mg Eu(TTA)3phen形成微乳液體系攪拌5min;隨后加入10(^1正硅酸乙酯 (TEOS)和100^128%氨水作為反應(yīng)體系催化劑；并設(shè)置攪拌器轉(zhuǎn)速為600rpm,在常溫 下反應(yīng)24h;反應(yīng)完畢后，加入丙酮破乳，離心，分別用乙醇、二次蒸餾水洗滌至上清液 無(wú)發(fā)光，得到了稀土配合物Eu(TTA)3phen的長(zhǎng)壽命發(fā)光納米顆粒。如附圖2所示，得到的 納米顆粒粒徑都在20nm左右，取固體Eu(TTA)3phen納米顆粒，在激發(fā)波長(zhǎng)^x=337nm時(shí)， 激發(fā)和發(fā)射狹縫分別為8.0nm，延遲時(shí)間0.1ms，門時(shí)間lms，其發(fā)射光譜如附圖3所示， 該配合物在611nm處出現(xiàn)了很強(qiáng)的發(fā)射峰，在591nm處出現(xiàn)了一個(gè)小的發(fā)射峰。
三、 病原微生物基因片斷檢測(cè)的三明治模型。
該病原微生物基因片斷檢測(cè)的三明治模型是由病原微生物的基因DNA3片斷、聯(lián)接有 互補(bǔ)基因DNA2的硅殼長(zhǎng)壽命發(fā)光納米顆粒、與玻璃芯片相聯(lián)的另一段互補(bǔ)基因DNAJ且 成。如附圖4所示，將病原微生物基因DNA3同時(shí)與聯(lián)接在硅殼長(zhǎng)壽命發(fā)光納米顆粒上的 DNA2，以及玻璃芯片上的DNAt片斷在適當(dāng)?shù)臈l件下雜交反應(yīng)，形成類似三明治結(jié)構(gòu)的雜
交復(fù)合物。
四、 設(shè)計(jì)對(duì)病原微生物進(jìn)行檢測(cè)的各探針序列和檢測(cè)序列。
根據(jù)已發(fā)表的專利(姚志建，于勇，馬立人等，檢測(cè)多種常見細(xì)菌病原體的基因芯片、 制備方法、試劑盒，中國(guó)專利，
公開日2007年10月3日，公開號(hào)CN 101045945A)中金 色葡萄球菌和大腸桿菌的特異性片段。該專利是通過(guò)文獻(xiàn)檢索及美國(guó)國(guó)家生物信息中心 (NCBI)的對(duì)比，選擇出種內(nèi)保守性高、種間特異性高的序列輸入軟件PrimoMultiplex 3.4 Multiplex PCR Primer Design,設(shè)定好參數(shù)，運(yùn)行程序，最終獲得病原體基因探針。它們的 具體序列如下
(1) 金色葡萄球菌("*****"代表十個(gè)A堿基)
捕獲探針DNA!: 5，- CACTT TTTCT TAAAT GTTGTTC *****-3，-NH2 識(shí)別探針DNA2: NH2-5，- *****ATTTT CTCTT TTTTC GCTT-3， 目標(biāo)探針DNA3: GAAC AACAT TTAAG AAAAA GTGAA GCACA AGCGA AAAAA GAGAAAAT
(2) 大腸桿菌
捕獲探針DNAi: 5，-ACATT GACGC AGGTG ATCGGACG *****-3，- NH2 識(shí)別探針DNA2: NH2-5，- ***** GTATCGGTGTGAGCGTCGCAGAA-3， 百標(biāo)探針DNA3: 5'隱CGTCC GATCA CCTGC GTCAATGTAATGTTC TGCGA CGCTC ACACC GATAC-3，
五、 制備玻璃芯片和核殼長(zhǎng)壽命發(fā)光納米探針(以金色葡萄球菌為例)。 玻璃芯片的制備根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的方法來(lái)修飾玻片。正方形玻片(直徑13mm)浸入
鉻酸洗液中浸泡過(guò)夜，蒸餾水洗，浸入25%氨水中過(guò)夜，二次蒸餾水水洗，浸入2%的氨 基硅垸95%乙醇溶液中，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH至4.5，室溫作用30min,用乙醇超聲清洗，用 二次蒸餾水超聲清洗，室溫晾干。室溫下2.5%戊二醛的0.1mol/L， PBS (pH=7.2)溶液與 氨基玻片作用2h， PBS沖洗，二次蒸餾水水洗(lmin/次)，晾干。將探針DNA,用二次蒸 餾水稀釋到15pmol/L，將DN&樣品滴加到醛基化玻片表面，室溫靜置過(guò)夜，然后用0.2% 的SDS洗2次，水洗兩次，室溫晾干備用。
長(zhǎng)壽命發(fā)光納米探針的制備稱取100mg表面氨基化的Eu(TTA)3phen納米顆粒分散 到6ml2.5n/。的戊二醛溶液中，室溫下劇烈震蕩3h。離心并用二次蒸餾水洗，得到的醛基修 飾的顆粒重新懸于6mlpH=7.2的PBS溶液中備用。將識(shí)別探針DNA2用二次蒸餾水稀釋
成15nmol/L。將DNA2樣品加入到納米顆粒懸浮的PBS溶液中,37°C下于震蕩培養(yǎng)箱中 反應(yīng)3h，反應(yīng)完成后，離心，洗滌。然后將標(biāo)記好DNA2的納米顆粒分散于PBS緩沖液中，
備用c
六、雜交及信號(hào)檢測(cè)。
首先將目標(biāo)探針DNA3用二次蒸餾水稀釋到15陴ol/L。將上述DNA!修飾的玻璃芯片 放入雜交盒中，在玻片周圍滴加10pl3xSSC來(lái)維持濕度。將DNA2和DNA3樣品滴加到玻 片上，蓋上蓋玻片，趕走氣泡。蓋上雜交盒，將其放入震蕩培養(yǎng)箱中恒溫箱(38.3°C)中 雜交24h。用配制好的雜交后清洗液l (lxSSC/0.03%SDS)、洗液2 (0.2xSSC)和洗液3 (0.05xSSC)見下表所示清洗。讓玻片一直留在洗液里輕輕從洗液中提起玻片，放入， 再提起，來(lái)回上下清洗幾次。
雜交及清洗后，帶有納米顆粒標(biāo)記的識(shí)別DNA2，目標(biāo)DNA3和捕獲DNAi探針形成 一個(gè)雜交體，在激光激發(fā)下產(chǎn)生一個(gè)光信號(hào)，如圖5所示，檢測(cè)出了玻片上的Eu(TTA)3phen 納米顆粒的光信號(hào)激發(fā)和發(fā)射狹縫分別為8.0nm,延遲時(shí)間0.1ms，門時(shí)間1.0ms。因此 可以根據(jù)檢測(cè)的光信號(hào)檢測(cè)樣品中金色葡萄球菌的存在與否。
權(quán)利要求
1、一種用于檢測(cè)病原微生物的長(zhǎng)壽命發(fā)光納米生物探針，其特征在于，所述探針采用了捕獲探針DNA1、識(shí)別探針DNA2及待檢測(cè)病原微生物基因片段的目標(biāo)探針DNA3，其中捕獲探針、識(shí)別探針均能與病原微生物基因片段的目標(biāo)探針互補(bǔ)雜交，捕獲探針固定在玻璃片上；識(shí)別探針連接有核殼型結(jié)構(gòu)的稀土配合物長(zhǎng)壽命發(fā)光納米顆粒，其中殼成分為二氧化硅，內(nèi)核材料為長(zhǎng)壽命發(fā)光稀土配合物。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于檢測(cè)病原微生物的長(zhǎng)壽命發(fā)光納米生物探針，其 特征在于，所述的核殼型結(jié)構(gòu)的稀土配合物長(zhǎng)壽命發(fā)光納米顆粒中的稀土配合物是以噻吩 甲酰三氟丙酮TTA， 1,10-鄰菲啰啉phen為配體的稀土銪長(zhǎng)壽命發(fā)光配合物:Eu(TTA)3phen。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于檢測(cè)病原微生物的長(zhǎng)壽命發(fā)光納米生物探針，其 特征在于，所述的核殼型結(jié)構(gòu)的稀土配合物長(zhǎng)壽命發(fā)光納米顆粒中的稀土配合物是以噻吩 甲酰三氟丙酮TTA， 1,10-鄰菲喂啉phen為配體的稀土鋱長(zhǎng)壽命發(fā)光配合物:Tb(TTA)3phen。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的一種用于檢測(cè)病原微生物的長(zhǎng)壽命發(fā)光納米生物 探針，其特征在于，捕獲探針、識(shí)別探針及待檢測(cè)病原微生物基因片段的目標(biāo)探針呈長(zhǎng)壽 命發(fā)光納米顆粒標(biāo)記的三明治雜交體。
5、 一種用于檢測(cè)病原微生物的長(zhǎng)壽命發(fā)光納米生物探針的制備方法，其特征在于， 包括以下步驟a、 稀土配合物的合成將稀土氧化物溶于濃鹽酸或高氯酸中，加熱除去多余的濃鹽酸或高氯酸，加乙醇稀釋 得透明溶液，另以乙醇溶解噻吩甲酰三氟丙酮TTA，將稀土氯化物的乙醇溶液和噻吩甲酰 三氟丙酮TTA的乙醇溶液徐徐加入混合，水浴加熱，磁力攪拌，控制溫度為55 65。C，用 NaOH調(diào)節(jié)pH值為5.5~6.5，反應(yīng)30 50分鐘，以乙醇溶解l，lO-鄰菲羅琳phen，滴加至反 應(yīng)體系中，控制反應(yīng)溫度在55 65。C繼續(xù)反應(yīng)4 6h，攪拌冷卻，靜置過(guò)夜，抽濾；先用乙 醇水溶液洗滌，再用蒸餾水洗滌，真空干燥，重結(jié)晶數(shù)次，得長(zhǎng)壽命發(fā)光稀土配合物；b、 稀土配合物長(zhǎng)壽命發(fā)光納米顆粒的合成在含有表面活性劑曲拉通TritonX-lOO、環(huán)己烷和正己醇的體系中，以水為分散相，加 入稀土配合物固體，制備油包水的微乳液，與氨水催化正硅酸乙酯水解所形成的二氧化硅 共聚，以上混合液在常溫下持續(xù)攪拌20 30小時(shí)后停止反應(yīng)，加入丙酮破乳，離心，先后 用無(wú)水乙醇和二次蒸餾水洗多次至上清液無(wú)發(fā)光為止，得到稀土配合物的長(zhǎng)壽命發(fā)光納米 顆粒；c、 根據(jù)常見病原微生物的特異性片段設(shè)計(jì)合成捕獲探針DNA^識(shí)別探針DNA》及病 原微生物基因片斷的目標(biāo)探針DNA3;d、 玻璃芯片的制備修飾玻片，將捕獲探針連接到玻片上構(gòu)成玻璃芯片；e、 連有長(zhǎng)壽命發(fā)光納米顆粒的識(shí)別探針的制備將稀土配合物的長(zhǎng)壽命發(fā)光納米顆粒分散到戊二醛溶液中，室溫下劇烈震蕩2.5~3.511， 離心并用二次蒸餾水洗，得到的醛基修飾的顆粒重新懸于pH=7.0-7.5的PBS溶液中備用； 將識(shí)別探針DNA2用二次蒸餾水稀釋成15nmol/L;將識(shí)別探針DNA2加入到納米顆粒懸浮 的PBS溶液中，35-40'C下于震蕩培養(yǎng)箱中反應(yīng)2.5-3.5h，反應(yīng)完成后，離心，洗滌；然后 將連接有DNA2的納米顆粒分散于PBS緩沖液中，備用。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種用于檢測(cè)病原微生物的長(zhǎng)壽命發(fā)光納米生物探針的制備方法，其特征在于，將稀土氧化物氧化銪EU203溶于濃鹽酸中或稀土氧化物氧化鋱Tb407溶于高氯酸中。
7、 權(quán)利要求1或2或3所述的一種用于檢測(cè)病原微生物的長(zhǎng)壽命發(fā)光納米生物探針 的檢測(cè)方法，其特征在于a、 雜交，連有長(zhǎng)壽命發(fā)光納米顆粒的識(shí)別探針DNAi與待檢測(cè)的病原微生物基因片 段目標(biāo)探針DNA3在玻璃芯片雜交；b、 雜交處理，清洗后，帶有長(zhǎng)壽命發(fā)光納米顆粒標(biāo)記的識(shí)別探針DNA2，待檢測(cè)的 病原微生物基因片段目標(biāo)探針DNA3和捕獲探針DNAi形成雜交體，檢測(cè)在激光激發(fā)下產(chǎn) 生的光信號(hào)。
8、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種用于檢測(cè)病原微生物的長(zhǎng)壽命發(fā)光納米生物探針的檢 測(cè)方法，其特征在于，所述的a步的雜交步驟的過(guò)程為首先將目標(biāo)探針DNA3用二次蒸餾水稀釋到15^mol/L;將上述DN^修飾的玻璃芯片 放入雜交盒中，在玻片周圍滴加l(M 3xSSC來(lái)維持濕度；將DNA2和DNA3樣品滴加到玻 片上，蓋上蓋玻片，趕走氣泡；蓋上雜交盒，將其放入震蕩培養(yǎng)箱中恒溫箱38.3。C中雜交 24h;用配制好的雜交后清洗液1: lxSSC/0.03% SDS、洗液2: 0.2xSSC和洗液3: 0.05xSSC; 讓玻片一直留在洗液里輕輕從洗液中提起玻片，放入，再提起，來(lái)回上下清洗幾次。
9、 根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的納米長(zhǎng)壽命發(fā)光生物探針的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的6步的步驟為雜交處理，清洗后，帶有納米顆粒標(biāo)記的識(shí)別DNA2,目標(biāo)DNA3 和捕獲DNA探針形成一個(gè)雜交體，在激光激發(fā)下產(chǎn)生一個(gè)光信號(hào)，檢測(cè)出了玻片上的稀 土長(zhǎng)壽命發(fā)光配合物納米顆粒的光信號(hào)激發(fā)和發(fā)射狹縫分別為8.0nm，延遲時(shí)間0.1ms， 門時(shí)間1.0ms;從而根據(jù)檢測(cè)的光信號(hào)檢測(cè)樣品中待測(cè)病原微生物的存在與否。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于檢測(cè)病原微生物的長(zhǎng)壽命發(fā)光納米生物探針及其制備和檢測(cè)方法。制備了用于納米探針制備的長(zhǎng)壽命發(fā)光納米顆粒，設(shè)計(jì)合成玻璃芯片上的捕獲探針DNA₁、連接在長(zhǎng)壽命發(fā)光納米顆粒上的識(shí)別探針DNA₂及病原微生物基因片段的目標(biāo)探針DNA₃，構(gòu)建了類似三明治結(jié)構(gòu)的檢測(cè)模型。利用了長(zhǎng)壽命發(fā)光納米顆粒能有效消除生物體系內(nèi)源熒光和背景信號(hào)的干擾，以及納米技術(shù)的高靈敏性、穩(wěn)定性與信號(hào)轉(zhuǎn)換功能等優(yōu)點(diǎn)，本發(fā)明的檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便、成本低、靈敏度和特異性高、穩(wěn)定性好。
文檔編號(hào)G01N21/64GK101382491SQ20081014328
公開日2009年3月11日 申請(qǐng)日期2008年9月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月25日
發(fā)明者博 彭, 曾光明, 琳 湯, 牛承崗, 秦品珠, 敏 阮 申請(qǐng)人:湖南大學(xué)