專利名稱：快速檢測解蛋白弧菌的試劑盒及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種快速檢測解蛋白弧菌的試劑盒，以及使用該試劑盒快速檢測解蛋白弧菌的方法。
背景技術(shù)：
弧菌是海水養(yǎng)殖動物的主要病原，現(xiàn)已查明解蛋白弧菌是引起近江牡蠣大量死亡的病原之一。監(jiān)測養(yǎng)殖動物體內(nèi)和海水中的解蛋白弧菌是防治其引起疾病的重要措施。目前鑒定弧菌的技術(shù)有1、經(jīng)典的生理生化鑒定方法，該法繁瑣、耗時(shí)、且要求操作人員有良好的專業(yè)素養(yǎng)；2、細(xì)菌快速自動鑒定系統(tǒng)，該法需要昂貴的儀器設(shè)備和技術(shù)熟練的操作人員；3、基于核酸的檢測技術(shù)，包括DNA探針和PCR技術(shù)(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù))，相對上述檢測技術(shù)而言，具有快速、簡捷、靈敏等特點(diǎn)，但目前還未見檢測解蛋白弧菌的PCR技術(shù)及檢測試劑盒專利。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，本發(fā)明的首要目的在于提供一種快速檢測解蛋白弧菌的試劑盒，特別是提供一對解蛋白弧菌特異性引物VpS和VpA，使用該試劑盒可快速檢測多種樣品中是否存在解蛋白弧菌，從而為健康養(yǎng)殖提供科學(xué)依據(jù)。
本發(fā)明的另一目的在于提供上述檢測試劑盒檢測解蛋白弧菌的方法。本發(fā)明建立了快速靈敏準(zhǔn)確檢測解蛋白弧菌的PCR檢測技術(shù)，滿足生產(chǎn)中簡便、快捷和準(zhǔn)確的需要。
本發(fā)明的目的是由下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種快速檢測解蛋白弧菌的試劑盒，包括增菌培養(yǎng)基、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑、電泳和顯色試劑(a)試劑A即增菌培養(yǎng)基含胰化蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物和瓊脂粉，其重量比為5∶3∶1∶18。
(b)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑包括反應(yīng)預(yù)混試劑B和試劑C。
試劑B含有10倍聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)緩沖液(含MgCl215mM)、特異引物對VpS和VpA、dNTP(四種脫氧核苷酸的混合物)、小牛血清蛋白和滅菌雙蒸水，含量分別為2.5～5.0μl、0.5～1.0μl(10μM)、0.5～1.0μl(10μM)、0.5～1.0μl(10μM each)、0.5～1.0μl(5mg/ml)和19.375～38.75μl。
試劑CTaq酶，0.125～0.25μl(5個(gè)單位/μl)。
所述特異引物對VpS和VpA如下特異引物VpS指5′CTTCCTAGACACCCGTCAC 3′；特異引物VpA指5′CTGGCTCAAGCAACCTAC 3′。
(c)電泳和顯色試劑，包括試劑D、試劑E和試劑F。
試劑D為50倍TAE(電泳緩沖液)，含三羥基甲基氨基甲烷-乙酸和乙二胺四乙酸，濃度分別為0.04M和0.001M；試劑E為凝膠加樣緩沖液，含w/v為40％的蔗糖和0.25％的溴酚藍(lán)和二甲苯青FF；試劑F0.8～2％(W/V)瓊脂糖+0.5～1μg/ml溴化乙錠。
為了更好地實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，所述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑的優(yōu)選組成為試劑B5.0μl 10×PCR Buffer，1.0μl VpS，1.0μl VpA，1.0μl dNTP(10mM each)，1.0μlBSA，38.75μl ddH2O；試劑C0.25μl Taq酶。
使用快速檢測解蛋白弧菌的試劑盒檢測解蛋白弧菌的方法，包括如下步驟(a)增菌取2.7g試劑A加過濾海水至100ml，調(diào)PH值為7.2～7.4，121℃滅菌15～20min后按常規(guī)方法制作細(xì)菌培養(yǎng)平板。
無菌操作取0.1～0.5克樣品，勻漿(需要時(shí))后涂布于用試劑A即增菌培養(yǎng)基所制平板，30℃培養(yǎng)12～18小時(shí)。
(b)PCR擴(kuò)增挑取平板上各種菌苔于100μl滅菌蒸餾水中重懸混勻后取1～2μl作為PCR擴(kuò)增的模板；取23.875～47.75μl試劑B與0.125～0.25μl試劑C混合；在熱循環(huán)儀上通過95℃裂解細(xì)菌并解鏈5分鐘；然后用94℃變性30～60秒，55～58℃復(fù)性30～60秒鐘，72℃延伸30～90秒鐘，如此循環(huán)25～35次，最后在72℃保溫8～12分鐘，將解蛋白弧菌的特異片段增加到108mol以上。
(c)電泳和顯色檢測取5～10μl擴(kuò)增后的樣品，與1～2μl試劑F(凝膠加樣緩沖液)混合，W/V為0.8～1.2％的瓊脂糖電泳和顯色，在紫外光下檢測是否有一條360核苷酸對(bp)的條帶，如果有一條360bp的條帶，說明樣品中含有解蛋白弧菌，反之則沒有解蛋白弧菌。
所述樣品為待檢水產(chǎn)動物組織或水樣等，要避免污染。
本發(fā)明的主要原理為試劑B和C為多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑，通過試劑B中所含解蛋白弧菌DNA片段特異引物和試劑C中的熱聚合酶等成分，對樣品釋放出的DNA進(jìn)行特異性的擴(kuò)增，由于本發(fā)明所設(shè)計(jì)引物為解蛋白弧菌特異性引物，因此，如果樣品中含有解蛋白弧菌，那么它的DNA特異片段在經(jīng)過擴(kuò)增后，濃度將達(dá)到108mol(克分子)以上，這樣，在電泳和溴化乙錠染色后，紫外光檢測就可以探測到一定分子量的目的條帶。如果沒有解蛋白弧菌存在，則不能擴(kuò)增到同樣分子量的目的條帶。
本發(fā)明與其它弧菌病原檢測技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)和有益效果(1)本發(fā)明方法檢測方便，省去了通常方法中要提取細(xì)菌DNA的步驟。
(2)本發(fā)明方法檢測靈敏度極高，檢測下限低至102級個(gè)細(xì)菌。
(3)本發(fā)明提供的引物對于不含解蛋白弧菌的檢測樣本均無擴(kuò)增信號，說明其具有良好的特異性。
(4)本發(fā)明可以應(yīng)用于多種樣品的檢測，可以檢測養(yǎng)殖動物受解蛋白弧菌感染情況，也可以監(jiān)測養(yǎng)殖水體環(huán)境中解蛋白弧菌。


圖1為解蛋白弧菌快速檢測試劑盒特征引物特異性檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。
圖2為解蛋白弧菌快速檢測試劑盒靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例和附圖進(jìn)一步對本發(fā)明進(jìn)行說明，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
實(shí)施例1 按以下配方制作快速檢測解蛋白弧菌的試劑盒(a)試劑A(增菌培養(yǎng)基)含有胰化蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物和瓊脂粉，其重量比為5∶3∶1∶18。
(b)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(25μl體系)試劑包括反應(yīng)預(yù)混試劑B和試劑C，試劑B含有10倍聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)緩沖液(含MgCl215mM)、特異引物對VpS和VpA、dNTP(四種脫氧核苷酸的混合物)、小牛血清蛋白和滅菌雙蒸水，含量分別為2.5μl、0.5μl(10μM)、0.5μl(10μM)、0.5μl(10μM each)、0.5μl(5mg/ml)和19.375μl。
試劑CTaq酶，0.125μl(5個(gè)單位/μl)。
(c)電泳和顯色試劑，包括試劑D、試劑E和試劑F。
試劑D為50倍TAE(電泳緩沖液)，含三羥基甲基氨基甲烷-乙酸和乙二胺四乙酸，濃度分別為0.04M和0.001M；試劑E為凝膠加樣緩沖液，含w/v為40％的蔗糖和0.25％的溴酚藍(lán)及二甲苯青FF；試劑F1％(W/V)瓊脂糖+0.5μg/ml溴化乙錠。
按照以下程序快速檢測解蛋白弧菌的方法(a)樣品增菌處理取2.7g試劑A加過濾海水至100ml，調(diào)PH值為7.2～7.4，121℃滅菌20min后按常規(guī)方法制作細(xì)菌培養(yǎng)平板。
無菌操作取近江牡蠣消化盲囊組織約0.1克，勻漿后涂布于所制細(xì)菌培養(yǎng)平板，30℃培養(yǎng)16小時(shí)。
(b)PCR擴(kuò)增取23.875μl試劑B與0.125μl試劑C混合；用滅菌牙簽挑取平板上各種菌苔于100μl滅菌蒸餾水中重懸混勻，取1μl作為PCR模板加入上述混合液中；在熱循環(huán)儀上對進(jìn)行擴(kuò)增，通過95℃裂解細(xì)菌并解鏈5分鐘，然后用94℃變性30秒，57℃復(fù)性30秒，72℃延伸40秒鐘，如此循環(huán)30次，最后在72℃保溫10分鐘。
(c)電泳和顯色檢測取5μl擴(kuò)增后的樣品，與1μl試劑F(凝膠加樣緩沖液)混合，1％瓊脂糖電泳和顯色，在紫外光下檢測是否有一條360核苷酸對的條帶，如果有一條360bp的條帶，說明樣品中含有解蛋白弧菌，反之則沒有。
實(shí)施例2 按以下配方制作快速檢測解蛋白弧菌的試劑盒(a)試劑A(增菌培養(yǎng)基)含胰化蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物和瓊脂粉，其重量比為5∶3∶1∶18。
(b)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(50μl體系)試劑包括反應(yīng)預(yù)混試劑B和試劑C。試劑B含有10倍聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)緩沖液(含MgCl215mM)、特異引物對VpS和VpA、dNTP(四種脫氧核苷酸的混合物)、小牛血清蛋白和滅菌雙蒸水，含量分別為5.0μl、1.0μl(10μM)、1.0μl(10μM)、1.0μl(10μM each)、1.0μl(5mg/ml)和38.75μl。
試劑CTaq酶，0.25μl(5個(gè)單位/μl)。
(c)電泳和顯色試劑，包括試劑D、試劑E和試劑F。
試劑D為50倍TAE(電泳緩沖液)，含三羥基甲基氨基甲烷-乙酸和乙二胺四乙酸，濃度分別為0.04M和0.001M；試劑E為凝膠加樣緩沖液，含w/v為40％的蔗糖和0.25％的溴酚藍(lán)及二甲苯青FF；試劑F1％(W/V)瓊脂糖+0.5μg/ml溴化乙錠。
按照以下程序快速檢測解蛋白弧菌的方法(a)樣品增菌處理取2.7g試劑A加過濾海水至1L，調(diào)PH值為7.2～7.4，121℃滅菌20min后按常規(guī)方法制作細(xì)菌培養(yǎng)平板。
無菌操作取牡蠣血液約0.1克，涂布于所制細(xì)菌培養(yǎng)平板，30℃培養(yǎng)16小時(shí)。
(b)PCR擴(kuò)增取47.75μl試劑B與0.25μl試劑C混合；用滅菌牙簽挑取平板上各種菌苔于100μl滅菌蒸餾水中重懸混勻，取2μl作為PCR模板加入上述混合液中；在熱循環(huán)儀上通過95℃裂解細(xì)菌并解鏈5分鐘；然后用94℃變性30秒，59℃復(fù)性30秒，72℃延伸45秒鐘，如此循環(huán)30次，最后在72℃保溫10分鐘。
(c)電泳和顯色檢測取8μl擴(kuò)增后的樣品，與2μl試劑F(凝膠加樣緩沖液)，1％瓊脂糖電泳和顯色，在紫外光下檢測是否有一條360核苷酸對的條帶，如果有一條360bp的條帶，說明樣品中含有解蛋白弧菌，反之則沒有。
如圖1所示，為解蛋白弧菌快速檢測試劑盒特征引物特異性檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中MDNA marker，1副溶血弧菌，2哈維氏弧菌，3、4、5三株不同來源的溶藻弧菌，6解蛋白弧菌，7解蛋白弧菌，8需鈉弧菌，9坎氏弧菌，10燦爛弧菌，11河流弧菌，12創(chuàng)傷弧菌，圖1顯示解蛋白弧菌快速檢測試劑盒特征引物只能對解蛋白弧菌PCR擴(kuò)增出目的片段，其特異性是非常高的。
如圖2所示，為解蛋白弧菌快速檢測試劑盒靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中MDNAmarker，1～825μl體系PCR結(jié)果，每管加入模板量(解蛋白弧菌數(shù)/管，平板計(jì)數(shù)法)；11×107，21×106，31×105，41×104，51×103，61×102，71×101，81×100，圖2顯示解蛋白弧菌快速檢測試劑盒在102級時(shí)就可以檢測出結(jié)果。
上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
SEQUENCE LISTING<110>暨南大學(xué)<120>快速檢測解蛋白弧菌的試劑盒及其檢測方法<130>27<160>2<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>19<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
<223>解蛋白弧菌特異引物VpS<400>1cttcctagac acccgtcac 19<210>2<211>18<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
<223>解蛋白弧菌特異引物VpA<400>2ctggctcaag caacctac 18
權(quán)利要求
1.一種快速檢測解蛋白弧菌的試劑盒，其特征在于包括增菌培養(yǎng)基、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑、電泳和顯色試劑(a)增菌培養(yǎng)基即試劑A含胰化蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物和瓊脂粉，其重量比為5∶3∶1∶18；(b)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑包括反應(yīng)預(yù)混試劑B和試劑C；試劑B含有10倍聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)緩沖液、特異引物對VpS和VpA、dNTP、小牛血清蛋白和滅菌雙蒸水，含量分別為2.5～5.0μl、0.5～1.0μl、0.5～1.0μl、0.5～1.0μl、0.5～1.0μl和19.375～38.75μl；試劑CTaq酶，0.125～0.25μl；所述特異引物對VpS和VpA如下特異引物VpS指5′CTTCCTAGACACCCGTCAC 3′；特異引物VpA指5′CTGGCTCAAGCAACCTAC 3′；(c)電泳和顯色試劑，包括試劑D、試劑E和試劑F；試劑D為50倍TAE，含三羥基甲基氨基甲烷-乙酸和乙二胺四乙酸，濃度分別為0.04M和0.001M；試劑E為凝膠加樣緩沖液，含w/v為40％的蔗糖和0.25％的溴酚藍(lán)和二甲苯青FF；試劑F0.8～2％瓊脂糖+0.5～1μg/ml溴化乙錠。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速檢測解蛋白弧菌的試劑盒，其特征在于所述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑的組成為試劑B5.0μl 10×PCR Buffer，1.0μl VpS，1.0μl VpA，1.0μl dNTP，1.0μl BSA，38.75μl ddH2O；試劑C0.25μl Taq酶。
3.一種使用快速檢測解蛋白弧菌的試劑盒檢測解蛋白弧菌的方法，其特征在于包括如下步驟(a)增菌取2.7g試劑A加過濾海水至100ml，調(diào)PH值為7.2～7.4，121℃滅菌15～20min后制作細(xì)菌培養(yǎng)平板；無菌操作取0.1～0.5克樣品，涂布于用試劑A即增菌培養(yǎng)基所制平板，30℃培養(yǎng)12～18小時(shí)；(b)PCR擴(kuò)增挑取平板上各種菌苔于100μl滅菌蒸餾水中重懸混勻后取1～2μl作為PCR擴(kuò)增的模板；取23.875～47.75μl試劑B與0.125～0.25μl試劑C混合；在熱循環(huán)儀上通過95℃裂解細(xì)菌并解鏈5分鐘；然后用94℃變性30～60秒，57～59℃復(fù)性30～60秒鐘，72℃延伸30～90秒鐘，如此循環(huán)25～35次，最后在72℃保溫8～12分鐘，將解蛋白弧菌的特異片段增加到108mol以上；(c)電泳和顯色檢測取5～10μl擴(kuò)增后的樣品，與1～2μl試劑F混合，W/V為0.8～1.2％的瓊脂糖電泳和顯色，在紫外光下檢測是否有一條360bp的條帶，如果有一條360bp的條帶，說明樣品中含有解蛋白弧菌，反之則沒有解蛋白弧菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種使用快速檢測解蛋白弧菌的試劑盒檢測解蛋白弧菌的方法，其特征在于所述樣品為待檢水產(chǎn)動物組織或水樣。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種快速檢測解蛋白弧菌的試劑盒，該試劑盒包括增菌培養(yǎng)基、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑、電泳和顯色試劑本發(fā)明還提供使用這種試劑盒快速檢測解蛋白弧菌的方法，其優(yōu)點(diǎn)是快速，準(zhǔn)確，靈敏度高。本發(fā)明的方法檢測方便，省去了通常方法中要提取細(xì)菌DNA的步驟；檢測靈敏度極高，檢測下限低至10
文檔編號G01N27/447GK1974785SQ20061012419
公開日2007年6月6日 申請日期2006年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月13日
發(fā)明者張其中, 張占會 申請人:暨南大學(xué)