專利名稱：一種同時(shí)檢測(cè)血或尿中多種酚酸類化合物的測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種同時(shí)檢測(cè)血或尿中多種酚酸類化合物的方法，更具體是涉及一種可同時(shí)對(duì)血樣及尿樣中的六種水溶性酚酸類化合物進(jìn)行定量測(cè)定的液相色譜一串連質(zhì)譜(LC-MS/MS)方法。
背景技術(shù)：
丹酚酸B、迷迭香酸、紫草酸、丹參素、原兒茶醛、咖啡酸是存在于唇形科(Labiatae)鼠尾草屬(Salvia)植物丹參(Salvia miltiorrhiza Bge.)、南丹參(S.Bowleyana Dunn)等多種植物中的水溶性酚酸類化合物。近年來研究發(fā)現(xiàn)丹酚酸B等水溶性酚酸類化合物具有強(qiáng)烈的抗氧化作用(例如丹酚酸B的抗氧化作用約為維生素E的1000倍)和清除氧自由基作用，對(duì)多種心、腦血管疾病及肝、腎功能損傷和肺纖維化等組織器官的病變均有明顯的保護(hù)作用，業(yè)已得到人們?nèi)找鎻V泛的關(guān)注。由于對(duì)水溶性酚酸類化合物的研究起步較晚，有關(guān)其含量測(cè)定的報(bào)道并不多見。上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院采用反相高效液相色譜法對(duì)藥材中所含有的丹酚酸B進(jìn)行了定量測(cè)定，但靈敏度低，且只能檢測(cè)一種化合物(Zhang H et al.Acta Pharmacol Sin 2002；231163-68.)。
研究表明，丹酚酸B等水溶性酚酸類化合物作為一種強(qiáng)抗氧劑，其本身化學(xué)結(jié)構(gòu)并不太穩(wěn)定。在加溫、光照、潮濕和暴露在空氣的條件下，會(huì)發(fā)生明顯的降解，因此樣品預(yù)處理難度大。血清(或血漿)及尿樣中水溶性酚酸類化合物的定量測(cè)定具有靈敏度要求高，樣品預(yù)處理復(fù)雜等特點(diǎn)，國外曾有報(bào)道采用高效液相色譜法對(duì)血漿中的丹酚酸B進(jìn)行檢測(cè)(Zhang et al.Planta Med 2004；70(2)138-42.)。有關(guān)采用液相色譜質(zhì)譜法同時(shí)對(duì)多種酚酸類化合物進(jìn)行定量檢測(cè)，迄今未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中預(yù)處理操作復(fù)雜，不能同時(shí)測(cè)定多種酚酸類化合物的缺陷，提供一種可快速而有效地定量檢測(cè)出血或尿中多種酚酸類化合物含量的液相色譜-串連質(zhì)譜(LC-MS/MS)方法。
本發(fā)明建立的LC-MS/MS檢測(cè)方法采用一次色譜過程分析血尿中包括丹酚酸B、迷迭香酸、紫草酸、丹參素、原兒茶醛、咖啡酸在內(nèi)的6種酚酸類化合物的含量。本發(fā)明方法的特點(diǎn)為采用內(nèi)標(biāo)法定量，內(nèi)標(biāo)物為氯霉素。采用鍵合相硅膠為固定相，以甲醇或乙腈或甲醇與乙腈的混合液/甲酸水溶液或乙酸水溶液或三氟乙酸水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行反相色譜-等度或梯度分離。本發(fā)明方法根據(jù)酚酸類化合物的理化特性，對(duì)血樣的預(yù)處理采用酸化后用有機(jī)相提取的液-液萃取方法。對(duì)尿樣則采用水稀釋后高速離心的預(yù)處理方法。
本發(fā)明方法包括以下步驟一、樣品處理1、血樣的處理采用液-液萃取法，其操作步驟為取適量血樣，添加內(nèi)標(biāo)溶液，加入酸化劑酸化，使樣品溶液pH達(dá)到1-6，加入相當(dāng)于待提取溶液體積1-10倍量的有機(jī)溶劑萃取后旋渦混合提取，16000g離心2min，取有機(jī)相氮?dú)獯蹈?，?0-200μl水溶液或有機(jī)酸水溶液(如丙酮水溶液、甲醇水溶液、乙腈水溶液等)溶解殘?jiān)筮M(jìn)樣供LC-MS/MS進(jìn)樣測(cè)定。本預(yù)處理方法中，血樣的用量一般為50-200μl；內(nèi)標(biāo)溶液可采用含氯霉素10-200ng/ml的水溶液，用量一般為10-200μl；酸化劑為濃度為10-50％(V/V)的有機(jī)酸水溶液，其中有機(jī)酸可采用甲酸、乙酸、三氯乙酸等；旋渦提取的時(shí)間為1-10min；優(yōu)選使用的有機(jī)萃取劑包括乙酸乙酯、甲酸乙酯、乙酸甲酯、丙酮、乙腈、特丁基甲醚或甲醇。
2、尿樣的處理采用水稀釋后高速離心的方法，其操作步驟為取尿樣10μl，準(zhǔn)確加入10μl內(nèi)標(biāo)工作溶液和80μl水混旋，經(jīng)高速離心(16000r/min×2min)后取上層溶液進(jìn)樣。
二、液相分離1、流動(dòng)相由A和B組成，pH為1-6，流速為0.2ml/min。其中A指甲醇或乙腈或乙腈與甲醇的等體積比混合液，B指濃度為0.01～1％(V/V)的甲酸水溶液或乙酸水溶液或三氟乙酸水溶液。
2、色譜柱采用細(xì)口徑硅膠鍵合相填料柱，如C18柱、C8柱、氰基柱等鍵，色譜柱的內(nèi)徑為1.0-3.0mm；長(zhǎng)度為30-100mm。
3、洗脫方法采用等度或梯度洗脫方法。采用等度洗脫方法時(shí)，流動(dòng)相的組成為(以體積百分比計(jì))A30～60％、B70～40％；采用梯度洗脫方法時(shí)，流動(dòng)相的組成為(以體積百分比計(jì))A60～10％、B40～90％。洗脫梯度根據(jù)不同的鍵合相色譜柱進(jìn)行設(shè)計(jì)和調(diào)整，對(duì)于C18鍵合相色譜柱，當(dāng)A為乙腈、B為0.5％(V/V)甲酸水溶液時(shí)可參考下列方法進(jìn)行梯度(以體積百分比計(jì)算)0～1.0min，A15％、B85％；1.0～2.5min，A15～30％、B85～70％；2.5～4.0min，A30％、B70％；4.0～7.0min，A30～15％、B70～85％；7.0～9.0min，A15％、B85％。
三、質(zhì)譜檢測(cè)質(zhì)譜條件為采用電噴霧離子源，負(fù)離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描。霧化氣壓力10L/min，氣簾氣壓力10L/min，輔助氣流速12L/min，電噴霧電壓-4500V，離子源溫度450℃，離子選擇通道(Q1/Q3m/z)分別為丹酚酸B 717.2/519.2、迷迭香酸359.1/160.6、紫草酸537.5/493.3、丹參素197.1/134.3、原兒茶醛137.1/107.9、咖啡酸179.3/134.9、氯霉素321.3/151.4(內(nèi)標(biāo))。以上各化合物離子通道范圍可為±1.0amu。
四、濃度計(jì)算方法和檢測(cè)限按內(nèi)標(biāo)法以峰面積或峰高法計(jì)算出樣品中6種酚酸類化合物的濃度。
本發(fā)明方法的檢測(cè)限為0.1～2.0ng/mL(信噪比≥3)；線性范圍8～2048ng/ml，相關(guān)系數(shù)r在0.995以上；日內(nèi)及日間精密度≤15％；各化合物的絕對(duì)回收率在60～90％。
有益效果1、本發(fā)明方法可同時(shí)對(duì)血或尿中多種酚酸類化合物進(jìn)行定量測(cè)定，以內(nèi)標(biāo)法定量，可對(duì)包括樣品預(yù)處理、色譜分離和質(zhì)譜檢測(cè)在內(nèi)的樣品分析的全過程進(jìn)行校正。
2、本發(fā)明方法對(duì)樣品的檢測(cè)專一性強(qiáng)、靈敏度高，操作簡(jiǎn)便，各項(xiàng)方法學(xué)指標(biāo)均能可靠地滿足檢測(cè)血清或尿中多種酚酸類化合物的需要。
3、本發(fā)明方法根據(jù)酚類化合物的理化性質(zhì)和LC-MS/MS特性所設(shè)計(jì)的樣品處理方法簡(jiǎn)便，血樣品經(jīng)一次液-液萃取法就可使其中的化合物得到凈化，采用細(xì)口徑的色譜柱和等度洗脫實(shí)現(xiàn)了酚酸類化合物的快速色譜分離。


圖1表示等度洗脫條件下6種酚酸類化合物及內(nèi)標(biāo)水溶液的整體碎片離子掃描圖，其中圖1-a表示丹酚酸B的圖譜；1-b表示迷迭香酸的圖譜；圖1-c表示紫草酸的圖譜；圖1-d表示原兒茶醛的圖譜；圖1-e表示咖啡酸的圖譜；圖1-f表示丹參素的圖譜；圖1-g表示氯霉素的圖譜。
圖2等度洗脫條件下血樣中6種酚酸類化合物及內(nèi)標(biāo)的整體色譜圖，其中圖2-a表示丹酚酸B的圖譜；2-b表示迷迭香酸的圖譜；圖2-c表示紫草酸的圖譜；圖2-d表示咖啡酸的圖譜；圖2-e表示原兒茶醛的圖譜；圖2-f表示丹參素的圖譜；圖2-g表示氯霉素的圖譜。
圖3梯度洗脫條件下血樣中6種酚酸類化合物及內(nèi)標(biāo)的整體色譜圖，其中圖3-a表示丹酚酸B的圖譜；3-b表示迷迭香酸的圖譜；圖3-c表示紫草酸的圖譜；圖3-d表示咖啡酸的圖譜；圖3-e表示原兒茶醛的圖譜；圖3-f表示丹參素的圖譜；圖3-g表示氯霉素的圖譜。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但不限制本發(fā)明。
實(shí)施例1材料1.1儀器和材料API3000串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)；Angilen 1100系列液相色譜儀，包括在線脫氣儀、四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器；XW-80旋渦混合器(上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠)；TGL·16G臺(tái)式高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。色譜柱CAPCELL PAK C18柱(MG.5μm，100mm×2.0mm(i.d))及CAPCELLPAK C18柱(MG.5μm，50mm×2.0mm(i.d))1.2藥品與試劑丹酚酸B、迷迭香酸、紫草酸、丹參素、原兒茶醛、咖啡酸純品，各含量＞99％，上海藥物研究所制備。
1.3儲(chǔ)備液1.3.1對(duì)照品儲(chǔ)備液6種酚酸類化合物各10.0mg，混合后加入10mL的甲醇溶液，成為各含量均為1.0mg/mL的甲醇溶液，-20℃儲(chǔ)備。使用時(shí)用水稀釋。
化學(xué)品標(biāo)準(zhǔn)曲線為80，160，320，640，1280，2560，5120，10240，20480ng/ml，質(zhì)控樣品濃度為80，200，8000，16000ng/ml。
1.3.2內(nèi)標(biāo)液1.0μg/ml氯霉素水溶液。
1.4血樣及尿樣取上述10μL化學(xué)品溶液，加入90μL空白血樣，得到濃度為8，16，32，64，128，256，512，1024，2048ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)曲線血樣及濃度為8，20，800，1600ng/ml的質(zhì)控血樣。
取上述10μL化學(xué)品溶液，加入90μL空白尿樣，得到濃度為8，16，32，64，128，256，512，1024，2048ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)曲線尿樣及濃度為8，20，800，1600ng/ml的質(zhì)控尿樣。
2方法2.1樣品預(yù)處理方法2.1.1血樣處理取100μl標(biāo)準(zhǔn)曲線及質(zhì)控血樣置于2ml試管中，準(zhǔn)確加入10μl氯霉素內(nèi)標(biāo)工作溶液，加入200μl含70％(V/V)丙酮的水溶液(另含有2％V/V甲酸)和1ml乙酸乙酯，在旋渦混合器旋渦混合1.5min，以16000r/min離心2min，吸取上層有機(jī)相轉(zhuǎn)入另-2ml試管中，用氮?dú)獯蹈蓛x在35℃吹干，加入100μl含25％丙酮的水溶液溶解，以16000r/min離2min，取上清液進(jìn)樣。
2.1.2尿樣處理取標(biāo)準(zhǔn)曲線及質(zhì)控尿樣10μl，準(zhǔn)確加入10μl內(nèi)標(biāo)工作溶液和80μl水混旋，經(jīng)高速離心(16000r/min×2min)后取上層溶液進(jìn)樣。
2.2儀器條件2.2.1液相色譜條件流動(dòng)相A.乙腈-甲醇(v∶v，1∶1)；B.0.5％(v∶v)甲酸水溶液。
流速0.20mL/min；進(jìn)樣量5μl。
2.2.1.1等度洗脫A∶B＝0.104∶0.96(v∶v)色譜柱CAPCELL PAK C18，5μm，100×2.0mm；2.2.1.2梯度洗脫(以體積百分比計(jì)算)0～1.0min，A15％、B85％；1.0～2.5min，A15～30％、B85～70％；2.5～4.0min，A30％、B70％；4.0～7.0min，A30～15％、B70～85％；
7.0～9.0min，A15％、B85％。
色譜柱CAPCELL PAK C18，5μm，50×2.0mm；2.2.2質(zhì)譜條件采用電噴霧離子源，負(fù)離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)。霧化氣壓力(NEB)10L/min，氣簾氣壓力(CUR)10L/min，輔助氣流速(CAD)12L/min，電噴霧電壓(IS)-4500V，離子源溫度(TEM)450℃。定量離子對(duì)和測(cè)定參數(shù)見表1表1

注DP去簇電壓；FP聚焦電壓；EP進(jìn)口電壓；CE碰撞能量；CXP碰撞池進(jìn)口能量2.3工作曲線按內(nèi)標(biāo)法以峰面積或峰高法計(jì)算出樣品中各種酚酸類化合物的濃度。以添加濃度為X軸，樣品與內(nèi)標(biāo)物的峰面積或峰高法比為Y軸，進(jìn)行線性回歸，經(jīng)“1/X”權(quán)重得回歸方程。
2.4精密度和回收率根據(jù)質(zhì)控樣品，分別測(cè)定批內(nèi)、批間精密度，計(jì)算相對(duì)回收率。絕對(duì)回收率由質(zhì)控樣品的峰面積比上相同濃度的化學(xué)品峰面積來計(jì)算。檢測(cè)限要求信噪比(S/N)≥3。
3檢測(cè)結(jié)果等度洗脫時(shí)保留時(shí)間為丹酚酸B 2.52min、迷迭香酸2.28min、紫草酸2.27min、咖啡酸1.89min、原兒茶醛1.91min、丹參素1.63min、氯霉素(內(nèi)標(biāo))2.85min。血樣中6種酚酸類化合物色譜峰見圖2，其中6種酚酸類化合物濃度為64ng/mL，氯霉素為100ng/mL。
梯度洗脫時(shí)保留時(shí)間為丹酚酸B 5.91min、迷迭香酸5.16min、紫草酸4.62min、咖啡酸2.20min、原兒茶醛1.75min、丹參素1.09min、氯霉素(內(nèi)標(biāo))4.62min。血樣中6種酚酸類化合物色譜峰見圖3。其中6種酚酸類化合物濃度為64ng/mL，氯霉素為100ng/mL。
樣品中各種酚酸類化合物的檢測(cè)限為0.1-2.0ng/ml(信噪比≥3)。日內(nèi)及日間標(biāo)準(zhǔn)差在10％以內(nèi)，相對(duì)回收率在85％-120％，各酚酸類化合物提取回收率為60％-90％。具體結(jié)果見表2。
表2血樣檢測(cè)統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

權(quán)利要求
1.一種同時(shí)檢測(cè)血或尿中多種酚酸類化合物的測(cè)定方法，包括樣品處理、液相分離、質(zhì)譜檢測(cè)三個(gè)步驟，其特征在于該方法對(duì)血樣預(yù)處理采用酸化后用有機(jī)相提取的液-液萃取方法；尿樣預(yù)處理采用水稀釋后高速離心的方法；采用內(nèi)標(biāo)法定量，內(nèi)標(biāo)物為氯霉素；采用硅膠鍵合相填料的細(xì)徑液相色譜柱，流動(dòng)相由A和B組成，pH為1-6，其中A指甲醇或乙腈或乙腈與甲醇的等體積比混合液，B指濃度為0.01～1％(V/V)的甲酸水溶液或乙酸水溶液或三氟乙酸水溶液，作等度或梯度洗脫分離；質(zhì)譜檢測(cè)采用電噴霧離子源，負(fù)離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的同時(shí)檢測(cè)血或尿中多種酚酸類化合物的測(cè)定方法，其特征在于負(fù)離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描分析時(shí)，各酚酸類化合物的離子選擇通道(Q1/Q3m/z)分別為丹酚酸B鎂309.6/281.3、迷迭香酸304.5/181.9、紫草酸300.6/183.2、丹參素285.5/154.1、原兒茶醛295.5/267.0、咖啡酸314.3/268.2、氯霉素(內(nèi)標(biāo))321/151。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的同時(shí)檢測(cè)血或尿中多種酚酸類化合物的測(cè)定方法，其特征在于血樣預(yù)處理使用的酸化劑為濃度為10％-50％(v/v)的有機(jī)酸水溶液，酸化后樣品溶液的pH為1-6，萃取劑包括乙酸乙酯、甲酸乙酯、乙酸甲酯、丙酮、乙腈、特丁基甲醚、甲醇。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的同時(shí)檢測(cè)血或尿中多種酚酸類化合物的測(cè)定方法，其特征在于血樣預(yù)處理使用的酸化劑為甲酸水溶液、乙酸水溶液、三氯乙酸水溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的同時(shí)檢測(cè)血或尿中多種酚酸類化合物的測(cè)定方法，其特征在于色譜柱長(zhǎng)度為30-100mm，內(nèi)徑為1.0-3.0mm。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的同時(shí)檢測(cè)血或尿中多種酚酸類化合物的測(cè)定方法，其特征在于等度洗脫時(shí)流動(dòng)相的組成為(以體積百分比計(jì))A 30～60％、B70～40％；梯度洗脫時(shí)，流動(dòng)相的組成為(以體積百分比計(jì))A 60～10％、B40～90％。
全文摘要
一種同時(shí)檢測(cè)血或尿中多種酚酸類化合物的液相色譜—串連質(zhì)譜測(cè)定方法，其特點(diǎn)為采用鍵合相硅膠為固定相，以甲醇或乙腈或甲醇與乙腈的混合液/甲酸水溶液或乙酸水溶液或三氟乙酸水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行反相色譜—等度或梯度分離。定量采用內(nèi)標(biāo)法，內(nèi)標(biāo)物為氯霉素。對(duì)血樣采用酸化后的用有機(jī)相提取的預(yù)處理方法。采用本法可簡(jiǎn)便、可靠地對(duì)血或尿中的6種酚酸類化合物進(jìn)行定量檢測(cè)，各項(xiàng)方法學(xué)指標(biāo)均能可靠地滿足檢測(cè)血清或尿中多種酚酸類化合物的需要。
文檔編號(hào)G01N30/06GK1763526SQ20041008784
公開日2006年4月26日 申請(qǐng)日期2004年10月22日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月22日
發(fā)明者李小川, 余琛, 劉罡一, 賈晶瑩, 王逸平 申請(qǐng)人:上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院