專利名稱：氟苯尼考及其代謝物檢測(cè)裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于食品安全檢測(cè)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及一種檢測(cè)動(dòng)物源性食品中氟苯尼考及其代謝物殘留量的檢測(cè)裝置。
技術(shù)背景氟苯尼考是一類專門用于動(dòng)物保健市場(chǎng)的新型抗革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌及甲砜霉素耐藥菌的廣譜抗生素。由于其抗菌作用明顯，且價(jià)格低廉，被廣泛應(yīng)用于各類家禽、家畜、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)及蜂產(chǎn)品的各種傳染性疾病的治療。氟苯尼考能通過胎盤屏障，有胚胎毒性，氟苯尼考的代謝物氟苯尼考胺，在食品中的殘留易導(dǎo)致潛在再生障礙性貧血。氟苯尼考(Florfenicol)，又稱氟甲砜霉素，其化學(xué)名稱為D(+)_蘇-I-對(duì)甲砜基苯基-2- 二氯乙酰氨基-5氟丙醇，是氯霉素類廣譜抗菌藥物中甲砜霉素的3位氟衍生物，對(duì)多種革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌及支原體等作用明顯。繁殖毒性試驗(yàn)證實(shí)，氟苯尼考能通過胎盤屏障，有胚胎毒性，使F1代雄鼠附睪重量明顯減輕，F(xiàn)2幼子的哺乳指標(biāo)降低，存活率降低，所以哺乳期、懷孕期禁用。氟苯尼考的代謝物氟苯尼考胺在食品中的殘留易導(dǎo)致潛在再生障礙性貧血。目前對(duì)氟苯尼考的檢測(cè)主要有高效液相色譜法、電位法、HPLC法、旋光法、紫外分光光度法、極普法等，而對(duì)于氟苯尼考?xì)埩魴z測(cè)未見有相關(guān)的單克隆抗體(McAb)試劑盒的報(bào)道，單克隆抗體易于生產(chǎn)、高度均質(zhì)和易于標(biāo)準(zhǔn)化，且特異性高、靈敏度高，使低殘留量也能檢出，具有無與倫比的優(yōu)點(diǎn)，非常適宜對(duì)藥物殘留的篩選分析。因此氟苯尼考的單克隆抗體、組裝ELISA試劑盒的研制，開發(fā)出具有我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的試劑盒，建立快速檢測(cè)氟苯尼考?xì)埩舻臋z測(cè)法和試劑盒是十分必要的，這一研究將有助于提高我國(guó)對(duì)動(dòng)物源性食品安全性的檢測(cè)技術(shù)水平，使我國(guó)在獸藥領(lǐng)域的檢測(cè)水平與國(guó)際同步，從而能更好地保障人們的健康，推進(jìn)農(nóng)副產(chǎn)品的綠色化進(jìn)程。

實(shí)用新型內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種成本低、快速、操作簡(jiǎn)便、靈敏度高的氟苯尼考及其代謝物檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明的技術(shù)方案是包括一個(gè)雙層試劑盒盒體，盒體內(nèi)上層裝有包被氟苯尼考-卵清蛋白抗原的96孔酶標(biāo)板、一張蓋板膜、一個(gè)自封袋、一份說明書、一份質(zhì)檢報(bào)告、下層有固定泡沫模具形成的放置試劑的下凹瓶位、位于下凹瓶位上的試劑瓶，其特征在于酶標(biāo)板上裝有12條可拆卸的酶標(biāo)條，每個(gè)酶標(biāo)條有8個(gè)反應(yīng)孔，每個(gè)酶標(biāo)孔預(yù)包被了氟苯尼考-卵清蛋白抗原，放入鋁箔袋，裝入干燥劑后真空；所述試劑瓶包括有6瓶2mL從(Γ7. 2ppb梯度濃度的氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品、I瓶2mL lmg/L的高濃度氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品、7mL氟苯尼考抗體工作液、30mL樣品稀釋液、12mL酶標(biāo)II抗工作液、40mL濃縮洗滌液、7mL底物A液、7mL底物B液、7mL終止液；試劑瓶的大小、瓶蓋的顏色各不相同，固定在具有下凹瓶位的泡沫塑料模具中蓋板膜、自封袋、說明書和質(zhì)檢報(bào)告一同裝在一個(gè)自封袋中置于酶標(biāo)板的下方。試劑盒可以一次連續(xù)測(cè)定多份樣品，也可將板孔拆開多次檢測(cè)。本試劑盒檢測(cè)的原理是樣品中的氟苯尼考和與酶標(biāo)板上固定的抗原特異性競(jìng)爭(zhēng)抗體，加入酶標(biāo)II抗，與抗體反應(yīng)，通過酶催化顯色劑顯色，根據(jù)顯色的深淺來判斷樣品中氟苯尼考的含量。如果樣品中的游離氟苯尼考量少，顯色深，反之，則顯色淺。本試劑盒具有很高的靈敏度和很高的特異性,可檢測(cè)的樣本包括豬肉、雞肉、牛肉、蝦肉、魚肉(去皮)，最低檢測(cè)限為20ppb，樣本的回收率為90%±30%。與氟苯尼考胺的交叉反應(yīng)率為54%，甲砜霉素約2. 9%，氯霉素、琥珀氯霉素〈O. 01%。本試劑盒檢測(cè)簡(jiǎn)便，所需儀器較少，只需要酶標(biāo)儀、均質(zhì)器、離心機(jī)等簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)室儀器，所需檢測(cè)成本低?？蓾M足食品生產(chǎn)企業(yè)的自我質(zhì)量控制、也可作為食品安全監(jiān)督和檢測(cè)機(jī)構(gòu)的常規(guī)篩查手段，也能用于科研中動(dòng)物藥理和毒理學(xué)研究的輔助手段。
圖I是本實(shí)用新型的上層示意圖圖2是本實(shí)用新型下層示意圖；圖3是本實(shí)用新型打開上層后的俯視圖
具體實(shí)施方式
參見附圖1-3，展現(xiàn)了本實(shí)施例所述的一種可快速檢測(cè)氟苯尼考試劑盒的結(jié)構(gòu)，所述盒體I上層裝有所述的96孔酶標(biāo)板2，所述蓋板膜、自封袋、說明書、質(zhì)檢報(bào)告共同裝在一個(gè)自封袋中放置于所述酶標(biāo)板2下面；所述試劑盒下層內(nèi)具有固定泡沫模具3形成的下凹瓶位，共有14個(gè)下凹瓶位2mL lmg/L的高濃度氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品瓶位4，7mL氟苯尼考抗體工作液瓶位5，40mL濃縮洗滌液瓶位6，12mL酶標(biāo)II抗工作液瓶位7，7mL底物A液瓶位8，7mL底物B液瓶位9，7mL終止液瓶位10，2mL O μ g/L濃度氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品11，2mL O. 05 μ g/L濃度氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品12，2mL O. 15 μ g/L濃度氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品13，2mL O. 45 μ g/L濃度氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品14，2mL I. 8 μ g/L濃度氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品15，2mL 7. 2 μ g/L濃度氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品16，30mL樣品稀釋液瓶位17。所述下凹瓶位用于放置裝有相應(yīng)溶液的試劑瓶(14瓶)。本實(shí)用新型的實(shí)施例一、工作液的準(zhǔn)備洗滌工作液用去離子水按1:20 (I份濃縮液+19份去離子水)稀釋。樣品稀釋液用去離子水按1:10 (I份濃縮樣品稀釋液+9份去離子水)稀釋。組織提取液A (含5%甲醇和O. 5%三氯乙酸的O. 02M PB)O. 2M Na2HP04 :稱取 35. 8g Na2HP04 · 12H20，溶于 500mL 水。O. 2M NaH2P04 :稱取 15. 6g NaH2P04 · 2H20，溶于 500mL 水。O. 2M PB :取 19mL O. 2M NaH2P04，81mL O. 2M Na2HP04，充分混勻。O. 02M PB :取 50mL0. 2M PB,加 450mL 水充分混勻。去掉25mL O. 02M PB,依次加入25mL甲醇，2. 5g三氯乙酸，充分混勻，既得組織提取液A。組織提取液B :在500mL組織提取液A中加入22. 5g NaCl，充分混勻。二、樣品前處理[0026]準(zhǔn)確稱取2±0. Ig均質(zhì)后的組織樣品于50mL離心管中；豬肉、雞肉、牛肉樣品力口入IOmL組織提取液A，蝦肉、魚肉樣品加入IOmL組織提取液B (切勿將不同樣品的提取液加錯(cuò))；室溫(25±2°C)下，高速潤(rùn)動(dòng)Imin ; 4000g以上,離心IOmin ;取100 μ L于新的離心管中，加入I. 5mL樣品稀釋液，充分渦動(dòng)30s ;取50 μ L進(jìn)行檢測(cè)。三、操作步驟I.將所需的酶標(biāo)板條插入酶標(biāo)板架上，并記錄下各標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的位置，建議均做平行實(shí)驗(yàn)，未使用的酶標(biāo)板條用自封袋密封后，立即保存于2-8°C環(huán)境中；2.將50 μ L各標(biāo)準(zhǔn)品工作液/樣品溶液分別加入對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品/樣品孔中；3.在每個(gè)板孔中加入50 μ L抗體工作液；·4.蓋好蓋板膜，輕輕振蕩酶標(biāo)板10s，充分混勻，室溫(25±2°C)，避光反應(yīng)30min ；5.揭開蓋板膜；6.倒掉板孔中液體，每孔加入260 μ L洗滌工作液，浸泡15 30s ；7.再重復(fù)上一步驟3次；8.倒掉板孔中液體，將酶標(biāo)板倒置于吸水紙上，拍干；9.立即在各板孔中加入100 μ L酶標(biāo)II抗工作液；10.蓋好蓋板膜，輕輕振蕩酶標(biāo)板10s，充分混勻，室溫(25±2°C)，避光反應(yīng)30min ；11.重復(fù)步驟 9. 5 9. 8 ;12.立即在每孔中加入100 μ LA、B混合液；(底物A液、底物B液按體積I : I混合，必須充分混勻，混合液在5min內(nèi)使用，避免使用金屬盛裝、攪拌試劑)；13.蓋好蓋板膜，輕輕振蕩酶標(biāo)板10s，充分混勻，室溫下(25±2°C)，避光反應(yīng)
15 20min ；14.揭開蓋板膜，在各板孔中加入50 μ L終止液，輕輕振蕩酶標(biāo)板10s，充分混勻；15.用酶標(biāo)儀在雙波長(zhǎng)450nm、630nm下檢測(cè)吸光度,在5min內(nèi)讀取。四、計(jì)算各標(biāo)準(zhǔn)品(或樣品)的平均吸光度值，除以零標(biāo)(濃度為Oppb的標(biāo)準(zhǔn)品)吸光度值，乘以100，可以得到各標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)的吸光度的百分比將各標(biāo)準(zhǔn)品所得值輸入半對(duì)數(shù)系統(tǒng)中，對(duì)應(yīng)各標(biāo)準(zhǔn)品濃度可以擬合標(biāo)
*—.....Xi00=吸光度比值紫 零標(biāo)的吸光度
準(zhǔn)曲線，請(qǐng)參見質(zhì)檢報(bào)告。將樣品吸光度的百分比代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，可得出樣品對(duì)應(yīng)的濃度，再乘以相應(yīng)樣品的稀釋倍數(shù)，方得樣品中實(shí)際藥物含量。按照本說明書的前處理方法，各樣品稀釋系數(shù)如下豬肉、雞肉、牛肉、蝦肉、魚肉(去皮).......................................80五、測(cè)定注意事項(xiàng)I.試劑盒使用前，仔細(xì)閱讀說明書。2.請(qǐng)勿使用過期試劑盒，不同批號(hào)試劑盒中的試劑不得混用。[0052]3.試劑盒使用前，將試劑盒內(nèi)各組份置于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，待其恢復(fù)至室溫(25±2°C)(提示約2h)，方可使用。4.應(yīng)避免使用金屬類物質(zhì)盛裝和攪拌試劑。5.各試劑在使用前請(qǐng)搖勻。6.檢測(cè)時(shí),應(yīng)盡量減少酶標(biāo)板上方空氣流動(dòng)。7.若底物A液、底物B液在使用前已變成藍(lán)色，或混合后立即變藍(lán)，說明試劑已變質(zhì)。8.終止液中含有2M硫酸，使用時(shí)防止灼傷皮膚及腐蝕衣物。9.不同標(biāo)準(zhǔn)品、樣品所用吸頭不得混用，否則會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 10.混合試劑時(shí)應(yīng)避免出現(xiàn)氣泡。11.使用后請(qǐng)立即將試劑放回2 8°C保存。六、試劑盒參數(shù)本試劑盒靈敏度O. 05ppb，標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍為O. 05ppb 7. 2ppb ；BO吸光度最佳值應(yīng)大于O. 8 ；試劑盒吸光度板內(nèi)誤差小于5%，板間誤差小于10% ；用本說明書提供的樣品提取方法回收率范圍90% ±30% ；樣品最低檢測(cè)限豬肉、雞肉、牛肉、蝦肉、魚肉(去皮)....................................
約 20ppb注ppb=ng/mL或 ng/g七、交叉反應(yīng)率氟苯尼考酶聯(lián)免疫試劑盒的特異性是通過與相應(yīng)的物質(zhì)進(jìn)行交叉反應(yīng)試驗(yàn)來確定的，結(jié)果如下氟苯尼考...........................100. 0%氟苯尼考胺........................約54%甲砜霉素...........................約2. 9%氯霉素、琥珀氯霉素............〈0.01%。
權(quán)利要求1.氟苯尼考及其代謝物檢測(cè)裝置，其特征在于一個(gè)雙層試劑盒盒體，盒體內(nèi)上層裝有，包被氟苯尼考-卵清蛋白抗原的96孔酶標(biāo)板、一張蓋板膜、一個(gè)自封袋、一份說明書、一份質(zhì)檢報(bào)告；下層有固定泡沫模具形成的下凹瓶位、位于下凹瓶位上的試劑瓶，所述試劑瓶包括有6瓶2mL從(Γ7. 2ppb梯度濃度的氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品、I瓶2mL lmg/L的高濃度氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品、7mL氟苯尼考抗體工作液、30mL樣品稀釋液、12mL酶標(biāo)II抗工作液、40mL濃縮洗滌液、7mL底物A液、7mL底物B液、7mL終止液。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的氟苯尼考及其代謝物檢測(cè)裝置，其特征在于所述的包被氟苯尼考-卵清蛋白抗原的96孔酶標(biāo)板酶標(biāo)板上裝有12條可拆卸的酶標(biāo)條，每個(gè)酶標(biāo)條有8個(gè)反應(yīng)孔，每個(gè)酶標(biāo)孔預(yù)包被了氟苯尼考-卵清蛋白抗原，放入鋁箔袋，裝入干燥劑后真空。
專利摘要本實(shí)用新型涉及一種檢測(cè)動(dòng)物源性食品中氟苯尼考及其代謝物的檢測(cè)裝置。該檢測(cè)試劑盒包括上、下兩層，上層裝有包被氟苯尼考-卵清蛋白抗原的酶標(biāo)板、蓋板膜、自封袋、說明書、質(zhì)檢報(bào)告；下層有6瓶不同梯度濃度的氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品、1瓶高濃度氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品、氟苯尼考抗體工作液、樣品稀釋液、酶標(biāo)Ⅱ抗工作液、濃縮洗滌液、底物A液、B液和終止液。采用間接競(jìng)爭(zhēng)法，待測(cè)樣品中氟苯尼考?xì)埩襞c酶標(biāo)板上固定抗原競(jìng)爭(zhēng)抗體，再加入酶標(biāo)結(jié)合物，通過酶催化顯色，利用樣本吸光度值計(jì)算出樣本中氟苯尼考的含量。本試劑盒具有檢測(cè)簡(jiǎn)便，快速，靈敏度高，檢測(cè)費(fèi)用低廉等優(yōu)點(diǎn)，可滿足多種檢需求。
文檔編號(hào)G01N33/543GK202693588SQ20122025304
公開日2013年1月23日 申請(qǐng)日期2012年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月31日
發(fā)明者徐飛, 王世恩, 牛蘭蘭, 蘇麗芳 申請(qǐng)人:北京維德維康生物技術(shù)有限公司