專(zhuān)利名稱(chēng)：對(duì)微囊藻毒素－lr進(jìn)行化學(xué)修飾并合成完全抗原的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于免疫檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及對(duì)微囊藻毒素-LR分子合成完全抗原的方法。
背景技術(shù)：
微囊藻毒素-LR(Microcystin-LR，簡(jiǎn)稱(chēng)MC-LR)是目前已知急性毒性最強(qiáng)、危害最大的一種淡水藍(lán)藻毒素。微囊藻毒素是一組環(huán)狀七肽，其中微囊藻毒素-LR的分子結(jié)構(gòu)式如下 目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)微囊藻毒素各種異構(gòu)體有60多種，其變化主要在于第2位和第4位上2個(gè)L-氨基酸的不同，如MC-LR這2個(gè)位置上的氨基酸分別為亮氨酸和精氨酸(見(jiàn)上式中的序號(hào)2和4)。研究發(fā)現(xiàn)，第5位氨基酸Adda對(duì)微囊藻毒素的毒性是必需的，其共軛立體結(jié)構(gòu)會(huì)影響其毒性，結(jié)構(gòu)改變則毒性改變。
免疫檢測(cè)技術(shù)的關(guān)鍵在于獲得特異性和親和力良好的抗體，而抗體的這2個(gè)主要特性很大程度上取決于抗原的性質(zhì)；微囊藻毒素-LR分子量為1000左右，本身不具備免疫原性，屬于半抗原，只有與大分子物質(zhì)連接合成完全抗原才能促使機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，從而獲得抗體。合成并純化免疫性能良好的MC-LR完全抗原是非常關(guān)鍵的技術(shù)環(huán)節(jié)。
一般來(lái)說(shuō)，連接位點(diǎn)應(yīng)選擇對(duì)免疫來(lái)說(shuō)最不重要的區(qū)域，而將抗原決定簇基團(tuán)(致毒基團(tuán))暴露在外面，因?yàn)榭贵w對(duì)遠(yuǎn)離連接位點(diǎn)的基團(tuán)的識(shí)別能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于鄰近連接位點(diǎn)的基團(tuán)的識(shí)別能力。
目前大多數(shù)研究(制備微囊藻毒素-LR的抗體)的連接位點(diǎn)都是選擇MC-LR第3位的D-MeAsp或第6位的D-Glu。利用其羧基只接與載體蛋白相連，不通過(guò)化學(xué)修飾。這樣帶來(lái)的后果是由此產(chǎn)生的抗體只能識(shí)別帶有Adda氨基酸的藻毒素，而不能將各種微囊藻毒素區(qū)別開(kāi)來(lái)，從而不能很好的應(yīng)用于免疫檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為克服已有技術(shù)的不足之處，提出一種對(duì)微囊藻毒素-LR分子進(jìn)行化學(xué)修飾并合成完全抗原的方法，本方法選擇第7位氨基酸Mdha作為連接位點(diǎn)，Mdha遠(yuǎn)離致毒基團(tuán)Adda，因而抗體能夠有效的識(shí)別出微囊藻毒素和節(jié)球藻毒素；而且遠(yuǎn)離兩個(gè)可變的氨基酸，因而能夠識(shí)別出微囊藻毒素的各種異構(gòu)體，可提高微囊藻毒素-LR抗體的特異性。
本發(fā)明提出的一種對(duì)微囊藻毒素-LR分子進(jìn)行化學(xué)修飾并合成完全抗原的方法，包括對(duì)微囊藻毒素-LR的化學(xué)修飾和用戊二醛1步法合成完全抗原兩部分，所述對(duì)微囊藻毒素-LR的化學(xué)修飾方法的具體步驟如下1)將2-巰基乙胺和MC-LR按照大摩爾比(1000～5000)∶1充分混和在pH＝8.0～10.0的堿性碳酸鹽緩沖液中；混合均勻，在40℃～60℃反應(yīng)1～2小時(shí)；2)反應(yīng)完畢，降到室溫(20℃～30℃)，加入與2-巰基乙胺等摩爾的乙酸使反應(yīng)停止，得到中間產(chǎn)物H2N-etMC-LR；3)采用固相萃取技術(shù)對(duì)該中間產(chǎn)物進(jìn)行純化；所述用戊二醛1步法合成完全抗原方法的具體步驟如下4)將所獲得的純化后的中間產(chǎn)物溶于緩沖溶液中，使其在溶液中的濃度為0.1～1mg/mL；5)按中間產(chǎn)物戊二醛摩爾比為1∶(5～20)加入適量戊二醛，劇烈振搖，充分搖勻后，按中間產(chǎn)物BSA摩爾比10～15∶1加入BSA溶液，充分混合，反應(yīng)12小時(shí)以上；6)反應(yīng)完畢，混合物在PBS中透析24小時(shí)以上，得到微囊藻毒素-LR的完全抗原。
上述采用固相萃取技術(shù)的純化方法，采用C18固相萃取柱，具體步驟如下活化用甲醇活化C18柱，并用高純水調(diào)整，分為2～3次使用；上樣將水樣以5～10mL/min的流速流過(guò)固相萃取柱進(jìn)行富集濃縮。重力過(guò)濾；淋洗裝樣完畢后，用1～10％甲醇水溶液淋洗以凈化樣品，分為2～4次使用；洗脫待固相萃取柱吹干后，用甲醇(分為多次)將微囊藻毒素洗脫并收集。
本發(fā)明的特點(diǎn)及技術(shù)效果本方法選擇第7位氨基酸Mdha作為連接位點(diǎn)，Mdha遠(yuǎn)離致毒基團(tuán)Adda，因而抗體能夠有效的識(shí)別出微囊藻毒素和節(jié)球藻毒素；而且遠(yuǎn)離兩個(gè)可變的氨基酸，因而能夠識(shí)別出微囊藻毒素的各種異構(gòu)體，可提高微囊藻毒素-LR抗體的特異性。
本發(fā)明利用2-巰基乙胺在上述第7位氨基酸的雙鍵處引入1個(gè)氨基，通過(guò)它與載體蛋白連接；并通過(guò)SPE固相萃取技術(shù)來(lái)純化中間產(chǎn)物；通過(guò)MS測(cè)定產(chǎn)物的分子量從而鑒定修飾是否成功。
本發(fā)明偶聯(lián)劑的選擇在上述對(duì)MC-LR進(jìn)行氨基修飾后(修飾產(chǎn)物)，用戊二醛作為偶聯(lián)劑，采用戊二醛一步法將MC-LR。戊二醛是一種雙功能偶聯(lián)試劑，能通過(guò)它兩端的醛基將2個(gè)自由氨基合成到一塊。通過(guò)戊二醛合成還可為多肽和載體蛋白之間提供一段非常靈活的長(zhǎng)鏈，使它們之間有較大的空間，從而將半抗原充分暴露在外面，形成有利的免疫表位，進(jìn)而達(dá)到良好的免疫效果。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1首先進(jìn)行微囊藻毒素-LR的氨基修飾，具體步驟如下將0.5mg MC-LR溶于2ml 0.1M pH＝9的碳酸鹽緩沖液中；稱(chēng)取60.4mg 2-巰基乙胺加入上述溶液中?；旌衔锍浞謸u勻，在40℃反應(yīng)2小時(shí)；反應(yīng)完畢，降到室溫20℃，加入與2-巰基乙胺等摩爾的乙酸使反應(yīng)停止，得到中間產(chǎn)物H2N-etMC-LR；采用固相萃取技術(shù)純化中間產(chǎn)物，材料為500mg 6mL C18BondElut cartridge；再用戊二醛1步法合成完全抗原，具體步驟如下將所獲得的中間產(chǎn)物(含MC-LR約0.5mg)溶于3mL 0.01mol/LpH7.4的PBS中(預(yù)先加入3％v/v的甲醇methanol，即加入100uL甲醇)；按MC-LR∶戊二醛摩爾比為5∶1加入適量0.1％的戊二醛，劇烈振搖，按MC-LR∶BSA摩爾比10∶1加入1mg/mL的BSA溶液5mL，充分混合，4℃振蕩16小時(shí)；反應(yīng)完畢，混合物在PBS中透析24小時(shí)，4℃，(8小時(shí)換一次，共3次；每次用PBS 2L)；上述采用固相萃取技術(shù)的純化方法，具體步驟如下活化用4mL甲醇活化，并用6mL高純水調(diào)整，分為2～3次使用；上樣將水樣以5～10mL/min的流速流過(guò)固相萃取柱進(jìn)行富集濃縮。重力過(guò)濾；淋洗裝樣完畢后，用5％甲醇水溶液6mL淋洗以凈化樣品，分為3次使用；洗脫待固相萃取柱吹干后，以4mL甲醇(分為2次)將微囊藻毒素洗脫并收集。
中間產(chǎn)物的鑒定采用MS儀測(cè)定主要產(chǎn)物的分子量。
MC-LR的修飾及純化結(jié)果對(duì)于修飾后的MC-LR，為了證實(shí)引進(jìn)游離的巰基乙胺是否成功，本研究利用質(zhì)譜儀MS測(cè)定目標(biāo)產(chǎn)物(中間產(chǎn)物)的分子量。將2-巰基乙胺與MC-LR按照摩爾比3000∶1反應(yīng)，固相萃取純化后，用甲醇洗脫，MS測(cè)定值為1072.7；主要產(chǎn)物的理論分子量為MC-LR與H2N-CH2CH2-SH的分子量之和，即1072.2，二者基本一致。結(jié)果表明，氨基修飾是成功的。對(duì)于合成抗原的鑒定，本實(shí)施例采用了紫外掃描技術(shù)。
對(duì)于合成抗原的鑒定，本實(shí)施例采用了紫外掃描技術(shù)。
合成完全抗原的定性分析對(duì)BSA，MC-LR及完全抗原的紫外掃描曲線顯示完全抗原和BSA同樣在280nm處有吸收峰；而238nm是MC-LR的吸收峰，完全抗原紫外掃描結(jié)果在238nm附近發(fā)生明顯的紅移，從而可以判斷，合成是有效的。
實(shí)施例2首先進(jìn)行微囊藻毒素-LR的氨基修飾，具體步驟如下將1.0mg MC-LR溶于2ml 0.1M pH＝9的碳酸鹽緩沖液中；稱(chēng)取500mg 2-巰基乙胺加入上述溶液中?；旌衔锍浞謸u勻，在60℃反應(yīng)1小時(shí)；反應(yīng)完畢，降到室溫25℃，加入與2-巰基乙胺等摩爾的乙酸使反應(yīng)停止；用500mg 6ml C18BondElut cartridge純化中間產(chǎn)物；再來(lái)用戊二醛1步法合成完全抗原，具體步驟如下將所獲得的中間產(chǎn)物(含MC-LR約1.0mg)溶于3mL 0.01mol/L pH7.4的PBS中(預(yù)先加入3％v/v的甲醇methanol，即加入100uL甲醇)；按MC-LR∶戊二醛摩爾比為15∶1加入適量0.1％的戊二醛，劇烈振搖；按MC-LR∶BSA摩爾比20∶1加入1mg/mL的BSA溶液5mL，充分混合，4℃振蕩20小時(shí)；反應(yīng)完畢，混合物在PBS中透析24小時(shí)，4℃。
對(duì)于合成抗原的鑒定采用多電荷生物質(zhì)譜技術(shù)將所獲得的完全抗原純化、脫鹽后，利用API3000液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定的質(zhì)譜圖顯示BSA分子量為66463.0，每連接上1個(gè)中間產(chǎn)物分子，分子量增加1000左右。從完全抗原的質(zhì)譜圖可以發(fā)現(xiàn)，分子量分布從66000一直到73000，合成比在3～8之間的完全抗原是存在的，未參與合成的BSA信號(hào)較小。
權(quán)利要求
1.一種對(duì)微囊藻毒素-LR分子進(jìn)行化學(xué)修飾并合成完全抗原的方法，包括對(duì)微囊藻毒素-LR的化學(xué)修飾和用戊二醛1步法合成完全抗原兩部分；所述對(duì)微囊藻毒素-LR的化學(xué)修飾方法的具體步驟如下1)將2-巰基乙胺和MC-LR按照大摩爾比(1000～5000)∶1充分混和在pH＝8.0～10.0的堿性碳酸鹽緩沖液中；混合均勻，在40℃～60℃反應(yīng)1～2小時(shí)；2)反應(yīng)完畢，降到室溫，加入與2-巰基乙胺等摩爾的乙酸使反應(yīng)停止，得到中間產(chǎn)物H2N-etMC-LR；3)采用固相萃取技術(shù)對(duì)該中間產(chǎn)物進(jìn)行純化；所述用戊二醛1步法合成完全抗原方法的具體步驟如下4)將所獲得的純化后的中間產(chǎn)物溶于緩沖溶液中，使其在溶液中的濃度為0.1～1mg/mL；5)按中間產(chǎn)物∶戊二醛摩爾比為1∶(5～20)加入適量戊二醛，劇烈振搖，充分搖勻后，按中間產(chǎn)物∶BSA摩爾比10～15∶1加入BSA溶液，充分混合，反應(yīng)12小時(shí)以上；6)反應(yīng)完畢，混合物在PBS中透析24小時(shí)以上，得到微囊藻毒素-LR的完全抗原。
2.如權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述采用固相萃取技術(shù)的純化方法，采用C18固相萃取柱，具體步驟如下活化用甲醇活化C18柱，并用高純水調(diào)整，分為2～3次使用；上樣將水樣以5～10mL/min的流速流過(guò)固相萃取柱進(jìn)行富集濃縮。重力過(guò)濾；淋洗裝樣完畢后，用1～10％甲醇水溶液淋洗以凈化樣品，分為2～4次使用；洗脫待固相萃取柱吹干后，用甲醇將微囊藻毒素洗脫并收集。
全文摘要
本發(fā)明涉及對(duì)微囊藻毒素－LR進(jìn)行化學(xué)修飾并合成完全抗原的方法，屬于免疫檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，包括對(duì)微囊藻毒素－LR的化學(xué)修飾和用戊二醛1步法合成完全抗原兩部分；本方法選擇第7位氨基酸Mdha作為連接位點(diǎn)，Mdha遠(yuǎn)離致毒基團(tuán)Adda，因而抗體能夠有效的識(shí)別出微囊藻毒素和節(jié)球藻毒素；而且遠(yuǎn)離兩個(gè)可變的氨基酸，因而能夠識(shí)別出微囊藻毒素的各種異構(gòu)體，可提高微囊藻毒素－LR抗體的特異性。
文檔編號(hào)G01N33/531GK1603827SQ20041009607
公開(kāi)日2005年4月6日 申請(qǐng)日期2004年11月29日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月29日
發(fā)明者何苗, 盛建武, 施漢昌 申請(qǐng)人:清華大學(xué)