專利名稱：間接elisa方法快速檢測近江牡蠣病原類立克次氏體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬水產(chǎn)學(xué)科生物技術(shù)領(lǐng)域，即應(yīng)用現(xiàn)代免疫學(xué)技術(shù)——間接ELISA技術(shù)來解決海水養(yǎng)殖近江牡蠣(拉丁學(xué)名為Crassostrea ariakensis Gould)發(fā)生的類立克次氏體病的病原檢測問題，本發(fā)明就是創(chuàng)造了檢測引起近江牡蠣發(fā)病死亡的類立克次氏體(英文名稱rickettsia-like prokaryote，簡稱RLP或者又稱為rickettsia-like organism，簡稱RLO)的間接ELISA(英文名稱Enzyme-linked immunosorbent assay，簡稱ELISA)檢測方法。
背景技術(shù)：
海水養(yǎng)殖近江牡蠣是一種淺海養(yǎng)殖的重要經(jīng)濟貝類，在我國廣東、廣西、福建、海南等南方諸省有大規(guī)模養(yǎng)殖，其味美肉細(xì)，營養(yǎng)豐富，在正常情況下，產(chǎn)量高，經(jīng)濟效益好。但自1992年以來，養(yǎng)殖牡蠣常有大規(guī)模的暴發(fā)性死亡，廣東和廣西兩省尤其嚴(yán)重，一般發(fā)生在每年的3-5月份和10-12月份，死亡率達(dá)80-90％，這造成了巨大的經(jīng)濟損失。2000年我們首次報道了近江牡蠣的類立克次氏體感染，發(fā)現(xiàn)類立克次氏體是引起近江牡蠣發(fā)病的病原。在本發(fā)明之前，迄今在國內(nèi)、外尚未見用間接ELISA方法來檢測近江牡蠣的類立克次氏體。
在本發(fā)明之前，為了檢測近江牡蠣的發(fā)病情況，原來已有的技術(shù)仍然是停留在組織學(xué)切片和電子顯微鏡超薄切片的水平上，通過光學(xué)顯微鏡來檢查類立克次氏體的包涵體或通過電子顯微鏡來直接觀察尋找病原體，這種方法費時費力，試劑及設(shè)備昂貴。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種能早期、快速、有效地檢測出引起近江牡蠣暴發(fā)性死亡病原類立克次氏體的方法。
為實現(xiàn)上述目的采取技術(shù)方案的操作步驟依次如下第一、待檢材料的準(zhǔn)備分別取近江牡蠣的鰓，外套膜，肝胰腺研磨后加入3倍體積的生理鹽水，離心取上清液檢測。
第二、抗原的制備1.類立克次氏體的初步分離取近江牡蠣鰓組織，剪碎后加入pH為7.4的PBS，于勻漿器內(nèi)勻漿10min，重復(fù)勻漿三次。先低速離心除渣。4℃下500g離心10min，取上清液。沉淀加入PBS后重新研磨勻漿，4℃下400g離心20min，取上清液，棄沉淀。將上兩步的上清液收集后4℃下11000g離心60min。用吸管吸去浮在管壁上的脂肪，棄掉上清液。沉淀加入PBS后，重新勻漿(動作要緩慢)，4℃下500g離心20min，取上清液置于23％蔗糖和10％泛影葡胺的混合溶液之上，4℃下25000g離心60min，將沉淀輕微勻漿后，PBS稀釋，4℃下400g離心10min，取上清液后，4℃下再11000g離心60min，取沉淀，用9ml PBS稀釋為類立克次氏體粗提液。離心后的每一步含有類立克次氏體的液體涂片，Giemsa染色，光學(xué)顯微鏡觀察。
2.泛影葡胺密度梯度離心純化類立克次氏體用國產(chǎn)泛影葡胺(60％)配制15％、20％、25％、30％、35％的泛影葡胺，按濃度由高到低依次加入離心管中，形成非連續(xù)梯度。將類立克次氏體粗提液加在泛影葡胺密度梯度上，4℃下90000g離心60min，形成5條窄的乳白色的條帶，分別取出經(jīng)電鏡觀察，證明20％與25％之間和25％與30％之間基本上為純凈的類立克次氏體。
第三、免疫血清的制備及非特異性抗體的吸收1.多克隆抗血清的制備類立克次氏體經(jīng)超聲處理后，用PBS調(diào)整為1μg蛋白/μl，加等量的弗氏完全佐劑進行乳化。在Balb/c小鼠4個位點分別皮下注射100μl免疫乳化劑，4周后作加強免疫，腹腔注射100μl不加佐劑的抗原，10天后在小鼠尾靜脈采血，檢測抗體。
2.非特異性抗體的吸收取正常貝的閉殼肌，加入TN緩沖液(其中含有PMSF 1mmol/dm3)，勻漿8000rpm，10min，經(jīng)3000rpm離心5min，取上清液再經(jīng)5000rpm離心20min，上清液經(jīng)10000rpm離心1h，取沉淀用于非特異性抗體的吸收。方法參照Sambrook等。
第四、間接ELISA工作濃度的確定1.免疫血清抗體的效價固定抗原的濃度10μg/ml，系列稀釋抗血清的濃度1∶100，1∶200，1∶400，1∶800，1∶1600，1∶3200，1∶6400，1∶12800用間接ELISA技術(shù)測定抗體效價及最佳工作濃度。
2.采用交叉連續(xù)稀釋法確定免疫血清的最佳工作濃度?？乖瓭舛群愣?00μg/ml，調(diào)節(jié)免疫血清的稀釋度1∶200，1∶400，1∶800，1∶1600，1∶3200，1∶6400，1∶12800。經(jīng)間接ELISA反應(yīng)后，在λ＝450處的吸收值見圖1。
由圖1可見，制備的免疫血清用間接ELISA測定的效價為1∶6400(v/v)，最佳工作濃度取最大和最小吸收值的中間值，為0.6，對應(yīng)的血清稀釋度為1∶3200；過高和過低的稀釋度都會增加非特異吸附。
第五、間接ELISA方法的敏感性和特異性驗證(1)敏感性實驗根據(jù)確定的一抗最佳工作濃度和二抗推薦的工作濃度，系列稀釋抗原濃度，以確定最小檢測的抗原濃度。
實驗中，免疫血清抗體的濃度恒定(1∶3200V/V)；酶標(biāo)二抗的工作濃度恒定(1∶20000V/V)。而抗原的濃度改變(1ng/ml-50μg/ml)，測定免疫血清對抗原的靈敏度，結(jié)果如圖2，由圖2可見，用此方法可測得50ng的抗原蛋白量。
(2)特異性實驗 選擇溶澡弧菌(V.Alginolyticus)、嗜水氣單胞菌(AeromonasHydrophila)、大腸桿菌(Eschenrichia Coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus Aureus)、枯草桿菌(Bacillus Subtilis)與多克隆抗血清交叉反應(yīng)來判斷抗血清的特異性。實驗細(xì)菌的濃度為106/ml。
由類立克次氏體免疫Balb/c小鼠所得的抗血清與類立克次氏體的效價為1∶12800，與其它菌的效價較低，都低于1∶200，通過吸附處理后，抗血清對類立克次氏體的效價降低至1∶6400，與其它菌無交叉反應(yīng)，為高度專一的抗類立克次氏體血清。
第六、近江牡蠣類立克次氏體病原的檢測于發(fā)病高峰期取近江牡蠣，取其外套膜和鰓部位組織，用無菌PBS勻漿，離心取上清液，100℃煮沸10min，4℃保存。
用碳酸緩沖液(pH9.6，0.01M)將可溶性抗原稀釋成蛋白含量為100μg/ml。于微量反應(yīng)板各孔加100μl稀釋的可溶性抗原，4℃18小時后取出，棄去包被液，用PBST洗滌一次，加入3％牛血清白蛋白-0.02％T，37℃作用2小時后，甩干封閉液，用PBST洗滌三次，10min/次，并甩干。
加入被檢血清用PBS把血清用倍比稀釋后加入反應(yīng)孔，每孔100μl，37℃作用1小時后用PBST洗滌三次，10min/次，并甩干。
加入酶標(biāo)二抗，每孔100μl，37℃作用1小時后用PBST洗滌三次，3min/次，并甩干。
加入四甲基聯(lián)苯胺TMB顯色液，每孔100μl，室溫作用15min后加3M NaOH終止反應(yīng)。測定OD450值，或根據(jù)陽性及陰性對照直接判定結(jié)果。
顯色液配方
碳酸緩沖液(pH9.6)NaHCO32.93g，Na2CO31.59g蒸餾水1L。
封閉液3％牛血清白蛋白-0.02％Tween20。
稀釋液PBS(pH7.4)-0.05％Tween20，配方為NaCl 8g，Na2HPO4-12H2O 20g，KH2PO40.2g，KCl 0.2g，H2O 1L。
底物溶液0.2M Na2HPO4(28.4g/L) 25.7ml，0.1M檸檬酸(19.2g/L) 24.3mlH2O 50ml30％H2O2(臨用前加入) 15μlTMB(臨用前加入) 40mg本發(fā)明的優(yōu)點本發(fā)明建立的間接ELISA方法，簡單，快速，經(jīng)濟，敏感性高，特異性強，重復(fù)性好，便于推廣應(yīng)用，能有效的檢出感染材料中的類立克次氏體病原，適用于大批量發(fā)病樣本的檢測，可用于類立克次氏體感染的早期快速診斷及流行病學(xué)研究。


圖1為間接ELISA技術(shù)測定不同稀釋度的免疫血清由圖1可見，制備的免疫血清用間接ELISA測定的效價為1∶6400(v/v)，最佳工作濃度取最大和最小吸收值的中間值，為0.6，對應(yīng)的血清稀釋度為1∶3200；過高和過低的稀釋度都會增加非特異吸附。
圖2為不同抗原稀釋度的ELISA檢測結(jié)果免疫血清抗體的濃度恒定(1∶3200V/V)；酶標(biāo)二抗的工作濃度恒定(1∶20000V/V)。而抗原的濃度改變(1ng/ml-50μg/ml)，測定免疫血清對抗原的靈敏度，結(jié)果如圖2可見，用此方法可測得50ng的抗原蛋白量。
具體實施例方式
按上述技術(shù)方案的實際操作步驟進行的實施例的檢測結(jié)果，表明采用本發(fā)明是有效的利用建立的ELISA方法對患病近江牡蠣的鰓組織進行檢測，以經(jīng)過組織學(xué)和透射電鏡檢測為類立克次氏體陰性的健康近江牡蠣做陽性對照，對50份自然發(fā)病的近江牡蠣鰓組織進行檢測，結(jié)果是ELISA檢測陽性率為89％。
權(quán)利要求
1.間接ELISA方法快速檢測近江牡蠣病原類立克次氏體，其特征在于檢測步驟依次如下一、待檢材料的準(zhǔn)備分別取近江牡蠣的鰓，外套膜，肝胰腺研磨后加入3倍體積的生理鹽水，離心取上清液檢測；二、抗原的制備1.類立克次氏體的初步分離取近江牡蠣鰓組織，剪碎后加入pH為7.4的PBS，于勻漿器內(nèi)勻漿10min，重復(fù)勻漿三次，先低速離心除渣，4℃下500g離心10min，取上清液，沉淀加入PBS后重新研磨勻漿，4℃下400g離心20min，取上清液，棄沉淀，將上兩步的上清液收集后4℃下11000g離心60min，用吸管吸去浮在管壁上的脂肪，棄掉上清液，沉淀加入PBS后，重新勻漿，4℃下500g離心20min，取上清液置于23％蔗糖和10％泛影葡胺的混合溶液之上，4℃下25000g離心60min，將沉淀輕微勻漿后，PBS稀釋，4℃下400g離心10min，取上清液，4℃下11000g離心60min，取沉淀，用9mlPBS稀釋為類立克次氏體粗提液，離心后的每一步含有類立克次氏體的液體涂片，Giemsa染色，光學(xué)顯微鏡觀察；2.泛影葡胺密度梯度離心純化類立克次氏體用國產(chǎn)泛影葡胺(60％)配制15％、20％、25％、30％、35％的泛影葡胺，按濃度由高到低依次加入離心管中，形成非連續(xù)梯度，將類立克次氏體粗提液加在泛影葡胺密度梯度上，4℃下90000g離心60min，形成5條窄的乳白色的條帶，分別取出經(jīng)電鏡觀察，證明20％與25％之間和25％與30％之間基本上為純凈的類立克次氏體；三、免疫血清的制備及非特異性抗體的吸收1.多克隆抗血清的制備類立克次氏體經(jīng)超聲處理后，用PBS調(diào)整為1μg蛋白/μl，加等量的弗氏完全佐劑進行乳化，在Balb/c小鼠4個位點分別皮下注射100μl免疫乳化劑，4周后作加強免疫，腹腔注射100μl不加佐劑的抗原，10天后在小鼠尾靜脈采血，檢測抗體；2.非特異性抗體的吸收取正常貝的閉殼肌，加入TN緩沖液其中含有PMSF1mmol/dm3，勻漿8000rpm，10min，經(jīng)3000rpm離心5min，取上清液再經(jīng)5000rpm離心20min，上清液經(jīng)10000rpm離心1h，取沉淀用于非特異性抗體的吸收，方法參照Sambrook等；四、間接ELISA工作濃度的確定1、免疫血清抗體的效價固定抗原的濃度10μg/ml，系列稀釋抗血清的濃度1∶100，1∶200，1∶400，1∶800，1∶1600，1∶3200，1∶6400，1∶12800用間接ELISA技術(shù)測定抗體效價及最佳工作濃度；2、采用交叉連續(xù)稀釋法確定免疫血清的最佳工作濃度，抗原濃度恒定100μg/ml，調(diào)節(jié)免疫血清的稀釋度1∶200，1∶400，1∶800，1∶1600，1∶3200，1∶6400，1∶12800。經(jīng)間接ELISA反應(yīng)后，獲得在λ＝450處的吸收值；制備的免疫血清用間接ELISA測定的效價為1∶6400v/v，最佳工作濃度取最大和最小吸收值的中間值，為0.6，對應(yīng)的血清稀釋度為1∶3200；五、間接ELISA方法的敏感性和特異性驗證1、敏感性根據(jù)確定的一抗最佳工作濃度和二抗推薦的工作濃度，系列稀釋抗原濃度，以確定最小檢測的抗原濃度；免疫血清抗體的濃度恒定1∶3200V/V；酶標(biāo)二抗的工作濃度恒定1∶20000V/V，而抗原的濃度改變范圍為1ng/ml-50μg/ml，測定免疫血清對抗原的靈敏度；2、特異性選擇溶澡弧菌V.Alginolyticus、嗜水氣單胞菌Aeromonas Hydrophila、大腸桿菌EschenrichiaColi、金黃色葡萄球菌Staphylococcus Aureus、枯草桿菌Bacillus Subtilis與多克隆抗血清交叉反應(yīng)來判斷抗血清的特異性，實驗細(xì)菌的濃度為106/ml；由類立克次氏體免疫Balb/c小鼠所得的抗血清與類立克次氏體的效價為1∶12800，與其它菌的效價較低，都低于1∶200，通過吸附處理后，抗血清對類立克次氏體的效價降低至1∶6400，與其它菌無交叉反應(yīng)，為高度專一的抗類立克次氏體血清；六、近江牡蠣類立克次體病原的檢測于發(fā)病高峰期取近江牡蠣，取其外套膜和鰓部位組織，用無菌PBS勻漿，離心取上清液，100℃煮沸10min，4℃保存；用碳酸緩沖液pH9.6 0.01M將可溶性抗原稀釋成蛋白含量為100μg/ml，于微量反應(yīng)板各孔加100μl稀釋的可溶性抗原，4℃18小時后取出，棄去包被液，用PBST洗滌一次，加入3％牛血清白蛋白-0.02％T，37℃作用2小時后，甩干封閉液，用PBST洗滌三次，10min/次，并甩干；加入被檢血清用PBS把血清用倍比稀釋后加入反應(yīng)孔，每孔100μl，37℃作用1小時后用PBST洗滌三次，10min/次，并甩干；加入酶標(biāo)二抗，每孔100μl，37℃作用1小時后用PBST洗滌三次，3min/次，并甩干；加入四甲基聯(lián)苯胺TMB顯色液，每孔100μl，室溫作用15min后加3M NaOH終止反應(yīng)，測定OD450值，或根據(jù)陽性及陰性對照直接判定結(jié)果；其中顯色液配方碳酸緩沖液(pH9.6)NaHCO32.93g，Na2CO31.59g蒸餾水1L；封閉液3％牛血清白蛋白-0.02％Tween20；稀釋液PBS(pH 7.4)-0.05％Tween20，配方為NaCl 8g，Na2HPO4-12H2O 20g，KH2PO40.2g，KCl 0.2g，H2O 1L；底物溶液0.2M Na2HPO428.4g/L 25.7ml，0.1M 檸檬酸 19.2g/L 24.3mlH2O 50ml30％H2O2臨用前加入 15μlTMB臨用前加入 40mg。
全文摘要
間接ELISA方法快速檢測近江牡蠣病原類立克次氏體。主要解決能簡單、快速、敏感性高、特異性強、重復(fù)性好的檢測出引起近江牡蠣發(fā)病死亡的類立克次氏體。其檢測步驟依次如下待檢材料的制備、抗原的制備、免疫血清的制備及非特異性抗體的吸收、間接ELISA工作濃度的確定、間接ELISA方法的敏感性和特異性驗證，最后進行近江牡蠣類立克次氏體病原的檢測。本發(fā)明能有效檢出感染材料中的類立克次氏體病原，適用于大批量發(fā)病樣本的檢測，可用于類立克次氏體感染的早期快速診斷及流行病學(xué)研究。
文檔編號G01N33/535GK1616968SQ200410066928
公開日2005年5月18日 申請日期2004年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月30日
發(fā)明者吳信忠, 孫敬鋒 申請人:浙江大學(xué)