專利名稱：：利用nim1基因賦予植物抗病性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明一般地涉及植物中的廣譜抗病性，包括系統(tǒng)獲得性抗性(SAR)這一現(xiàn)象。更特別地，本發(fā)明涉及NIM1基因的野生型和變形體的重組表達(dá)，其參與導(dǎo)致SAR的信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)以建立具有廣譜抗病性的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明進(jìn)一步涉及在具有廣譜抗病性轉(zhuǎn)基因植物中克隆NIM1基因的高水平表達(dá)。植物經(jīng)常受到大量的病原生物的侵襲，包括病毒、細(xì)菌、真菌和線蟲(chóng)。作物類植物特別脆弱，因?yàn)樗鼈兂３Ｊ且赃z傳均一的單種栽培；一旦發(fā)病則損失嚴(yán)重。然而，大多數(shù)植物具有它們自己天生的抵抗病原生物的防衛(wèi)機(jī)制。植物育種家和病理學(xué)家已經(jīng)鑒定了抵抗植物病原體的天然變異并育成許多作物類植物。這些自然抗病基因常常提供對(duì)病原體的高水平的抗性或免疫性。系統(tǒng)獲得性抗性(SAR)是植物用于保護(hù)自身不受病原體侵害的復(fù)雜系統(tǒng)的一個(gè)成份(Hunt和Ryals，植物科學(xué)評(píng)論(Crit.Rev.InPlantSci.)15，583-606(1996)，在此完整引入作為參考；Ryals等，植物細(xì)胞(PlantCell)8，1809-1819(1996)，在此完整引入作為參考。還參考美國(guó)專利5,614,395，在此完整引入作為參考)。SAR是植物-病原體反應(yīng)的一個(gè)特別重要的方面，因?yàn)樗遣≡w可誘導(dǎo)的針對(duì)廣譜傳染劑的系統(tǒng)性抗性，廣譜傳染劑包括病毒、細(xì)菌和真菌。當(dāng)SAR信號(hào)傳導(dǎo)途徑被阻斷時(shí)，植物變得對(duì)通常致病的病原體更加敏感，而且它們對(duì)一些通常不致病的傳染劑也變得敏感起來(lái)(Gaffney等，科學(xué)(Science)261，754-756(1993)，在此完整引入作為參考；Delaney等，科學(xué)266，1247-1250(1994)，在此完整引入作為參考；Delaney等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)92，6602-6606(1995)，在此完整引入作為參考；Delaney，植物生理(PlantPhys.)113，5-12(1997)，在此完整引入作為參考；Bi等，植物雜志(PlantJ.)8，235-245(1995)，在此完整引入作為參考；Mauch-Mani和Slusarenko，植物細(xì)胞(PlantCell)8，203-212(1996)，在此完整引入作為參考)。這些觀察顯示SAR信號(hào)傳導(dǎo)途徑對(duì)于維持植物健康是至關(guān)重要的。在概念上，SAR反應(yīng)可分為兩個(gè)階段。在初始階段中，病原體感染被識(shí)別，信號(hào)被釋放并通過(guò)韌皮部到達(dá)遠(yuǎn)處的組織。這種系統(tǒng)性信號(hào)被靶細(xì)胞所感受，其反應(yīng)為SAR基因和抗病性的表達(dá)。SAR的維持階段是指一段時(shí)間，從幾個(gè)星期到植物的一生，在此期間植物處于準(zhǔn)穩(wěn)態(tài)，抗病性得以維持(Ryals等，1996)。水楊酸(SA)的積累似乎是SAR信號(hào)傳導(dǎo)所需的。通過(guò)利用特殊抑制劑處理、后生性的苯丙氨酸解氨酶的抑制、或水楊酸羥化酶(專一降解水楊酸)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)形成的不能積累水楊酸的植物，也不能誘導(dǎo)SAR基因的表達(dá)和抗病性(Gaffney等，1993；Delaney等，1994；Mauch-Mani和Slusarenko1996；Maher等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，91，7802-7806(1994)，在此完整引入作為參考；Pallas等，植物雜志，10，281-293(1996)，在此引入作為參考)。盡管已經(jīng)表明水楊酸可能作為系統(tǒng)性信號(hào)，最近卻有爭(zhēng)論，而且至今明確已知的是如果不能積累水楊酸，則SAR信號(hào)傳導(dǎo)被阻斷(Pallas等，1996；Shulaev等，1995，植物細(xì)胞，7，1691-1701(1995)，在此完整引入作為參考；Vernooij等，植物細(xì)胞，6，959-965(1994)，在此完整引入作為參考)。最近，擬南芥(Arabidopsis)開(kāi)始作為研究SAR的模式系統(tǒng)(Uknes等，植物細(xì)胞，4，645-656(1992)，在此完整引入作為參考；Uknes等，分子植物-微生物相互作用(Mol.Plant-MicrobeInteract.)6，692-698(1993)，在此完整引入作為參考；Cameron等，植物雜志，5，715-725(1994)，在此完整引入作為參考；Mauch-Mani和Slusarenko，分子植物-微生物相互作用7，378-383(1994)，在此完整引入作為參考；Dempsey和Klessig，巴斯德研究所公報(bào)(BulletindeL′InstitutPasteur)93，197-186(1995)，在此完整引入作為參考)。已經(jīng)表明在擬南芥中SAR可以被病原體和化學(xué)品所激活，例如水楊酸(SA)，2，6-二氯異煙酸(INA)和苯并(1，2，3)噻二唑-7-硫代羧酸S-甲基酯(BTH)(Uknes等，1992；Vernooij等，分子植物-微生物相互作用8，228-234(1995)，在此完整引入作為參考；Lawton等，植物雜志10，71-82(1996)，在此完整引入作為參考)。用INA或BTH或病原體感染處理后，至少三個(gè)與發(fā)病相關(guān)(PR)的蛋白質(zhì)基因，即PR-1、PR-2和PR-5是與抗性發(fā)生同時(shí)被誘導(dǎo)的伴隨物(Uknes等，1992，1993)。在煙草這一被最詳細(xì)描述的品種中，用病原體或免疫化合物處理誘導(dǎo)了至少九套基因的表達(dá)(Ward等，植物細(xì)胞3，1085-1094(1991)，在此完整引入作為參考)。已經(jīng)通過(guò)用不同的SAR基因轉(zhuǎn)化植物建立了轉(zhuǎn)基因抗病植物(美國(guó)專利5,614,395)。已經(jīng)分離了大量的具有被改造的SAR信號(hào)傳導(dǎo)的擬南芥突變型(Delaney，1997)。這些突變型的第一個(gè)是所謂的lsd(病斑模擬病)突變型和acd2(加速細(xì)胞死亡)突變型(Dietrich等，細(xì)胞(Cell)77，551-563(1994)，在此完整引入作為參考；Greenberg等，細(xì)胞77，551-563(1994)，在此完整引入作為參考)。這些突變型的葉子上都具有一定程度的隨機(jī)壞死斑形成，且具有水平增高的SA、SAR基因的mRNA積累以及明顯增強(qiáng)的抗病性。至少7個(gè)不同的lsd突變型已經(jīng)被分離并表征(Dietrich等，1994；Weymann等，植物細(xì)胞7，2013-2022(1995)，在此完整引入作為參考)。另一類感興趣的突變型是cim(組成型免疫)突變型(Lawton等，1993“系統(tǒng)獲得性抗性的分子生物學(xué)”，見(jiàn)《植物中防衛(wèi)反應(yīng)的機(jī)制》，B.Fritig和M.Legrand編著(Dordrecht，荷蘭Kluwer學(xué)院出版社)，第422-432頁(yè)(1993)，在此完整引入作為參考)。還參考國(guó)際PCT申請(qǐng)WO94/16077，在此完整引入作為參考。象lsd和acd2突變型一樣，cim突變型具有增強(qiáng)的SA和SAR基因表達(dá)和抗性，但是與lsd或acd2相反，cim突變型的葉子上沒(méi)有出現(xiàn)可檢測(cè)的病斑。cpr1(PR基因的組成型表達(dá)子)可能是cim突變型的一種；但是，因?yàn)檫€沒(méi)有排除cpr1葉子上的微細(xì)病斑的存在，cpr1可能是lsd突變型的一種(Bowling等，植物細(xì)胞6，1845-1857(1994)，在此完整引入作為參考)。還分離出了SAR信號(hào)傳導(dǎo)被阻斷的突變型。ndr1(非品種特異性抗病性)是允許含有多種無(wú)致病力基因的丁香假單胞菌(Pseudomonassyringae)和通常寄生霜霉的(Peronosporaparasitica)無(wú)致病力分離物生長(zhǎng)的突變型(Century等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)92，6597-6601(1995)，在此完整引入作為參考)。很明顯這個(gè)突變型在SAR信號(hào)傳導(dǎo)早期被阻斷。npr1(PR基因的非表達(dá)子)是在經(jīng)INA處理后不能誘導(dǎo)SAR信號(hào)傳導(dǎo)途徑表達(dá)的突變型(Cao等，植物細(xì)胞6，1583-1592(1994)，在此完整引入作為參考)。eds(增強(qiáng)的病害敏感性)突變型是根據(jù)它們?cè)诘蜐舛燃?xì)菌接種后的支持細(xì)菌感染的能力被分離的(Glazebrook等，遺傳(Genetics)143，973-982(1996)，在此完整引入作為參考；Parker等，植物細(xì)胞8，2033-2046(1996)，在此完整引入作為參考)。某些eds突變型在表型上非常相似于npr1，而且最近發(fā)現(xiàn)eds5和eds53與npr1是等位的(Glazebrook等，1996)。nim1(非誘導(dǎo)免疫)是經(jīng)INA處理后支持寄生霜霉(即霜霉病的致病菌)生長(zhǎng)的突變型(Delaney等，1995，國(guó)際PCT申請(qǐng)WO94/16077)。盡管nim1在被病原體感染后能夠積累SA，但它不能誘導(dǎo)SAR基因表達(dá)或抗病性，提示該突變阻斷了SA的下游途徑。nim1對(duì)INA或BTH反應(yīng)的能力也受到損害，提示該阻斷存在于這些化學(xué)品作用的下游(Delaney等，1995；Lawton等，1996)。最近，兩個(gè)等位的擬南芥基因被分離并表征，它們的突變型分別負(fù)責(zé)nim1和npr1的表型(Ryal等，植物細(xì)胞9，425-439(1997)，在此完整引入作為參考；Cao等，細(xì)胞88，57-63(1997)，在此完整引入作為參考)。野生型NIM1基因產(chǎn)物參與導(dǎo)致擬南芥中的SAR和基因-基因抗病性的信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)(Ryals等，1997)。Ryals等，1997還報(bào)告了nim1的另外5個(gè)等位基因的分離，它們表現(xiàn)出不同的表型，程度從化學(xué)誘導(dǎo)的PR-1基因表達(dá)和對(duì)真菌的抗性受到弱的損害到十分嚴(yán)重的阻斷。將野生型NPR1基因轉(zhuǎn)化到npr1突變型中不但互補(bǔ)了突變，恢復(fù)了對(duì)SAR誘導(dǎo)的反應(yīng)引起PR基因表達(dá)和抗病性，而且還賦予轉(zhuǎn)基因植物在不存在SAR誘導(dǎo)時(shí)對(duì)丁香假單胞菌的感染更強(qiáng)的抗性(Cao等，1997)。NF-κB/IκB信號(hào)傳導(dǎo)途徑NF-κB/IκB信號(hào)傳導(dǎo)途徑與從果蠅(Drosophila)到哺乳動(dòng)物范圍內(nèi)不同的生物體中的抗病性反應(yīng)有關(guān)。在哺乳動(dòng)物中，NF-κB/IκB信號(hào)傳導(dǎo)可被許多不同的刺激誘導(dǎo)，包括將細(xì)胞暴露在脂多糖中、腫瘤壞死因子中、白細(xì)胞介素1(IL-1)中或被病毒感染(Baeuerle和Baltimore，細(xì)胞87，13-20(1996)；Baldwin，免疫學(xué)年度綜述(Annu.Rev.Immunol.)14，649-681(1996))。被活化的途徑導(dǎo)致合成許多參與炎癥和免疫反應(yīng)的因子，例如IL-2、IL-6、IL-8和粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激因子(deMartin等，基因，152，253-255(1995))。在轉(zhuǎn)基因小鼠研究中，NF-κB/IκB信號(hào)傳導(dǎo)的敲出(knockout)導(dǎo)致免疫反應(yīng)的缺陷，包括對(duì)細(xì)菌和病毒病原體的敏感性增強(qiáng)(Beg和Baltimore，科學(xué)，274，782-784(1996)；VanAntwerp等，科學(xué)，274，787-789(1996)；Wang等，科學(xué)，274，784-787(1996)；Baeuerle和Baltimore(1996))。在擬南芥中，SAR在功能上與炎癥的相似性在于SAR活化后使正?？剐赃^(guò)程被激發(fā)從而導(dǎo)致抗病性的增強(qiáng)(Bi等，1995；Cao等，1994；Delaney等，1995；Delaney等，1994；Gaffney等，1993；Mauch-Mani和Slusarenko1996；Delaney，1997)。而且，該途徑的失活導(dǎo)致對(duì)細(xì)菌、病毒和真菌病原體的敏感性增強(qiáng)。令人感興趣的是，據(jù)報(bào)道SA阻斷哺乳動(dòng)物細(xì)胞中NF-κB的活化(Kopp和Ghosh，科學(xué)265，956-959(1994))，而在擬南芥中SA激活信號(hào)傳導(dǎo)。果蠅的細(xì)菌性感染激活了信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致合成許多抗真菌蛋白如cercropinB、防衛(wèi)素(defensin)、diptericin和drosomycin(Ip等，細(xì)胞75，753-763(1993)；Lemaitre等，細(xì)胞86，973-983(1996))。果蠅中這種誘導(dǎo)依賴于dorsal和dif兩個(gè)NF-κB同系物的基因產(chǎn)物，并受cactus，一個(gè)IκB同系物的阻遏。抗真菌和抗細(xì)菌蛋白合成降低的突變型對(duì)感染的抗性急劇下降。盡管進(jìn)行了很多研究和利用復(fù)雜的和強(qiáng)化的作物保護(hù)措施，包括植物的遺傳轉(zhuǎn)化，由于病害造成的損失每年仍有數(shù)十億美元。因此，存在持續(xù)的需求，根據(jù)不斷增加的對(duì)植物抗病性的遺傳基礎(chǔ)的理解發(fā)展新的作物保護(hù)措施。下列定義將有助于理解本發(fā)明。植物細(xì)胞植物的結(jié)構(gòu)和生理單位，包括原生質(zhì)體和細(xì)胞壁。術(shù)語(yǔ)“植物細(xì)胞”指植物的部分或衍生于植物的任何細(xì)胞。細(xì)胞的一些例子包括屬于活體植物一部分的分化的細(xì)胞；培養(yǎng)時(shí)分化的細(xì)胞；培養(yǎng)時(shí)未分化的細(xì)胞；未分化組織如愈傷組織或瘤；種子、胚胎、繁殖體和花粉的分化細(xì)胞。植物組織組織成結(jié)構(gòu)和功能單位的一組植物細(xì)胞。包括植株和培養(yǎng)物形成的植物的任何組織。該術(shù)語(yǔ)包括但不限于，整個(gè)植物、植物器官、植物種子、組織培養(yǎng)和任何一組組織成結(jié)構(gòu)和/或功能單位的植物細(xì)胞。本術(shù)語(yǔ)與上面列出的或本定義所包括的任何特定類型的植物組織相結(jié)合使用，或是單獨(dú)使用，但并不意在排除任何其它類型的植物組織。原生質(zhì)體沒(méi)有細(xì)胞壁的植物細(xì)胞。子代植物經(jīng)有性或無(wú)性繁殖的下一代植物，包括但不限于后代植物。轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中具有穩(wěn)定結(jié)合的重組DNA的植物。重組DNA通過(guò)連接不同來(lái)源的DNA片段利用重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的任何DNA分子。重組DNA技術(shù)在體外產(chǎn)生重組DNA并將重組DNA轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中使其表達(dá)或增殖的技術(shù)(參閱《簡(jiǎn)明生物醫(yī)學(xué)和分子生物學(xué)詞典》(ConciseDictionaryofBiomedicineandMolecularBiology)，Juo編，CRC出版，BocaRaton(1996))，例如將DNA轉(zhuǎn)入不同形式的原生質(zhì)體或細(xì)胞，包括如，(1)裸露的環(huán)狀、線狀或超螺旋形式的DNA，(2)在核小體、染色體、核或其部分中所含的DNA，(3)與其它分子相復(fù)合或結(jié)合的DNA，(4)包含在脂質(zhì)體、球狀體、細(xì)胞或原生質(zhì)體中的DNA，或(5)從宿主以外的生物體中(例如根癌土壤桿菌(Agrobacteriumtumefiaciens))轉(zhuǎn)移的DNA。這些或其它的將重組DNA引入細(xì)胞的不同方法為本領(lǐng)域所熟知，并可用于產(chǎn)生本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物。重組DNA技術(shù)還包括在Treco等，WO94/12650和Treco等，WO95/31560中描述的同源重組方法，其可用于增加單子葉植物的過(guò)氧化物酶活性。特殊地，調(diào)控區(qū)(如啟動(dòng)子)可被引入到植物基因組中以增加內(nèi)源過(guò)氧化物酶的表達(dá)。重組DNA技術(shù)還包括將缺失了所選表達(dá)信號(hào)的過(guò)氧化物酶編碼序列插入到單子葉植物中，并分析轉(zhuǎn)基因單子葉植物由于內(nèi)源控制序列引起的過(guò)氧化物酶的表達(dá)增加。這可能導(dǎo)致植物中過(guò)氧化物酶編碼序列拷貝數(shù)的增加。初始的將重組DNA插入到R0植物的基因組中并不限于通過(guò)傳統(tǒng)的植物育種方法獲得，而是由此處描述的技術(shù)方法得到的。初始插入之后，轉(zhuǎn)基因子代可以通過(guò)基本上傳統(tǒng)的育種方法進(jìn)行繁殖。嵌合基因含有至少兩個(gè)異源部分的DNA分子，例如衍生自預(yù)先存在的DNA序列的部分，但這些序列并不以預(yù)先存在的狀態(tài)相聯(lián)系，這些序列已經(jīng)利用重組DNA技術(shù)優(yōu)選地產(chǎn)生。表達(dá)盒含有啟動(dòng)子和終止子的DNA分子，在啟動(dòng)子和終止子之間可以插入一段編碼序列。編碼序列一種DNA分子，當(dāng)它轉(zhuǎn)錄并翻譯后導(dǎo)致多肽或蛋白質(zhì)的形成?；蛞环N不連續(xù)的染色體區(qū)，它含有負(fù)責(zé)控制表達(dá)即控制轉(zhuǎn)錄和翻譯的調(diào)控DNA序列，以及控制當(dāng)轉(zhuǎn)錄和翻譯后形成不同的多肽或蛋白質(zhì)的編碼序列的調(diào)控DNA序列。本發(fā)明描述了NIM1基因的鑒別、分離和表征，它編碼一個(gè)參與信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的蛋白質(zhì)，其應(yīng)答生物和化學(xué)誘導(dǎo)物，引起植物的系統(tǒng)獲得性抗性。因此，本發(fā)明公開(kāi)了編碼參與引起植物系統(tǒng)獲得性抗性的信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的NIM1蛋白之經(jīng)分離的DNA分子(NIM1基因)。在本發(fā)明范圍內(nèi)描述了一個(gè)編碼NIM1蛋白的DNA分子，在下列條件下雜交到克隆BAC-04，ATCC保藏號(hào)97543在1％BSA；520mMNaPO4，pH7.2；7％十二烷基硫酸鈉；1mMEDTA；250mMNaCl，55℃雜交18-24小時(shí)，55℃下在6×SSC中洗3次，每次15分鐘，在3×SSC中洗一次，洗15分鐘。在一個(gè)特別優(yōu)選實(shí)施方案中，NIM1基因包含在克隆BAC-04，ATCC保藏號(hào)97543中。進(jìn)一步描述了一個(gè)編碼NIM1蛋白的DNA分子，在下列條件下雜交到粘粒D7，ATCC保藏號(hào)97736在1％BSA；520mMNaPO4，pH7.2；7％十二烷基硫酸鈉；1mMEDTA；250mMNaCl，55℃雜交18-24小時(shí)，55℃下在6×SSC中洗3次，每次15分鐘，在3×SSC中洗一次，洗15分鐘。在一個(gè)特別優(yōu)選實(shí)施方案中，NIM1基因包含在粘粒D7，ATCC保藏號(hào)97736中。這里描述的NIM1基因可以分離自雙子葉植物如擬南芥、煙草、黃瓜或番茄?；蛘?，NIM1基因可以分離自單子葉植物如玉米、小麥或大麥。進(jìn)一步描述了含有SEQIDNO3中公開(kāi)的氨基酸序列編碼的NIM1蛋白。進(jìn)一步描述了NIM1基因編碼序列在下列條件下與SEQIDNO2中公開(kāi)的編碼序列雜交在1％BSA；520mMNaPO4，pH7.2；7％十二烷基硫酸鈉；1mMEDTA；250mMNaCl，55℃雜交18-24小時(shí)，55℃下在6×SSC中洗三次，每次15分鐘，在3×SSC中洗1次，洗15分鐘。在一個(gè)特別優(yōu)選實(shí)施方案中，NIM1基因編碼序列含有在SEQIDNO2中公開(kāi)的編碼序列。本發(fā)明還描述了含有植物中有活性的啟動(dòng)子有效地連接到NIM1基因編碼序列的嵌合基因，含有這種嵌合基因的重組載體，其中該載體能夠穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化到宿主中，以及用該載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的宿主。優(yōu)選地，宿主是植物，如一種下列農(nóng)業(yè)上重要的作物水稻、小麥、大麥、黑麥、玉米、馬鈴薯、胡蘿卜、甜馬鈴薯、甜菜、菜豆、豌豆、菊苣、萵苣、白菜、花椰菜、花莖甘藍(lán)、蕪菁、蘿卜、菠菜、蘆筍、洋蔥、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、胡蘿卜、南瓜、西葫蘆、小西葫蘆、黃瓜、蘋果、梨、溫孛、甜瓜、李子、櫻桃、桃、蜜桃、杏、草莓、葡萄、覆盆子、黑莓、鳳梨、鱷梨、番木瓜樹(shù)、芒果、香蕉、大豆、煙草、番茄、高粱和甘蔗。在一個(gè)特別優(yōu)選實(shí)施方案中，NIM1蛋白在轉(zhuǎn)化植物中以高于野生型植物的水平表達(dá)。本發(fā)明還涉及通過(guò)利用重組載體轉(zhuǎn)化植物賦予植物CIM表型的方法，該重組載體含有嵌合基因，嵌合基因本身含有在植物中有活性的有效地連接到NIM1基因編碼序列的啟動(dòng)子，其中編碼的NIM1蛋白在轉(zhuǎn)化植物中以高于野生型植物的水平表達(dá)。而且，本發(fā)明涉及通過(guò)利用重組載體轉(zhuǎn)化植物活化植物中系統(tǒng)獲得性抗性的方法，該重組載體含有嵌合基因，嵌合基因本身含有在植物中有活性的有效地連接到NIM1基因編碼序列的啟動(dòng)子，其中編碼的NIM1蛋白在轉(zhuǎn)化植物中以高于野生型植物的水平表達(dá)。另外，本發(fā)明還涉及通過(guò)利用重組載體轉(zhuǎn)化植物賦予植物廣譜抗病性的方法，該重組載體含有嵌合基因，嵌合基因本身含有在植物中有活性的有效地連接到NIM1基因編碼序列的啟動(dòng)子，其中編碼的NIM1蛋白在轉(zhuǎn)化植物中以高于野生型植物的水平表達(dá)。本發(fā)明的另一個(gè)方面是利用認(rèn)識(shí)到植物中的SAR途徑表現(xiàn)出與哺乳動(dòng)物和果蠅中的NF-κB/IκB調(diào)節(jié)策略在功能上相似，以及發(fā)現(xiàn)NIM1基因產(chǎn)物是哺乳動(dòng)物信號(hào)傳導(dǎo)因子IκB的α亞類的結(jié)構(gòu)同系物。IκB的突變已被描述，其作用為超阻遏物或NF-κB/IκB調(diào)節(jié)策略的顯性-負(fù)性調(diào)節(jié)子。本發(fā)明包括野生型NIM1基因(SEQNO2)的變形體，其作用為SAR信號(hào)傳導(dǎo)途徑的顯性-負(fù)性調(diào)節(jié)子。這些NIM1的變形體賦予由其轉(zhuǎn)化的植物以相反的表型如nim1突變型；植物，即用NIM1變形體轉(zhuǎn)化的植物，表現(xiàn)出組成型SAR基因表達(dá)和CIM表型。本發(fā)明還包括根據(jù)此前定義能與本發(fā)明的DNA分子雜交的DNA分子，但優(yōu)選地與一個(gè)寡核苷酸探針在中度嚴(yán)格的條件下雜交，該探針可從含有所說(shuō)的NIM1變形體的連續(xù)編碼序列的DNA分子中得到，它至少10個(gè)核苷酸長(zhǎng)。影響雜交穩(wěn)定性的因素決定雜交的嚴(yán)格度。一個(gè)這樣的因素是熔解溫度Tm，其可以根據(jù)在《DNA探針》，GeorgeH.Keller和MarkM.Manak編，Macmillan出版公司出版，1993年，第一部分分子雜交技術(shù)，自第8頁(yè)起提供的公式容易地計(jì)算出來(lái)。優(yōu)選的雜交溫度是在大約低于計(jì)算的熔解溫度Tm25℃的范圍，優(yōu)選地在大約低于計(jì)算的熔解溫度Tm12-15℃的范圍，對(duì)于寡核苷酸則在大約低于計(jì)算的熔解溫度Tm5-10℃的范圍。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，NIM1基因被改變，使得編碼產(chǎn)物在相應(yīng)于野生型擬南NIM1氨基酸序列(SEQIDNO3)的55和59位點(diǎn)的氨基酸位點(diǎn)上以丙氨酸取代了絲氨酸。一個(gè)NIM1基因變形體的優(yōu)選實(shí)施方案的例子示于SEQIDNO22中，它導(dǎo)致了這些絲氨酸殘基變?yōu)楸彼釟埢?。在氨基酸位點(diǎn)55和59上具有丙氨酸取代絲氨酸的NIM1蛋白一個(gè)示范性的顯性-負(fù)性形式示于SEQIDNO23。本發(fā)明還包括NIM1的等位基因的變形體，其中等位基因的編碼序列在中度嚴(yán)格的條件下與SEQIDNO22中所示的編碼序列雜交，特別優(yōu)選是在下列條件在1％BSA；520mMNaPO4，pH7.2；7％十二烷基硫酸鈉；1mMEDTA；250mMNaCl，55℃雜交18-24小時(shí)，55℃下在6×SSC中洗3次，每次15分鐘，在3×SSC中洗1次，15分鐘。在這些實(shí)施方案中，在上述條件下與SEQIDNO22雜交的NIM1等位基因被改變，使得編碼產(chǎn)物在相應(yīng)于SEQIDNO22的位點(diǎn)55和59的氨基酸位點(diǎn)具有取代絲氨酸的丙氨酸。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，NIM1基因被改變，使得編碼產(chǎn)物的N-末端被截短，去除了可能作為潛在的遍在蛋白質(zhì)化位點(diǎn)的賴氨酸殘基，另外還去除了相應(yīng)于野生型蛋白的位點(diǎn)55和59的氨基酸位點(diǎn)上的絲氨酸。這種NIM1基因變形體的優(yōu)選實(shí)施方案的一個(gè)例子，編碼具有N-末端缺失的基因產(chǎn)物，示于SEQIDNO24。具有N-末端缺失的NIM1蛋白的一個(gè)示范性的顯性-負(fù)性形式示于SEQIDNO25。本發(fā)明還包括NIM1的等位基因的變形體，其中該等位基因的編碼序列在中度嚴(yán)格的條件下與SEQIDNO24中所示的編碼序列雜交，特別優(yōu)選的是下列條件在1％BSA；520mMNaPO4，pH7.2；7％十二烷基硫酸鈉；1mMEDTA；250mMNaCl，55℃雜交18-24小時(shí)，55℃下在6×SSC中洗3次，每次15分鐘，在3×SSC中洗1次，15分鐘。在這些實(shí)施方案中，在上述條件下與SEQIDNO24雜交的NIM1等位基因被改變，使得編碼產(chǎn)物N-末端缺失，去除了可能作為潛在的遍在蛋白質(zhì)化位點(diǎn)的賴氨酸殘基，另外還去除了相應(yīng)于野生型基因產(chǎn)物的位點(diǎn)55和59的氨基酸位點(diǎn)上的絲氨酸。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，NIM1基因被改變，使得編碼產(chǎn)物的C-末端被截短，相信通過(guò)阻斷在野生型基因產(chǎn)物C-末端的絲氨酸和蘇氨酸殘基的組成型磷酸化導(dǎo)致了內(nèi)在穩(wěn)定性的提高。這種NIM1基因變形體的優(yōu)選實(shí)施方案的一個(gè)例子示于SEQIDNO26，其編碼C-末端缺失的基因產(chǎn)物。具有C-末端缺失的NIM1蛋白的一個(gè)示范性的顯性-負(fù)性形式示于SEQIDNO27。本發(fā)明還包括NIM1等位基因的變形體，其中該等位基因的編碼序列在中度嚴(yán)格的條件下與SEQIDNO26中所示的編碼序列雜交，特別優(yōu)選的是下列條件在1％BSA；520mMNaPO4，pH7.2；7％十二烷基硫酸鈉；1mMEDTA；250mMNaCl，55℃雜交18-24小時(shí)，55℃下在6×SSC中洗3次，每次15分鐘，在3×SSC中洗1次，15分鐘。在這些實(shí)施方案中，在上述條件下與SEQIDNO26雜交的NIM1等位基因被改變，使得編碼產(chǎn)物C-末端缺失，去除了絲氨酸和蘇氨酸殘基。而在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，NIM1基因被改變，使得編碼產(chǎn)物的N-末端缺失和C-末端被截短，其具有本發(fā)明的上述兩個(gè)實(shí)施方案的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案是NIM1蛋白的變形體，它在相應(yīng)于SEQIDNO2的大約氨基酸位點(diǎn)1-125處的氨基酸的N-末端被截短，以及在相應(yīng)于SEQIDNO3的大約氨基酸位點(diǎn)522-593處的C-末端被截短。這種NIM1基因變形體的優(yōu)選實(shí)施方案的一個(gè)例子示于SEQIDNO28中，其編碼基因N-末端和C-末端缺失的基因產(chǎn)物。具有C-末端缺失的NIM1蛋白的示范性的顯性-負(fù)性形式示于SEQIDNO29中。本發(fā)明還包括NIM1等位基因的變形體，其中該等位基因的編碼序列在中度嚴(yán)格的條件下與SEQIDNO28中所示的編碼序列雜交，特別優(yōu)選的是下列條件在1％BSA；520mMNaPO4，pH7.2；7％十二烷基硫酸鈉；1mMEDTA；250mMNaCl，55℃雜交18-24小時(shí)，55℃下在6×SSC中洗3次，每次15分鐘，在3×SSC中洗1次，15分鐘。在這些實(shí)施方案中，在上述條件下與SEQIDNO28雜交的NIM1等位基因被改變，使得編碼產(chǎn)物N-末端缺失，去除了可能作為潛在的遍在蛋白質(zhì)化位點(diǎn)的賴氨酸殘基，另外還去除了相應(yīng)于野生型基因產(chǎn)物的位點(diǎn)55和59的氨基酸位點(diǎn)上的絲氨酸，以及C-末端缺失，去除了絲氨酸和蘇氨酸殘基。在本發(fā)明的甚至另一個(gè)實(shí)施方案中，NIM1基因被改變，使得編碼產(chǎn)物基本上僅僅由野生型基因產(chǎn)物的錨蛋白結(jié)構(gòu)域組成。優(yōu)選的是一個(gè)分離的DNA分子，其中所說(shuō)的NIM1蛋白變形體基本上由相應(yīng)于SEQIDNO3的大約氨基酸位點(diǎn)103-362的錨蛋白基元組成。這種NIM1基因變形體的優(yōu)選實(shí)施方案的一個(gè)例子示于SEQIDNO30中，其編碼錨蛋白結(jié)構(gòu)域?；旧嫌慑^蛋白結(jié)構(gòu)域組成的NIM1蛋白的示范性的顯性-負(fù)性形式示于SEQIDNO31中。本發(fā)明還包括NIM1等位基因的變形體，其中該等位基因的編碼序列在中度嚴(yán)格的條件下與SEQIDNO30中所示的編碼序列雜交，特別優(yōu)選的是下列條件在1％BSA；520mMNaPO4，pH7.2；7％十二烷基硫酸鈉；1mMEDTA；250mMNaCl，55℃雜交18-24小時(shí)，55℃下在6×SSC中洗3次，每次15分鐘，在3×SSC中洗1次，15分鐘。在這些實(shí)施方案中，在上述條件下與SEQIDNO30雜交的NIM1等位基因被改變，使得編碼產(chǎn)物基本上由野生型基因產(chǎn)物的錨蛋白結(jié)構(gòu)域組成。因此，本發(fā)明涉及編碼NIM1基因變形體的DNA分子，例如上述那些和利用中度嚴(yán)格條件與其雜交的所有DNA分子。本發(fā)明還包括含有在植物中有活性的啟動(dòng)子有效地連接到一個(gè)上述的NIM1基因變形體的嵌合基因，含有這種嵌合基因的重組載體，其中該載體能夠穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化到宿主中，以及用該載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的宿主。優(yōu)選地，宿主細(xì)胞是植物、植物細(xì)胞和其后代，例如一種下列農(nóng)業(yè)上重要的作物水稻、小麥、大麥、黑麥、玉米、馬鈴薯、胡蘿卜、甜馬鈴薯、甜菜、菜豆、豌豆、菊苣、萵苣、白菜、花椰菜、花莖甘藍(lán)、蕪菁、蘿卜、菠菜、蘆筍、洋蔥、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、胡蘿卜、南瓜、西葫蘆、小西葫蘆，黃瓜、蘋果、梨、溫孛、甜瓜、李子、櫻桃、桃、蜜桃、杏、草莓、葡萄、覆盆子、黑莓、鳳梨、鱷梨、番木瓜樹(shù)、芒果、香蕉、大豆、煙草、番茄、高粱和甘蔗。本發(fā)明還涉及通過(guò)利用重組載體轉(zhuǎn)化植物賦予植物CIM表型的方法，該重組載體含有嵌合基因，嵌合基因本身含有在植物中有活性的有效地連接到一個(gè)上述的NIM1基因變形體的啟動(dòng)子，其中編碼顯性-負(fù)性形式的NIM1蛋白在轉(zhuǎn)化植物中表達(dá)并賦予植物CIM表型。而且，本發(fā)明涉及通過(guò)利用重組載體轉(zhuǎn)化植物活化植物系統(tǒng)中獲得性抗性的方法，該重組載體含有嵌合基因，嵌合基因本身含有在植物中有活性的有效地連接到一個(gè)上述的NIM1基因變形體的啟動(dòng)子，其中編碼顯性-負(fù)性形式的NIM1蛋白在轉(zhuǎn)化植物中表達(dá)并激活植物中的系統(tǒng)獲得性抗性。另外，本發(fā)明還涉及通過(guò)利用重組載體轉(zhuǎn)化植物賦予植物廣譜抗病性的方法，該重組載體含有嵌合基因，嵌合基因本身含有在植物中有活性的有效地連接到一個(gè)上述的NIM1基因變形體的啟動(dòng)子，其中編碼顯性-負(fù)性形式的NIM1蛋白在轉(zhuǎn)化植物中表達(dá)并賦予植物廣譜抗病性。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及篩選參與導(dǎo)致植物系統(tǒng)獲得性抗性的信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的NIM1基因的方法，包括用一個(gè)在下列條件下與SEQIDNO2中所示的編碼序列雜交的NIM1編碼序列探查該植物的基因組或cDNA文庫(kù)在1％BSA；520mMNaPO4，pH7.2；7％十二烷基硫酸鈉；1mMEDTA；250mMNaCl，55℃雜交18-24小時(shí)，55℃下在6×SSC中洗3次，每次15分鐘，在3×SSC中洗1次，15分鐘。本發(fā)明還包括下列內(nèi)容一種根據(jù)本發(fā)明的經(jīng)分離的DNA分子，其中所說(shuō)的NIM1蛋白的變形體在相應(yīng)于SEQIDNO3的55和59位點(diǎn)的氨基酸處以丙氨酸取代了絲氨酸，其中該DNA分子在下列條件下與SEQIDNO22中所示的核苷酸序列雜交在1％BSA；520mMNaPO4，pH7.2；7％十二烷基硫酸鈉；1mMEDTA；250mMNaCl，55℃雜交18-24小時(shí)，55℃下在6×SSC中洗3次，每次15分鐘，在3×SSC中洗1次，15分鐘。一種根據(jù)本發(fā)明的經(jīng)分離的DNA分子，其中所說(shuō)的NIM1蛋白的變形體在相應(yīng)于SEQIDNO3的大約1-125氨基酸位點(diǎn)的氨基酸處N-末端被截短，其中該DNA分子在下列條件下與SEQIDNO24中所示的核苷酸序列雜交在1％BSA；520mMNaPO4，pH7.2；7％十二烷基硫酸鈉；1mMEDTA；250mMNaCl，55℃雜交18-24小時(shí)，55℃下在6×SSC中洗3次，每次15分鐘，在3×SSC中洗1次，15分鐘。一種根據(jù)本發(fā)明的經(jīng)分離的DNA分子，其中所說(shuō)的NIM1蛋白的變形體在相應(yīng)于SEQIDNO3的大約522-593氨基酸位點(diǎn)的氨基酸處C-末端被截短，其中該DNA分子在下列條件下與SEQIDNO26中所示的核苷酸序列雜交在1％BSA；520mMNaPO4，pH7.2；7％十二烷基硫酸鈉；1mMEDTA；250mMNaCl，55℃雜交18-24小時(shí)，55℃下在6×SSC中洗3次，每次15分鐘，在3×SSC中洗1次，15分鐘。一種根據(jù)本發(fā)明的經(jīng)分離的DNA分子，其中所說(shuō)的NIM1蛋白的變形體含有SEQIDNO28中所示的氨基酸序列，其中該DNA分子在下列條件下與SEQIDNO28中所示的核苷酸序列雜交在1％BSA；520mMNaPO4，pH7.2；7％十二烷基硫酸鈉；1mMEDTA；250mMNaCl，55℃雜交18-24小時(shí)，55℃下在6×SSC中洗3次，每次15分鐘，在3×SSC中洗1次，15分鐘。一種根據(jù)本發(fā)明的經(jīng)分離的DNA分子，其中所說(shuō)的NIM1蛋白的變形體基本上由相應(yīng)于SEQIDNO3的大約103-362氨基酸位點(diǎn)處的錨蛋白基元組成，其中該DNA分子在下列條件下與SEQIDNO30中所示的核苷酸序列雜交在1％BSA；520mMNaPO4，pH7.2；7％十二烷基硫酸鈉；1mMEDTA；250mMNaCl，55℃雜交18-24小時(shí)，55℃下在6×SSC中洗3次，每次15分鐘，在3×SSC中洗1次，15分鐘。一種通過(guò)誘變構(gòu)建的本發(fā)明的NIM1基因的變形體。本發(fā)明的經(jīng)分離的DNA分子激活植物細(xì)胞、植物及其后代中的系統(tǒng)獲得性抗性的用途。本發(fā)明的經(jīng)分離的DNA分子賦予植物細(xì)胞、植物及其后代廣譜抗病性的用途。本發(fā)明的經(jīng)分離的DNA分子賦予植物細(xì)胞、植物及其后代CIM表型的用途。本發(fā)明的抗性植物及其后代通過(guò)育種使抗病性狀體現(xiàn)在植物種系中的用途。NIM1基因的變異體賦予由其轉(zhuǎn)化的植物以抗病性并激活SAR基因表達(dá)的用途。一種產(chǎn)生NIM1基因變形體的方法。一種產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因親本植物的轉(zhuǎn)基因后代的方法，轉(zhuǎn)基因植物含有編碼本發(fā)明的NIM1蛋白變形體的經(jīng)分離的DNA分子，該方法包括用本發(fā)明的重組載體分子轉(zhuǎn)化親本植物，并通過(guò)已知的植物育種技術(shù)將其性狀轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)基因親本植物的后代中去。一種產(chǎn)生包括含有編碼NIM1蛋白變形體的DNA部分之DNA部分的DNA分子的方法(a)制備能夠與NIM1基因變形體或mRNA特異雜交的核苷酸探針，其中該探針包括編碼NIM1變形體至少10個(gè)核苷酸長(zhǎng)的序列的連續(xù)部分。(b)利用根據(jù)步驟(a)制備的核苷酸探針從選定的生物體之克隆的基因組DNA片段或cDNA片段群體中探查其它NIM1變形體的編碼序列；以及(c)分離并擴(kuò)增包括含有編碼NIM1蛋白變形體的DNA部分之DNA部分的DNA分子。一種分離含有NIM1變形體序列的DNA部分之DNA分子的方法，它包括(a)制備能夠與NIM1基因變形體或mRNA特異雜交的核苷酸探針，其中該探針包括編碼植物NIM1蛋白變形體序列至少10個(gè)核苷酸長(zhǎng)的連續(xù)部分；(b)利用根據(jù)步驟(a)制備的核苷酸探針從選定的生物體之克隆的基因組DNA片段或cDNA片段群體中探查其它NIM1變形體編碼序列；以及(c)分離包括含有NIM1基因變形體的DNA部分之DNA分子。一種產(chǎn)生表達(dá)水平高于野生型的NIM1基因或其功能變異體和突變型的轉(zhuǎn)基因植物的方法。一種產(chǎn)生表達(dá)水平高于野生型的NIM1基因或其功能變異體和突變型的轉(zhuǎn)基因植物的方法，其中NIM1基因的表達(dá)水平至少是野生型植物中的NIM1基因表達(dá)水平的2倍以上。一種產(chǎn)生表達(dá)水平高于野生型的NIM1基因或其功能變異體和突變型的轉(zhuǎn)基因植物的方法，其中NIM1基因的表達(dá)水平至少是野生型植物中的NIM1基因表達(dá)水平的10倍以上。nim突變型表型本發(fā)明涉及突變型植物以及從其中分離的基因，它們對(duì)病原體感染的正常反應(yīng)是缺陷的，這在于它們不能表達(dá)與SAR相關(guān)的基因。這些突變型是指nim突變型(非誘導(dǎo)免疫)，和根據(jù)它們對(duì)宿主植物的許多病原體菌株和病變型是敏感的，以及對(duì)通常不感染宿主植物而通常感染其它宿主的病原體也是敏感的這一特點(diǎn)而稱為“廣泛疾病敏感的”(UDS)。這些突變型可以這樣選擇到用誘變劑處理種子或其它生物材料，然后通過(guò)用已知的SAR化學(xué)誘導(dǎo)物處理后代植物選擇UDS表型的后代植物，然后用已知的病原體感染植物。在這些環(huán)境下，非誘導(dǎo)突變型發(fā)生嚴(yán)重的病癥，而野生型植物由化合物誘導(dǎo)產(chǎn)生系統(tǒng)獲得性抗性。nim突變型可以從通過(guò)化學(xué)和輻射突變產(chǎn)生的群體中選擇到，同樣也可從通過(guò)T-DNA插入和轉(zhuǎn)座子誘導(dǎo)突變產(chǎn)生的群體中選擇到。產(chǎn)生突變型植物種系的技術(shù)在本領(lǐng)域是眾所周知的。nim突變型可用作在田間發(fā)病實(shí)驗(yàn)中評(píng)價(jià)病害壓力的指示物，所謂的野生型(即非突變型)植物的天然抗性表型可能有變化，因此不能提供敏感性的可靠標(biāo)準(zhǔn)。而且，nim植物還可用于候選抗病性轉(zhuǎn)基因的實(shí)驗(yàn)。利用nim原種種系作為轉(zhuǎn)基因受體，轉(zhuǎn)基因?qū)共⌒缘呢暙I(xiàn)可以直接根據(jù)敏感性的基礎(chǔ)水平進(jìn)行評(píng)價(jià)。而且，nim也用于理解植物-病原體相互作用的工具中。nim宿主植物對(duì)病原體的攻擊沒(méi)有系統(tǒng)性反應(yīng)，而且病原體不減弱的發(fā)生是一個(gè)理想的系統(tǒng)，其可用于研究它與宿主的生物學(xué)相互作用。nim宿主植物對(duì)于其通常敏感的宿主范圍之外的病原體也可能是敏感的，這些植物還在宿主-病原體相互作用的分子、遺傳和生物學(xué)研究中具有明顯的實(shí)用性。而且，nim植物的UDS表型還使它們?cè)跉⒄婢鷦┖Y選方面有實(shí)用性。在特定的宿主中篩選的nim突變型對(duì)于利用宿主和宿主的病原體篩選殺真菌劑具有相當(dāng)?shù)膶?shí)用性。其優(yōu)越性在于突變型的UDS表型克服了宿主所面臨的對(duì)不同的病原體和病變型具有不同敏感性，或?qū)σ恍┎≡w和病變型甚至具抗性的問(wèn)題。nim突變型對(duì)于利用異源宿主篩選針對(duì)一些病原體和病變型的殺真菌劑更具有實(shí)用性，異源宿主就是通常不屬于特定病原體的宿主范圍以內(nèi)的宿主。因此，擬南芥的nim突變型對(duì)其它種類(如作物類植物)的病原體的敏感性促進(jìn)了針對(duì)作物類植物的重要病原體之化合物中有效殺真菌劑的篩選過(guò)程。擬南芥nim1突變型在Delaney等，1995中描述了稱為nim1(非誘導(dǎo)免疫)的擬南芥突變型，經(jīng)INA處理后支持寄生霜霉(即霜霉病的致病菌)的生長(zhǎng)。盡管nim1在被病原體感染后能夠積累SA，但SAR基因表述和抗病性都不能被誘導(dǎo)，提示此突變阻斷了SA的下游途徑。nim1對(duì)INA或BTH的反應(yīng)能力也受到損傷，提示此阻斷存在于這些化學(xué)物作用的下游(Delaney等，1995；Lawton等，1996)。通過(guò)將2周齡植物用0.33mMINA噴霧然后接種寄生霜霉，自80,000株T-DNA標(biāo)記的擬南芥Issilewskija生態(tài)型(Ws-0)群體分離出第一個(gè)擬南芥nim1突變型(此處命名為nim1-1)(Delaney等，1995)。經(jīng)INA處理后支持真菌生長(zhǎng)的植物被選為推斷的突變型。5個(gè)另外的突變型(此處命名為nim1-2、nim1-3、nim1-4、nim1-5和nim1-6)從甲基磺酸乙酯(EMS)誘變的Ws-0群體的280,000株M2植物中分離。為確定突變型是顯性的還是隱性的，將Ws-0植物用作花粉供體與這些突變型的每一個(gè)雜交。根據(jù)經(jīng)INA處理后支持真菌生長(zhǎng)的能力選擇F1植物。如表3所示的例子，所有的nim1-1、nim1-2、nim1-3、nim1-4和nim1-6F1植物表型都是野生型，說(shuō)明每個(gè)種系都是隱性突變。nim1-5在所有35個(gè)F1植物中表現(xiàn)nim表型，說(shuō)明此特定突變是顯性的。為證實(shí)這一點(diǎn)，利用nim1-5作為花粉供體給Ws-0植物受精進(jìn)行互交。在這種情況下，所有18個(gè)F1植物表型都是nim，證明了nim1-5突變的顯性。為確定nim1-2到nim1-6的突變是否為以前表征的nim1-1突變的等位基因，來(lái)自nim1-1的花粉用于給nim1-2到nim1-6受精。因?yàn)閚im1-1帶有卡那霉素抗性，通過(guò)抗生素抗性來(lái)鑒定F1子代。在所有情況下，卡那霉素抗性的F1植物為nim，說(shuō)明它們都是nim1-1突變的等位基因。因?yàn)閚im1-5突變是顯性的而且很明顯突變是純合的，就必須分析在F2代中nim1-1的互補(bǔ)作用。如果nim1-1和nim1-5是等位基因，那么預(yù)期所有的F2植物都具nim表型。如果不是的話，那么16株F2植物中的13株將預(yù)期具有nim表型。94株植物中的88株在INA處理后確實(shí)支持真菌生長(zhǎng)。6株植物顯示葉片上有黑斑的相關(guān)表型，為損傷模擬表型的痕跡，經(jīng)INA處理后幾乎不支持真菌生長(zhǎng)。因?yàn)閚im1-5帶有NIM1基因中的點(diǎn)突變(參見(jiàn)下文)，它被視為一個(gè)nim1等位基因。為了確定不同nim1等位基因的相對(duì)強(qiáng)度，用SA、INA或BTH預(yù)處理后分析每個(gè)突變體在正常生長(zhǎng)條件下寄生霜霉的生長(zhǎng)。如表1所示，在正常生長(zhǎng)時(shí)，nim1-1、nim1-2、nim1-3、nim1-4和nim1-6都支持大約相同速率的真菌生長(zhǎng)，比Ws-0對(duì)照稍微快一些。nim1-5是例外，其中真菌的生長(zhǎng)相對(duì)于其它nim1突變型和Ws-0對(duì)照而言被延遲了數(shù)天，但最終所有的nim1-5植物都死于真菌。SA處理后，突變型可以分成三類nim1-4和nim1-6表現(xiàn)相對(duì)較快的真菌生長(zhǎng)；nim1-1、nim1-2和nim1-3植物表現(xiàn)稍微慢速的真菌生長(zhǎng)；在nim1-5中的真菌生長(zhǎng)比未處理的Ws-0對(duì)照的生長(zhǎng)速率更慢。INA或BTH處理后，突變型似乎也可以分為三類，其中nim1-4是經(jīng)化學(xué)處理后限制真菌生長(zhǎng)的能力受到最嚴(yán)重?fù)p害的；nim1-1、nim1-2、nim1-3和nim1-6都受到中等損害；而nim1-5僅受到輕微損害。在這些實(shí)驗(yàn)中，Ws-0經(jīng)INA或BTH處理后不支持真菌生長(zhǎng)。于是，從經(jīng)化學(xué)處理后抑制真菌生長(zhǎng)來(lái)看，突變型分為三類，nim1-4受到最嚴(yán)重?fù)p害，nim1-1、nim1-2、nim1-3和nim1-6顯示中等的對(duì)真菌的抑制，而nim1-5的真菌抗性僅有輕微損害。PR-1mRNA的積累也用作表征不同nim1等位基因的標(biāo)準(zhǔn)。用水或化學(xué)處理后三天，或接種相容性真菌(寄生霜霉分離物Emwa)14天后，從植物中提取RNA。圖3中的RNA凝膠印跡顯示經(jīng)SA、INA或BTH處理或被寄生霜霉感染的野生型植物其PR-1mRNA積累到很高水平。相對(duì)于野生型，在nim1-1、nim1-2和nim1-3植物中PR-1mRNA的積累經(jīng)化學(xué)處理后急劇下降。經(jīng)寄生霜霉感染后PR-1mRNA也下降，但在這些突變型中仍有一些積累。在nim1-4和nim1-6植物中，相對(duì)于其它等位基因，經(jīng)化學(xué)處理后PR-1mRNA的積累下降更急劇(長(zhǎng)時(shí)間暴露更明顯)，而被寄生霜霉感染后PR-1mRNA的積累顯著降低，這支持了它們是特別強(qiáng)的nim1等位基因的觀點(diǎn)。有趣的是，PR-1mRNA的積累在nim1-5中提高了，但只是經(jīng)化學(xué)處理或寄生霜霉感染后被輕微誘導(dǎo)。根據(jù)PR-1mRNA的積累和真菌感染，突變型分為三類被嚴(yán)重?fù)p害的等位基因(nim1-4和nim1-6)；被中等損害的等位基因(nim1-1、nim1-2和nim1-3)；以及被輕度損害的等位基因(nim1-5)。nim1突變的精細(xì)結(jié)構(gòu)作圖為了確定NIM1的粗略的圖譜位置，鑒定了來(lái)自nim1-1(Ws-0)和Landsbergerecta(Ler)雜交的74株F2nim表型植物對(duì)寄生霜霉的敏感性和經(jīng)INA處理后失去了積累PR-1mRNA的情況。在測(cè)試了許多簡(jiǎn)單序列長(zhǎng)度多態(tài)性(SSLP)標(biāo)記后(Bell和Ecker，1994)，發(fā)現(xiàn)nim1位于染色體1的短臂上距nga128約8.2厘摩(cM)、距nga111約8.2cM的位置。在隨后的分析中，發(fā)現(xiàn)nim1-1位于nga111和SSLP標(biāo)記ATHGENEA約4cM之間。為了精細(xì)結(jié)構(gòu)作圖，根據(jù)它們不能積累PR-1mRNA和經(jīng)INA處理后支持真菌生長(zhǎng)的能力，鑒定了衍生自nim1-1和1erDP23雜交F2群體的1138株nim植物。從這些植物中提取DNA并在ATHGENEA和nga111上檢查接合性。如圖5A-5D中所示，93個(gè)重組染色體被鑒定位于ATHGENEA和nim1之間，遺傳距離大約為4.1cM(93比2276)，以及239個(gè)重組染色體被鑒定位于nga111和nim1之間，表示遺傳距離大約為10.5cM(239比2276)。在ATHGENEA到nga111的間隔中有信息的重組子被進(jìn)一步利用擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)進(jìn)行分析(Vos等，1995)。開(kāi)始，鑒定了位于ATHGENEA和nga111之間的10個(gè)AFLP標(biāo)記，并利用它們構(gòu)建了該區(qū)域的低分辨率圖譜(圖5A)。AFLP標(biāo)記W84.2(距nim11cM)和W85.1(距nim10.6cM)被用于從CIC(Centred′EtudeduPolymorphismeHumain，INRA和CNRS)文庫(kù)中分離酵母人工染色體(YAC)克隆(Creusot等，1995)。用標(biāo)記W84.2鑒定了兩個(gè)YAC克隆，CIC12H07和CIC12F04；用標(biāo)記W85.1鑒定了兩個(gè)YAC克隆，CIC7E03和CIC10G07(數(shù)據(jù)沒(méi)有列出)。但是，確定在兩套鄰近YAC克隆之間有一個(gè)裂隙。從這一點(diǎn)，細(xì)菌人工染色體(BAC)和重疊了CIC12H07和CIC12F04的P1克隆被分離并作圖，然后通過(guò)三個(gè)順序步行步驟將BAC/P1毗連序列群向NIM1延伸(Liu等，1995；Chio等，1995)。在步行的不同時(shí)間，產(chǎn)生了對(duì)BAC或P1克隆特異的新AFLP，它們被用于確定NIM1基因是否被交叉(cross)。確定了當(dāng)分離BAC和P1克隆時(shí)交叉了NIM1，產(chǎn)生了AFLP標(biāo)記L84.6a和L84.8。發(fā)現(xiàn)于P1克隆P1-18、P1-17和P1-21的AFLP標(biāo)記鑒定了三個(gè)重組子，發(fā)現(xiàn)于P1克隆P1-20、P1-22和P1-23和P1-24及BAC克隆的AFLP標(biāo)記鑒定了一個(gè)重組子。因?yàn)檫@些克隆重疊形成了大的毗連序列群(＞100kb)，并包含鄰近nim1的AFLP標(biāo)記，該基因被定位于毗連序列群上。含有毗連序列群的BAC和P1克隆被用于產(chǎn)生8個(gè)另外的AFLP標(biāo)記，這說(shuō)明nim1位于L84.Y1和L84.8之間，代表一個(gè)約0.09cM的裂隙。利用BAC-06、BAC-04和P1-18的DNA在土壤桿菌相容的T-DNA粘粒載體pCLD04541中構(gòu)建了粘粒文庫(kù)。利用衍生自這些克隆的AFLP標(biāo)記形成了一個(gè)粘粒毗連序列群。物理作圖顯示L84.Y1和L84.8之間的物理距離大于90kb，表示遺傳距離和物理距離之比為每cM大約1兆堿基。為了有利于后面鑒定NIM1基因，測(cè)定了BAC-04的DNA序列。NIM1基因的分離為了鑒定哪個(gè)粘粒含有NIM1基因，實(shí)施例的表4中列出的12個(gè)粘粒被轉(zhuǎn)化至nim1-1，根據(jù)它們互補(bǔ)突變型表型的能力評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)化子。通過(guò)測(cè)定經(jīng)INA處理后轉(zhuǎn)化子積累PR-1mRNA的能力，發(fā)現(xiàn)粘粒D5、E1和D7都互補(bǔ)nim1-1。對(duì)這些粘粒的末端進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)它們位于BAC-04的DNA序列上。在此DNA區(qū)域有9918個(gè)堿基對(duì)由含有NIM1基因的D7和D5所共享。如圖5D中所示，在這個(gè)10kb序列上鑒定了四個(gè)推斷的基因區(qū)段。區(qū)段1能夠潛在地編碼一個(gè)19105D的蛋白質(zhì)，區(qū)段3能夠編碼一個(gè)44554D的蛋白質(zhì)，而區(qū)段4能夠編碼一個(gè)52797D的蛋白質(zhì)。區(qū)段2具有4個(gè)緊緊連在一起的不同大小的開(kāi)放閱讀框，提示是一個(gè)有三個(gè)內(nèi)含子的基因。利用NetPlantGene程序(Hebsgoard等，1996)分析顯示很可能開(kāi)放閱讀框可被一起剪接以形成一個(gè)編碼66039D的大的開(kāi)放閱讀框。為確定哪個(gè)基因區(qū)段含有NIM1基因，含有分離自經(jīng)水或化學(xué)處理后的Ws-0和不同nim1突變型之葉片組織的RNA的凝膠印跡，用來(lái)自四個(gè)基因區(qū)段中每一個(gè)區(qū)段的DNA進(jìn)行探查。在這些實(shí)驗(yàn)中，注意將探針標(biāo)記成高比活力并且放射自顯影曝光1周以上。在我們過(guò)去的經(jīng)驗(yàn)中，這些條件可檢測(cè)RNA的濃度為大約每個(gè)細(xì)胞一個(gè)拷貝。產(chǎn)生可檢測(cè)到的RNA之唯一的基因區(qū)域是基因區(qū)2。如圖7中所示，用基因區(qū)2探針鑒定的mRNA由BTH處理野生型植物所誘導(dǎo)，但并不是在任何突變型中都這樣。而且，被寄生霜霉感染后所有植物的RNA積累都提高了，說(shuō)明這個(gè)特定的基因在病原體感染后被誘導(dǎo)。為了進(jìn)一步建立編碼NIM1的基因區(qū)，檢測(cè)了四個(gè)基因區(qū)中每一個(gè)的DNA序列之nim1等位基因，并與相應(yīng)的Ws-0的基因區(qū)相比較。在Ws-0和基因區(qū)3或4的突變型等位基因之間沒(méi)有檢測(cè)到突變，僅僅在nim1-6突變型的基因區(qū)段1中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)改變。但是，在區(qū)段2相對(duì)于Ws-0的每個(gè)等位基因中都發(fā)現(xiàn)有單個(gè)堿基對(duì)突變?；騾^(qū)段2的DNA序列示于圖6中。如表5和圖6中所示，在nim1-1中，在位點(diǎn)3579插入引起移碼的單個(gè)腺嘌呤導(dǎo)致七個(gè)氨基酸改變以及349個(gè)氨基酸的缺失。在nim1-2中，在位點(diǎn)3763有胞嘧啶到胸腺嘧啶的轉(zhuǎn)換使組氨酸變成酪氨酸。在nim1-3中，在位點(diǎn)3301刪除單個(gè)腺嘌呤引起改變了10個(gè)氨基酸的移碼并從預(yù)期的蛋白質(zhì)中缺失了412個(gè)氨基酸。有趣的是，nim1-4和nim1-5二者都在位點(diǎn)4160處有鳥(niǎo)嘌呤到腺嘌呤的轉(zhuǎn)換使精氨酸變成賴氨酸，而在nim1-6中，有一個(gè)胞嘧啶到胸腺嘧啶的轉(zhuǎn)換導(dǎo)致終止子，引起從預(yù)期蛋白質(zhì)中缺失了255個(gè)氨基酸。盡管nim1-4和nim1-5中的突變改變了mRNA的共有供體剪接位點(diǎn)，RT-PCR分析表明此突變沒(méi)有引起mRNA剪接的改變(數(shù)據(jù)未給出)。NIM1同系物基因區(qū)段2的DNA序列被用于Blast搜索(Altschul等，1990)，并鑒定了一個(gè)與擬南芥表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)T22612完全相符合的序列，以及與水稻ESTS2556、S2861、S3060和S3481明顯相符合的序列(見(jiàn)圖8)。覆蓋2081至3266堿基對(duì)的DNA探針用于篩選擬南芥cDNA文庫(kù)，并分離到14個(gè)相應(yīng)于基因區(qū)段2的克隆。從cDNA序列中，我們能夠確證在圖6中所示的外顯子/內(nèi)含子邊界的排列。用來(lái)自INA處理的Ws-0植物的RNA通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)進(jìn)行cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)，可能的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)確定為圖6中位點(diǎn)2588的A。利用NIM1cDNA作探針，可以鑒定擬南芥NIM1的同系物，并通過(guò)篩選不同植物的基因組或cDNA文庫(kù)而分離，這些植物如，但不限于下列作物類植物水稻、小麥、大麥、黑麥、玉米、馬鈴薯、胡蘿卜、甜馬鈴薯、甜菜、菜豆、豌豆、菊苣、萵苣、白菜、花椰菜、花莖甘藍(lán)、蕪菁、蘿卜、菠菜、蘆筍、洋蔥、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、胡蘿卜、南瓜、西葫蘆、小西葫蘆、黃瓜、蘋果、梨、溫孛、甜瓜、李子、櫻桃、桃、蜜桃、杏、草莓、葡萄、覆盆子、黑莓、鳳梨、鱷梨、番木瓜樹(shù)、芒果、香蕉、大豆、煙草、番茄、高粱和甘蔗。完成上述過(guò)程的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)包括雜交篩選平板DNA文庫(kù)(或是噬菌斑或是菌落，參閱，例如Sambrook等《分子克隆》，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版，(1989))和利用寡核苷酸引物通過(guò)PCR進(jìn)行擴(kuò)增(參閱，例如，Innis等，《PCR技術(shù)方法與應(yīng)用指南》，學(xué)院出版社(1990))。被鑒定的同系物通過(guò)遺傳工程連入下列表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化到上述作物中。利用供試植物的相關(guān)病原體評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)化子的抗病性增強(qiáng)。例如，通過(guò)DNA印跡分析檢測(cè)了黃瓜、蕃茄、煙草、玉米、小麥和大麥的基因組的NIM1同系物。從黃瓜、蕃茄、煙草、玉米、小麥和大麥中分離了基因組DNA，用BamHI、HindIII、XbaI和SalI酶進(jìn)行限制性酶切，在0.8％瓊脂糖凝膠電泳分離并通過(guò)毛細(xì)管印跡轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。紫外交聯(lián)吸附DNA后，將膜在低嚴(yán)格條件下雜交(1％BSA；520mMNaPO4，pH7.2；7％十二烷基硫酸鈉；1mMEDTA；250mMNaCl，55℃雜交18-24小時(shí))將膜用32P放射性標(biāo)記的擬南芥NIM1cDNA雜交。然后雜交印跡在低嚴(yán)格條件下洗滌(6×SSC中洗3次，每次15分鐘，3×SSC中洗1次，15分鐘，55℃；1×SSC是0.15MNaCl、15mM檸檬酸鈉(pH7.0))，并在X-光膠片上曝光使相應(yīng)于NIM1的條帶變得可見(jiàn)。另外，被鑒定與NIM1基因相似的表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)如上述水稻EST也可用于分離同系物。水稻的EST對(duì)于從其它單子葉植物中分離NIM1同系物特別有用。同系物還可以通過(guò)PCR得到。在這個(gè)方法中，比較了已知的同系物(例如水稻和擬南芥)。氨基酸和DNA高度相似或相同的區(qū)段被用于制作PCR引物。一旦鑒定了一個(gè)合適的區(qū)段，就可以制作該區(qū)段的在第3位密碼子有各種替換的引物。在不同標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行cDNA或基因組DNA的PCR反應(yīng)。當(dāng)一條帶出現(xiàn)時(shí)，此帶被克隆和/或測(cè)序以確定它是否為NIM1同系物。NIM1的過(guò)量表達(dá)賦予植物抗病性本發(fā)明還涉及表達(dá)水平高于野生型的NIM1基因、或其功能變異體和突變型并且籍此具有廣譜抗病性的轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)生。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，NIM1基因的表達(dá)水平至少是野生型植物NIM1基因表達(dá)水平的2倍以上，并且優(yōu)選地為野生型表達(dá)水平的10倍以上。NIM1基因的過(guò)量表達(dá)模擬了誘導(dǎo)化合物的作用，其在于產(chǎn)生帶組成型免疫(CIM)表型的植物。描述了一些產(chǎn)生過(guò)量表達(dá)NIM1基因并籍此具有CIM表型的植物的方法。第一個(gè)方法是選擇高水平表達(dá)NIM1并由于插入位點(diǎn)效應(yīng)具有CIM表型的轉(zhuǎn)化植物。表6顯示了許多轉(zhuǎn)化子對(duì)真菌感染之抗性的測(cè)試結(jié)果。從這個(gè)表中可以看出，大量轉(zhuǎn)化子顯示出比正常水平低的真菌生長(zhǎng)，并且有幾個(gè)轉(zhuǎn)化子完全不顯示可見(jiàn)的真菌生長(zhǎng)。從收集的樣品中制備RNA并按Delaney等，1995中所述加以分析。將印跡與擬南芥基因探針PR-1雜交(Uknes等，1992)。三條線顯示PR-1基因表達(dá)的早期誘導(dǎo)，真菌處理后24或48小時(shí)PR-1mRNA可見(jiàn)。這三條線還表示對(duì)真菌感染的抗性。另外，描述了構(gòu)建植物轉(zhuǎn)化載體的方法，載體含有組成型的植物活性啟動(dòng)子，例如CaMV的35S啟動(dòng)子，其有效地連接到編碼活性NIM1蛋白的編碼區(qū)。高水平的活性NIM1蛋白產(chǎn)生如用BTH、INA和SA等誘導(dǎo)物進(jìn)行化學(xué)誘導(dǎo)相同的抗病性效果。NIM1基因是IκBα的同系物NIM1基因是植物中的系統(tǒng)獲得性抗性(SAR)途徑的主要成分(Ryals等，1996)。NIM1基因與化學(xué)或生物誘導(dǎo)物對(duì)SAR的激活相關(guān)，并與這些誘導(dǎo)物一起為SAR和SAR基因表達(dá)所需。通過(guò)分子生物學(xué)分析已知攜帶突變型nim1基因的突變型植物之基因組，確定了NIM1基因的位置，突變型nim1基因使宿主植物對(duì)大量病原體極端敏感，并使它們不能應(yīng)答病原體和SAR的化學(xué)誘導(dǎo)物。擬南芥的野生型NIM1基因已被作圖并測(cè)序(SEQIDNO2)。野生型NIM1基因產(chǎn)物(SEQIDNO3)參與導(dǎo)致擬南芥中的SAR和基因?qū)蚩共⌒缘男盘?hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)(Ryals等，1997)。野生型形式的NIM1的重組過(guò)量表達(dá)造成帶組成型免疫(CIM)表型的植物并因此賦予轉(zhuǎn)基因植物抗病性?；钚訬IM1蛋白水平的增加產(chǎn)生了如用BTH、INA和SA等誘導(dǎo)化學(xué)物進(jìn)行化學(xué)誘導(dǎo)相同的抗病作用。NIM1基因的序列(SEQIDNO2)被用于BLAST搜索，根據(jù)在許多蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的錨蛋白結(jié)構(gòu)域與在NIM1基因序列中一個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)域的同源性鑒定了相符合的序列，這些蛋白質(zhì)如血影蛋白、錨蛋白、NF-κB和IκB(Michaely和Bennett，細(xì)胞生物學(xué)進(jìn)展(TrendsCellBiol.)2，127-129(1992))。但是除了錨蛋白基元以外，傳統(tǒng)計(jì)算機(jī)分析沒(méi)有檢測(cè)到其它強(qiáng)的同源性，包括與IκBα的同源性。盡管計(jì)算機(jī)程序失敗了，在NIM1蛋白(SEQIDNO3)和70個(gè)已知含錨蛋白的蛋白質(zhì)之間進(jìn)行了智能配對(duì)可視檢測(cè)(pair-wisevisualinspection)，并且發(fā)現(xiàn)了與IκBα類轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子成員的驚人的相似性(Baeuerle和Baltimore1996；Baldwin1996)。如圖9中所示，NIM1蛋白(SEQIDNO3)與小鼠、大鼠和豬的IκBα(分別為SEQIDNOs18、19和20)具有顯著的同源性。在全長(zhǎng)的蛋白質(zhì)中NIM1含有幾個(gè)重要的IκBα結(jié)構(gòu)域，包括錨蛋白結(jié)構(gòu)域(在圖9中以虛下劃線表示)、2個(gè)氨基末端絲氨酸(NIM1的氨基酸55和59)、一對(duì)賴氨酸(NIM1的氨基酸99和100)和一個(gè)酸性C-末端?？偟膩?lái)說(shuō)，NIM1和IκBα具有30％相同的殘基和50％殘基的保守性替換。因此，在IκBα和NIM1整個(gè)蛋白之間具有同源性，總的相似性為80％。IκBα蛋白在信號(hào)傳導(dǎo)中起作用的一個(gè)途徑是通過(guò)與胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB結(jié)合，阻止它進(jìn)入核內(nèi)并改變靶基因的轉(zhuǎn)錄(Baeuerle和Baltimore1996；Baldwin1996)。NF-κB的靶基因調(diào)節(jié)(激活或抑制)幾個(gè)細(xì)胞過(guò)程，包括抗病毒、抗微生物和細(xì)胞死亡反應(yīng)(Baeuerle和Baltimore1996)。當(dāng)信號(hào)傳導(dǎo)途徑被激活時(shí)，IκBα在兩個(gè)絲氨酸殘基(小鼠IκBα的氨基酸32和36)上被磷酸化。這就在兩個(gè)賴氨酸(小鼠IκBα的氨基酸21和22)上安排了遍在蛋白質(zhì)化。遍在蛋白質(zhì)化后，NF-κB/IκB復(fù)合物通過(guò)蛋白體被指定了路徑，其中IκBα被降解而NF-κB被釋放到細(xì)胞核。在IκBα功能中重要的磷酸化絲氨酸殘基在NIM1中被保留在從氨基酸35到84的保守序列的一個(gè)大的連續(xù)區(qū)域中(圖9)。在IκBα中兩個(gè)賴氨酸位于距蛋白質(zhì)N-末端大約15個(gè)氨基酸處，與此相反，在NIM1中兩個(gè)賴氨酸位于距C-末端大約40個(gè)氨基酸處。而且，NIM1和IκBα之間在富含絲氨酸/蘇氨酸的羧基末端區(qū)存在高度的同源性，羧基末端區(qū)已經(jīng)顯示出在基礎(chǔ)轉(zhuǎn)換速率中很重要(Sun等，分子細(xì)胞生物學(xué)16，1058-1065(1996))。根據(jù)本發(fā)明，在結(jié)構(gòu)同源性分析和存在已知對(duì)IκBα的功能很重要的元件之基礎(chǔ)上，期望NIM1象IκBα一樣起作用，對(duì)植物基因調(diào)控具有相似的效果。預(yù)料當(dāng)用誘導(dǎo)化學(xué)品處理時(shí)含有野生型NIM1基因的植物具有更多的基因產(chǎn)物(IκB同系物)或更少的NIM1基因產(chǎn)物(IκB同系物)被磷酸化。按照這一模式，結(jié)果是植物的NF-κB同系物被排除在細(xì)胞核外，SAR基因表達(dá)和抗性反應(yīng)得以發(fā)生。在nim1突變型植物中存在一個(gè)非功能性的NIM1基因。因此，按照這一模式，NF-κB同系物能夠到達(dá)細(xì)胞核并阻遏抗性及SAR基因的表達(dá)。與這一思想相符，用水楊酸處理的動(dòng)物細(xì)胞表現(xiàn)出增強(qiáng)的穩(wěn)定性/豐富的IκB以及細(xì)胞核中活性NF-κB的減少(Kopp和Ghosh，1994)。IκB的突變已知作為超阻遏物或顯性-負(fù)性(Britta-MareenTraenckner等，EMBO142876-2883(1995)；Brown等，科學(xué)2671485-1488(1996)；Brockman等，分子和細(xì)胞生物學(xué)152809-2818(1995)；Wang等，科學(xué)274784-787(1996))。這些突變型形式的IκB與NF-κB結(jié)合但并不被磷酸化或遍在蛋白質(zhì)化，因此不被降解。NF-κB仍與IκB結(jié)合而不能進(jìn)入細(xì)胞核。NIM1基因的變形體從上面來(lái)看，本發(fā)明包括作為SAR信號(hào)傳導(dǎo)途徑顯性-負(fù)性調(diào)節(jié)物的NIM1的變形體。用這些顯性負(fù)性形式的NIM1轉(zhuǎn)化的植物具有與nim1突變型植物相反的表型，即用NIM1變形體轉(zhuǎn)化的植物表現(xiàn)組成型SAR基因表達(dá)并因此具有CIM表型。由于在SAR信號(hào)傳導(dǎo)途徑中NIM1基因所在的位點(diǎn)，期望除了此處特別公開(kāi)的那些以外的基因的許多改變將導(dǎo)致SAR基因的組成型表達(dá)并因此形成的CIM表型。人IκBα中絲氨酸殘基的磷酸化是刺激IκBα的活化降解所需的，并因此激活NF-κB。人IκBα中的絲氨酸殘基(S32和S36)突變?yōu)楸彼釟埢种屏舜碳?誘導(dǎo)的磷酸化，因此阻斷了IκBα的蛋白體-介導(dǎo)的降解(Traenckner等，1995；Brown等，1996；Brockman等，1995；Wang等，1996)。這種IκBα變形體可以作為顯性-負(fù)性形式通過(guò)將NF-κB保留在胞質(zhì)中而阻斷下游信號(hào)傳導(dǎo)事件。根據(jù)比較圖9所示NIM1和IκB的氨基酸序列，NIM1(SEQIDNO3)的絲氨酸55(S55)和59(S59)與人IκBα的S32和S36同源。為構(gòu)建NIM1的顯性-負(fù)性形式，在氨基酸位點(diǎn)55和59的絲氨酸被突變?yōu)楸彼釟埢?。于是，在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，NIM1基因被改變，使得編碼產(chǎn)物在相應(yīng)于擬南芥NIM1氨基酸序列的位點(diǎn)55和59的氨基酸位點(diǎn)上由丙氨酸代替了絲氨酸。本發(fā)明還包括用這種NIM1基因變形體轉(zhuǎn)化的抗病性轉(zhuǎn)基因植物，以及利用這種NIM1基因變形體賦予所轉(zhuǎn)化的植物以抗病性并激活SAR基因表達(dá)的方法。人IκBα的氨基酸1-36(Brockman等，1995)或1-72(Sun等，1996)缺失后，由于缺失部分含有遍在蛋白質(zhì)化賴氨酸殘基K21和K22以及磷酸化位點(diǎn)S32和S36，導(dǎo)致了被轉(zhuǎn)染的人細(xì)胞培養(yǎng)物的顯性-負(fù)性IκBα表型。NIM1基因產(chǎn)物N-末端的前125個(gè)氨基酸的缺失去除了作為遍在蛋白質(zhì)化位點(diǎn)的8個(gè)賴氨酸殘基以及上述推斷的磷酸化位點(diǎn)S55和S59。因此，在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，NIM1基因被改變，使得編碼產(chǎn)物與天然擬南芥NIM1的氨基酸序列相比丟失了大約前125個(gè)氨基酸。本發(fā)明還包括用這種NIM1基因變形體轉(zhuǎn)化的抗病性轉(zhuǎn)基因植物，以及利用這種NIM1基因變形體賦予所轉(zhuǎn)化的植物以抗病性并激活SAR基因表達(dá)的方法。人IκBα的氨基酸261-317的缺失可能通過(guò)阻斷C-末端的絲氨酸和蘇氨酸殘基的組成型磷酸化而導(dǎo)致內(nèi)在穩(wěn)定性提高。預(yù)期這種改變形式的IκBα以顯性-負(fù)性形式起作用。一個(gè)富含絲氨酸和蘇氨酸的區(qū)域存在于NIM1C-末端的氨基酸522-593處。于是，在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，NIM1基因被改變，使得編碼產(chǎn)物與天然擬南芥NIM1的氨基酸序列相比丟失了大約其C-末端部分，包括氨基酸522-593。本發(fā)明還包括用這種NIM1基因變形體轉(zhuǎn)化的抗病性轉(zhuǎn)基因植物，以及利用這種NIM1基因變形體賦予所轉(zhuǎn)化的植物以抗病性并激活SAR基因表達(dá)的方法。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，NIM1基因產(chǎn)物的變形體是由于C-末端和N-末端片段缺失或形成嵌合體而產(chǎn)生的。而在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了含有來(lái)自NIM1基因的錨蛋白結(jié)構(gòu)域的構(gòu)件。本發(fā)明包括用這種NIM1嵌合體或錨蛋白構(gòu)件轉(zhuǎn)化的抗病性轉(zhuǎn)基因植物，以及利用NIM1基因的這些變異體賦予所轉(zhuǎn)化的植物以抗病性并激活SAR基因表達(dá)的方法。本發(fā)明涉及編碼如上述NIM1基因變形體的DNA分子，含有這種DNA分子的表達(dá)載體，以及由其轉(zhuǎn)化的植物和植物細(xì)胞。本發(fā)明還涉及通過(guò)用編碼NIM1基因產(chǎn)物變形體的DNA分子轉(zhuǎn)化植物而激活植物中的SAR并賦予植物CIM表型和廣譜抗病性的方法。本發(fā)明另外涉及用NIM1基因變形體轉(zhuǎn)化的植物。抗病性在植物中過(guò)量表達(dá)野生型NIM1基因和在植物中表達(dá)NIM1基因變形體使植物對(duì)大量植物病原體產(chǎn)生免疫，病原體包括但并不限于病毒或類病毒，如煙草或黃瓜花葉病毒、環(huán)斑病毒或壞死病毒、天竺葵卷葉病毒、紅花草斑點(diǎn)病毒、煙草叢矮病毒、以及其它病毒；真菌，如寄生疫霉(Phythophthoraparasitica)和煙草霜霉(Peronosporatabacina)；細(xì)菌，如丁香假單胞菌和煙草假單胞菌(Pseudomonastabaci)；昆蟲(chóng)如蚜蟲(chóng)，如桃蚜(Myzuspersicae)；和鱗翅目如棉鈴蟲(chóng)(Heliothisspp.)；以及線蟲(chóng)，如南方根結(jié)線蟲(chóng)(Meloidogyneincognita)。本發(fā)明的載體和方法有助于控制許多病原生物體，包括但并不限于霜霉病菌如大孢子指疫霉(Scleropthoramacrospora)，玉米褐條霜霉(Scleropthorarayissiae)，禾生指梗霉(Sclerosporagraminicola)，Peronosclerosporasorghi，Peronosclerosporaphilippinensis，Peronosclerosporasacchari和Peronosclerosporamaydis；銹菌如高粱柄銹菌(Pucciniasorphi)，多堆柄銹菌(Pucciniapolysora)和Physopellazeae；其它真菌如Cercosporazeae-maydis，禾生刺盤孢(Colletotrichumgraminicola)，串珠鐮孢菌(Fusariumnoliforme)，玉蜀黍赤霉菌(Gibberellazeae)，Exserohilumturcicum，玉蜀黍球梗孢(Kabatielluzeae)，禾白粉菌(Erysiphegraminis)，殼針孢(Septoria)和Bipolarismaydis；以及細(xì)菌如斯氏歐文氏菌(Erwiniastewartii)。本發(fā)明的方法可用于賦予多種植物抗病性，包括裸子植物、單子葉植物和雙子葉植物。盡管可以賦予這些大類的任何植物以抗病性，但對(duì)于農(nóng)業(yè)上的重要作物類植物特別有用，例如水稻、小麥、大麥、黑麥、玉米、馬鈴薯、胡蘿卜、甜馬鈴薯、甜菜、菜豆、豌豆、菊苣、萵苣、白菜、花椰菜、花莖甘藍(lán)、蕪菁、蘿卜、菠菜、蘆筍、洋蔥、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、胡蘿卜、南瓜、西葫蘆、小西葫蘆、黃瓜、蘋果、梨、溫孛、甜瓜、李子、櫻桃、桃、蜜桃、杏、草莓、葡萄、覆盆子、黑莓、鳳梨、鱷梨、番木瓜樹(shù)、芒果、香蕉、大豆、煙草、番茄、高粱和甘蔗。被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可以再生為整株植物從而該基因賦予完整的轉(zhuǎn)基因植物以抗病性?？梢愿脑毂磉_(dá)系統(tǒng)使抗病基因連續(xù)或組成型表達(dá)。重組DNA技術(shù)通過(guò)誘導(dǎo)SAR基因表達(dá)賦予植物抗病性的NIM1DNA分子或基因片段，或通過(guò)提高SAR基因表達(dá)賦予植物抗病性的NIM1基因變形體均可以利用傳統(tǒng)的重組DNA技術(shù)導(dǎo)入植物或細(xì)菌細(xì)胞。通常地，這些技術(shù)包括將含有SEQIDNO1或其功能變異體或上述編碼NIM1變形體的分子插入到與DNA分子異源(即正常不存在的)的表達(dá)系統(tǒng)中。異源DNA分子以合適的方向和正確的閱讀框的形式插入到表達(dá)系統(tǒng)中。載體含有插入的蛋白質(zhì)編碼序列轉(zhuǎn)錄和翻譯所需的元件。可以采用本領(lǐng)域已知的多種載體系統(tǒng)，例如質(zhì)粒、噬菌體病毒和其它經(jīng)改造的病毒。合適的載體包括但不限于，病毒載體如λ載體系統(tǒng)λgtl1、λgtl10和Charon4；質(zhì)粒載體如pBI121、pBR322、pACYC177、pACYC184、pAR系列、pKK223-3、pUC8、pUC9、pUC18、pUC19、pLG339、pRK290、pKC37、pKC101、pCDNAII；以及其它相似的系統(tǒng)。此處描述的NIM1編碼序列和改變的NIM1編碼序列可以利用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)程序克隆到載體中，如Maniatis等，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，紐約(1982)中所述。為了使本發(fā)明的基因或基因片段有效表達(dá)，在表達(dá)載體中必須存在一個(gè)能夠?qū)е掠行П磉_(dá)水平或組成型表達(dá)的啟動(dòng)子。RNA聚合酶通常與啟動(dòng)子結(jié)合并起始基因的轉(zhuǎn)錄。啟動(dòng)子的強(qiáng)度即啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的能力有所不同。根據(jù)采用的宿主細(xì)胞系統(tǒng)，可以采用任何一個(gè)或多個(gè)合適的啟動(dòng)子。表達(dá)盒的成分可以被改造以提高表達(dá)。例如，可以采用被截短的序列、核苷酸替換或其它改造。經(jīng)這種改造的表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞可表現(xiàn)出過(guò)量表達(dá)或組成型表達(dá)活化SAR所需的基因。A.植物轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建許多轉(zhuǎn)化載體可用于植物轉(zhuǎn)化，并且本發(fā)明的基因可以與任何這些載體聯(lián)合使用。載體的選擇依賴于優(yōu)選的轉(zhuǎn)化技術(shù)和轉(zhuǎn)化的目標(biāo)品種。對(duì)于確定的目標(biāo)品種，不同的抗生素或除草劑選擇標(biāo)記是優(yōu)選的。在轉(zhuǎn)化中常規(guī)采用的選擇標(biāo)記包括賦予卡那霉素和相關(guān)抗生素抗性的nptII基因(Messing和Vierra，基因19259-268(1982)；Bevan等，自然304184-187(1983))、賦予對(duì)除草劑膦絲菌素抗性的bar基因(White等，核酸研究181062(1990)，Spencer等，理論與應(yīng)用遺傳學(xué)(Theor.Appl.Genet)79625-631(1990))、賦予對(duì)抗生素潮霉素抗性的hph基因(Blochinger和Diggelmann，分子細(xì)胞生物學(xué)42929-2931)和賦予氨甲喋呤抗性的dhfr基因(Bourouis等，EMBOJ.2(7)1099-1104(1983))以及賦予草甘膦抗性的EPSPS基因(美國(guó)專利4,940,935和5,188,642)。1.合適土壤桿菌轉(zhuǎn)化的載體許多載體可用于根癌土壤桿菌轉(zhuǎn)化。它們一般攜帶至少一個(gè)T-DNA邊界序列并包括載體如pBIN19(Bevan，核酸研究(1984))和pXYZ。下面描述了兩個(gè)典型的載體。a.pCIB200和pCIB2001雙元載體pCIB200和pCIB2001被用于構(gòu)建利用土壤桿菌的重組載體并以下列方式進(jìn)行構(gòu)建。pTJS75kan是通過(guò)用NarI酶切pTJS75構(gòu)建的(Schmidhauser和Helinski，細(xì)菌學(xué)雜志164446-455(1985))允許刪除了四環(huán)素抗性基因，隨后插入了來(lái)自攜帶NPTII的pUC4K的AccI片段(Messing和Vierra，基因19259-268(1982)Bevan等，自然304184-187(1983)McBride等，植物分子生物學(xué)14266-276(1990))。XhoI銜接物(linker)連接到pCIB7的EcoRV片段上，它含有T-DNA的左右邊界、一個(gè)植物選擇性nos/nptII嵌合基因和pUC多銜接物(polylinker)(Rothstein等，基因53153-161(1987))，XohI酶切的片段被克隆到SalI酶切的pTJS75kan形成pCIB200(參閱EP0332104，實(shí)施例19)。pCIB200含有下列獨(dú)特的多銜接物限制位點(diǎn)EcoRI，SstI，KpnI，BgIII，XbaI和SalI。pCIB2001是pCIB200的衍生物，其是通過(guò)在多銜接物中插入另外的限制位點(diǎn)而建立的。pCIB2001中多銜接物的單一限制位點(diǎn)是EcoRI，SstI，KpnI，BglII，XbaI，SalI，MluI，BclI，AvrII，ApaI，HpaI和StuI。除了含有這些單一限制位點(diǎn)以外，pCIB2001還具有植物和細(xì)菌的卡那霉素選擇性、用于土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化的T-DNA左右邊界、RK2衍生的在大腸桿菌和其它宿主之間移動(dòng)的trfA功能件(function)，以及同樣來(lái)自RK2的OriT和OriV功能件。pCIB2001多銜接物適用于克隆含有其自身調(diào)控信號(hào)的植物表達(dá)盒。b.pCIB10和它的潮霉素選擇衍生物雙元載體pCIB10含有用于在植物中選擇的編碼卡那霉素抗性的基因和T-DNA左右邊界序列，并結(jié)合了來(lái)自寬宿主范圍質(zhì)粒pRK252的序列，使它能夠在大腸桿菌和土壤桿菌中復(fù)制。Rothstein等描述了它的構(gòu)建(基因，53153-161(1987))。構(gòu)建了pCIB10的多種衍生物，它們結(jié)合了由Gritz等描述的潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(基因25179-188(1983))。這些衍生物使之能夠僅僅依靠潮霉素選擇轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，或依靠潮霉素和卡那霉素選擇(pCIB715，pCIB717)。2.適合非土壤桿菌轉(zhuǎn)化的載體不用根癌土壤桿菌的轉(zhuǎn)化克服了在所選轉(zhuǎn)化載體中對(duì)T-DNA序列的需要，從而除了如上述含有T-DNA序列的這些載體以外，還可以采用缺少這些序列的載體。不依賴土壤桿菌的轉(zhuǎn)化技術(shù)包括通過(guò)粒子轟擊、原生質(zhì)體吸收(如PEG和電穿孔)和顯微注射。載體的選擇很大程度上依賴于對(duì)轉(zhuǎn)化品種的優(yōu)選選擇。a.pCIB3064pCIB3064是一個(gè)pUC衍生的載體，適合于結(jié)合通過(guò)除草劑basta(或膦絲菌素)的選擇的直接基因轉(zhuǎn)移技術(shù)。質(zhì)粒pCIB246包含有效地融合到大腸桿菌GUS基因的CaMV35S啟動(dòng)子和CaMV35S轉(zhuǎn)錄終止子，在PCT申請(qǐng)WO93/07278中描述了此質(zhì)粒。該載體的35S啟動(dòng)子在起始位點(diǎn)的5’端含有兩個(gè)ATG序列。這些位點(diǎn)用標(biāo)準(zhǔn)PCR技術(shù)誘變，去除兩個(gè)ATG并形成限制位點(diǎn)SspI和PvuII。新的限制位點(diǎn)是距單一的SalI位點(diǎn)96和37bp，距真正起始位點(diǎn)101和42bp的。形成的pCIB246衍生物命名為pCIB3025。然后通過(guò)用SalI和SacI酶切將GUS基因從pCIB3025中去除，產(chǎn)生平末端并重新連接起來(lái)形成質(zhì)粒pCIB3060。質(zhì)粒pJIT82獲自JohnInnesCentre，Norwich，含有來(lái)自綠色產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomycesviridochromogenes)的bar基因之400bp的SmaI片段被切下并插入到pCIB3060的HpaI位點(diǎn)(Thompson等EMBOJ62519-2523(1987))。這就產(chǎn)生了pCIB3064，它含有受CaMV35S啟動(dòng)子和終止子控制用于除草劑選擇的bar基因，一個(gè)氨芐抗性基因(用于在大腸桿菌中選擇)和一個(gè)具有單一位點(diǎn)SphI，PstI，HindIII和BamHI的多銜接物。此載體適用于克隆含有其自身調(diào)控信號(hào)的植物表達(dá)盒。b.pSOG19和pSOG35pSOG35是利用大腸桿菌的二氫葉酸還原酶基因(DFR)賦予對(duì)氨甲喋呤抗性作為選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)化載體。用PCR擴(kuò)增35S啟動(dòng)子(-800bp)、玉米Adh1基因的內(nèi)含子6(-550bp)和pSOG10的GUS非翻譯前導(dǎo)序列的18bp。編碼大腸桿菌二氫葉酸還原酶II基因的250bp的片段也用PCR擴(kuò)增，這兩個(gè)PCR片段與pB1221(Clontech)的SacI-PstI片段組裝，該片段含有pUC19載體骨架和胭脂堿合成酶終止子。這些片段組裝成pSOG19，它含有與內(nèi)含子6序列、GUS前導(dǎo)序列、DHFR基因和胭脂堿合成酶終止子相融合的35S啟動(dòng)子。將pSOG19中的GUS前導(dǎo)序列替換成玉米褪綠斑駁病毒(MCMV)形成載體pSOG35。pSOG19和pSOG35攜帶氨芐青霉素抗性的pUC基因并具有適合克隆外源序列的HindIII、SphI、PstI和EcoRI位點(diǎn)。B.構(gòu)建植物表達(dá)盒的需求要想在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)的基因序列首先被組裝到表達(dá)盒中位于合適的高水平表達(dá)啟動(dòng)子之后、合適的轉(zhuǎn)錄終止子的上游。這些表達(dá)盒可以容易地轉(zhuǎn)化到上述植物轉(zhuǎn)化載體中。1.啟動(dòng)子選擇用于表達(dá)盒中的啟動(dòng)子的選擇將決定轉(zhuǎn)基因在轉(zhuǎn)基因植物中的空間和時(shí)間表達(dá)方式。所選的啟動(dòng)子將在特定的細(xì)胞類型(例如葉表皮細(xì)胞、葉肉細(xì)胞、根皮層細(xì)胞)或在特定的組織或器官(例如根、葉或花)中表達(dá)轉(zhuǎn)基因，并且這種選擇將反映NIM1基因產(chǎn)物或NIM1基因產(chǎn)物變形體期望積累的目的部位?？蛇x擇地，所選的啟動(dòng)子可能驅(qū)動(dòng)處于光誘導(dǎo)或其它時(shí)間調(diào)控啟動(dòng)子調(diào)控下的基因的表達(dá)。a.組成型表達(dá)，CaMV35S啟動(dòng)子質(zhì)粒pCGN1761的構(gòu)建在公開(kāi)專利申請(qǐng)EP0392225(實(shí)施例23)中有描述，在此引入作為參考。pCGN1761含有“雙”35S啟動(dòng)子和tml轉(zhuǎn)錄終止子，在啟動(dòng)子和終止子之間有單一EcoRI位點(diǎn)并具有pUC型骨架。構(gòu)建了pCGN1761的一個(gè)衍生物，它具有除了已有的EcoRI位點(diǎn)外還含有帶NotI和XhoI位點(diǎn)的經(jīng)改造的多銜接物。這個(gè)衍生物被命名為pCGN1761ENX。pCGN1761ENX可用于在其多銜接物內(nèi)克隆cDNA序列或基因序列(包括微生物的ORF序列)，目的是為了在轉(zhuǎn)基因植物中的35S啟動(dòng)子控制下進(jìn)行表達(dá)。整個(gè)35S啟動(dòng)子-基因序列-tml終止子盒這樣一個(gè)構(gòu)件可以在啟動(dòng)子5’端的HindIII、SphI、SalI和XbaI位點(diǎn)和終止子3’端的XbaI、BamHI和BgaII位點(diǎn)被剪切以轉(zhuǎn)入如上述的轉(zhuǎn)化載體。而且，雙35S啟動(dòng)子片段可在5’通過(guò)HindIII、SphI、SalI、XbaI或PstI剪切除去，以及在3’通過(guò)任何一個(gè)多銜接物限制位點(diǎn)(EcoRI，NotI或XhoI)剪切除去，用其它啟動(dòng)子加以替換。b.通過(guò)優(yōu)化轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)改造pCGN1761ENX對(duì)任何一個(gè)此處描述的構(gòu)件，圍繞克隆位點(diǎn)的改造可以通過(guò)引入可增強(qiáng)翻譯的序列來(lái)進(jìn)行。當(dāng)需要過(guò)量表達(dá)時(shí)這尤其有用。將pCGN1761ENX用SphI酶切，用T4DNA聚合酶處理并連接，因此破壞了位于雙35S啟動(dòng)子5’側(cè)的SphI位點(diǎn)。這樣形成了載體pCGN1761ENX/Sph-。pCGN1761ENX/Sph-用EcoRI酶切，并與一個(gè)序列退火的分子接頭(adaptor)連接，其序列為5’-AATTCTAAAGCATGCCGATCGG-3′/5’-AATTCCGATCGGCATGCTTTA-3′(SEQIDNO12和13)。這樣形成了載體pCGNSENX，其含有準(zhǔn)優(yōu)化的植物轉(zhuǎn)錄起始序列TAAA-C，它與ATG相鄰，而ATG本身是SphI位點(diǎn)的一部分，它適合于在其起始甲硫氨酸處克隆異源基因。SphI位點(diǎn)下游的EcoRI、NotI和XohI位點(diǎn)被保留。利用在起始ATGNcoI位點(diǎn)構(gòu)建了另一個(gè)載體。這個(gè)載體命名為pCGN1761NENX，是通過(guò)在pCGN1761ENXEcoRI位點(diǎn)插入一個(gè)序列退火的分子接頭構(gòu)建的，該序列為5’-AATTCTAAACCATGGCGATCGG-3’/5′-AATTCCGATCGCCATGGTTTA-3′(SEQIDNO14和15)。這樣載體含有與起始ATG相鄰的準(zhǔn)優(yōu)化的序列TAAACC，ATG處于NcoI位點(diǎn)內(nèi)。下游位點(diǎn)是EcoRI，NotI和XhoI。但是進(jìn)行此操作前，pCGN1761ENX載體中的兩個(gè)NcoI位點(diǎn)(在35S啟動(dòng)子單位的上游位點(diǎn))被破壞，所采用的是與那些上述用于SphI的相似技術(shù)或替代地采用“內(nèi)-外”(inside-outside)PCR技術(shù)。Innes等《PCR技術(shù)方法與應(yīng)用指南》。學(xué)院出版社，紐約(1990)?？梢酝ㄟ^(guò)將任何植物cDNA或報(bào)告基因插入到克隆位點(diǎn)并進(jìn)行在植物中的常規(guī)表達(dá)分析來(lái)評(píng)價(jià)此操作任何可能的對(duì)表達(dá)有害的效應(yīng)。c.在化學(xué)/病原體調(diào)節(jié)啟動(dòng)子控制下的表達(dá)pCGN1761ENX中的雙35S啟動(dòng)子可以替換為可導(dǎo)致合適的高表達(dá)水平的任何一個(gè)其它所選啟動(dòng)子。例如，一個(gè)化學(xué)調(diào)節(jié)的PR-1啟動(dòng)子(在美國(guó)專利5,614,395中有描述，在此完整引入作為參考)可以替換雙35S啟動(dòng)子。優(yōu)選地所選的這個(gè)啟動(dòng)子被用限制性酶從它的原始來(lái)源中剪切，但是還可以用攜帶適當(dāng)末端限制位點(diǎn)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。如果進(jìn)行PCR擴(kuò)增，那么在擴(kuò)增啟動(dòng)子被克隆到目標(biāo)載體后啟動(dòng)子應(yīng)該重新測(cè)序以檢查擴(kuò)增錯(cuò)誤?；瘜W(xué)/病原體調(diào)節(jié)的煙草PR-1a啟動(dòng)子剪切自質(zhì)粒pCIB1004(參閱EP0332104，實(shí)施例21的構(gòu)建，在此引入作為參考)，并轉(zhuǎn)移到質(zhì)粒pCGN1761ENX(Uknes等，1992)。pCIB1004用NcoI酶切，產(chǎn)生的線性片段之3′突出部分用T4DNA聚合酶處理形成平末端。該片段然后再用HindIII酶切，產(chǎn)生的含PR-1a啟動(dòng)子的片段經(jīng)凝膠純化，克隆到已去除雙35S啟動(dòng)子的pCGN1761ENX。這是通過(guò)用XhoI酶切并用T4DNA聚合酶形成平末端，然后用HindIII酶切并分離含大的載體終止子的片段，在此片段中克隆了pCIB1004啟動(dòng)子片段。這樣形成了一個(gè)pCGN1761ENX衍生物，它具有PR-1a啟動(dòng)子和tml終止子以及一個(gè)具有單一EcoRI和NotI位點(diǎn)的插入片段的多銜接物。選擇的NIM1可插入到該載體中，并且融合產(chǎn)物(即啟動(dòng)子-基因-終止子)可隨后轉(zhuǎn)移到任何選擇的轉(zhuǎn)化載體中，包括那些在本申請(qǐng)中描述的載體?？梢圆捎貌煌幕瘜W(xué)調(diào)節(jié)物誘導(dǎo)根據(jù)本發(fā)明轉(zhuǎn)化的植物中NIM1編碼序列的表達(dá)。在此公開(kāi)的上下文中，“化學(xué)調(diào)節(jié)物”包括已知是植物中PR-1啟動(dòng)子誘導(dǎo)物的化學(xué)品，或其相近的衍生物。PR-1啟動(dòng)子的一組優(yōu)選調(diào)節(jié)物是以苯并-1，2，3-噻二唑(BTH)結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的，包括但并不限于以下類型的化合物苯并-1，2，3-噻二唑羧酸、苯并-1，2，3-噻二唑硫代羧酸、氰基苯并-1，2，3-噻二唑、苯并-1，2，3-噻二唑羧酸酰胺、苯并-1，2，3-噻二唑羧酸肼、苯并-1，2，3-噻二唑-7-羧酸、苯并-1，2，3-噻二唑-7-硫代羧酸、7-氰基苯并-1，2，3-噻二唑，苯并-1，2，3-噻二唑羧酸酯(其中烷基含有一到六個(gè)碳原子)、苯并-1，2，3-噻二唑-7-羧酸甲基酯、苯并-1，2，3-噻二唑-7-羧酸正丙酯、苯并-1，2，3-噻二唑-7-羧酸芐基酯、苯并-1，2，3-噻二唑-7-羧酸異丁基肼、及其適當(dāng)?shù)难苌?。其它化學(xué)誘導(dǎo)物包括，例如，苯甲酸、水楊酸(SA)、聚丙烯酸及其取代的衍生物；適當(dāng)?shù)娜〈锇ǖ图?jí)烷基、低級(jí)烷氧基、低級(jí)烷硫基和鹵原子。本發(fā)明的可化學(xué)誘導(dǎo)的DNA序列的另一組調(diào)節(jié)物是以吡啶羧酸結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的，例如異煙酸結(jié)構(gòu)和優(yōu)選的鹵異煙酸結(jié)構(gòu)。優(yōu)選的是二氯異煙酸及其衍生物，例如低級(jí)烷基酯。這一組調(diào)節(jié)化合物的合適的成員是，例如，2，6-二氯異煙酸(INA)，以及其低級(jí)烷基酯，特別是甲基酯。d.組成型表達(dá)，肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子已知肌動(dòng)蛋白的幾種同工型在大多數(shù)細(xì)胞類型中表達(dá)，因此肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子是組成型啟動(dòng)子的一個(gè)好的選擇。特別地，水稻ActI基因的啟動(dòng)子已被克隆并表征(McElroy等，植物細(xì)胞2163-171(1990))。發(fā)現(xiàn)此啟動(dòng)子的一個(gè)1.3kb的片段含有在水稻原生質(zhì)體中表達(dá)所需的全部調(diào)控元件。而且，已經(jīng)構(gòu)建了以ActI啟動(dòng)子為基桀的許多表達(dá)載體，特別是用于單子葉植物(McElroy等，分子與基因遺傳學(xué)(Mol.Gen.Genet.)231150-160(1991))。它們結(jié)合了ActI內(nèi)含子1、AdhI5′側(cè)翼序列和AdhI內(nèi)含子1(來(lái)自玉米乙醇脫氫酶基因)和來(lái)自CaMV35S啟動(dòng)子的序列。表現(xiàn)高表達(dá)的載體是35S和ActI內(nèi)含子或ActI5′側(cè)翼序列和ActI內(nèi)含子的融合體。起始ATG(GUS報(bào)告基因的)附近序列的優(yōu)化也提高表達(dá)。McElroy等(分子與基因遺傳學(xué)231150-160(1991))描述的啟動(dòng)子表達(dá)盒可以容易地被加以改造以表達(dá)纖維素酶基因，并特別適用于單子葉植物宿主。例如，含啟動(dòng)子的片段被從McElroy構(gòu)件中移去并用于替換pCGN1761ENX的雙35S啟動(dòng)子，然后可以插入特定的基因序列。這樣構(gòu)建的融合基因可以再轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)化載體中。在一個(gè)單獨(dú)的報(bào)告中，發(fā)現(xiàn)具有第一內(nèi)含子的水稻ActI啟動(dòng)子指導(dǎo)在培養(yǎng)的大麥細(xì)胞中的高表達(dá)(Chibbar等，植物細(xì)胞報(bào)告(PlantCellRep.)12506-509(1993))。e.組成型表達(dá)，遍在蛋白質(zhì)啟動(dòng)子遍在蛋白質(zhì)是已知在許多細(xì)胞類型中積累的另一個(gè)基因產(chǎn)物，并且它的啟動(dòng)子已被從一些品種中克隆并用于轉(zhuǎn)基因植物(例如向日葵-Binet等，植物科學(xué)7987-94(1991)和玉米-Christensen等，植物分子生物學(xué)12619-632(1989))。玉米遍在蛋白質(zhì)啟動(dòng)子已經(jīng)在轉(zhuǎn)基因單子葉植物系統(tǒng)中建立，其序列及用于單子葉植物轉(zhuǎn)化而構(gòu)建的載體在專利公開(kāi)文本EP0342926(Lubrizol)中公開(kāi)，在此引入作為參考。Taylor等(植物細(xì)胞報(bào)告12491-495(1993))描述了一個(gè)載體(pAHC25)，它含有玉米遍在蛋白質(zhì)啟動(dòng)子和第一內(nèi)含子，并且通過(guò)微粒轟擊導(dǎo)入后可以在許多單子葉植物細(xì)胞懸液中有很高活性。遍在蛋白質(zhì)啟動(dòng)子適合于在轉(zhuǎn)基因植物，特別是單子葉植物中表達(dá)纖維素酶基因。合適的載體是pAHC25或本發(fā)明所描述的任何一個(gè)轉(zhuǎn)化載體的衍生物，其通過(guò)導(dǎo)入適當(dāng)?shù)谋樵诘鞍踪|(zhì)啟動(dòng)子和/或內(nèi)含子序列加以改造。f.根部特異性表達(dá)本發(fā)明的NIM1基因的另一種表達(dá)模式是根部特異性表達(dá)。一個(gè)合適的根部啟動(dòng)子由Framond(FEBS290103-106(1991))以及發(fā)表的專利申請(qǐng)EP0452269(Ciba-Geigy)所描述，在此引入作為參考。這個(gè)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)移到合適的載體如pCGN1761ENX用于插入纖維素酶基因，隨后將完整的啟動(dòng)子-基因-終止子盒轉(zhuǎn)移到目標(biāo)轉(zhuǎn)化載體上。g.創(chuàng)傷誘導(dǎo)型啟動(dòng)子創(chuàng)傷誘導(dǎo)型啟動(dòng)子也可能適合于本發(fā)明NIM1基因的表達(dá)。許多這樣的啟動(dòng)子已經(jīng)被描述(例如Xu等，植物分子生物學(xué)22573-588(1993)，Logemann等，植物細(xì)胞1151-158(1989)，Rohrmeier和Lehle，植物分子生物學(xué)22783-792(1993)，F(xiàn)irek等，植物分子生物學(xué)22192-142(1993)，Warner等，植物雜志3191-201(1993))，而且都適用于本發(fā)明。Logemann等描述了來(lái)自雙子葉植物馬鈴薯wunl基因的5′上游序列。Xu等指出來(lái)自雙子葉植物馬鈴薯的創(chuàng)傷誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(pin2)在單子葉植物水稻中也具活性。而且，Rohrmeier和Lehle描述了玉米WipIcDNA的克隆，它是由創(chuàng)傷誘導(dǎo)的并且可以用于通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)分離同類的啟動(dòng)子。相似地，F(xiàn)irek等和Warner等描述了一個(gè)來(lái)自單子葉植物Asparagusofficinalis的創(chuàng)傷誘導(dǎo)基因，它在局部創(chuàng)傷和病原體侵染部位表達(dá)。利用本領(lǐng)域熟知的克隆技術(shù)，這些啟動(dòng)子可被轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)妮d體，融合到本發(fā)明的NIM1基因上，并用于在植物受傷的部位表達(dá)這些基因。h.木髓(pith)優(yōu)先型表達(dá)專利申請(qǐng)WO93/07278(Ciba-Geigy)，在此引入作為參考，描述了在木髓細(xì)胞中優(yōu)選表達(dá)的玉米trpA基因的分離。公布了基因序列和從轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)延伸到-1726bp的啟動(dòng)子。利用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)，該啟動(dòng)子或其部分可轉(zhuǎn)移到如pCGN1761的載體上，在載體中它替換35S啟動(dòng)子并用于以木髓優(yōu)先的方式驅(qū)動(dòng)外源基因的表達(dá)。實(shí)際上，含有木髓優(yōu)先啟動(dòng)子或其部分的片段可被轉(zhuǎn)移到任何載體并加以改造以用于轉(zhuǎn)基因植物。i.葉部特異表達(dá)編碼磷酸烯醇羧化酶(PEPC)的玉米基因已被Hudspeth和Grula(植物分子生物學(xué)12579-589(1989))描述。利用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)，這個(gè)基因的啟動(dòng)子可用于驅(qū)動(dòng)任何一個(gè)基因以葉部特異性方式在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)。i.葉綠體定向表達(dá)Chen和Jagendorf(生物化學(xué)雜志2682363-2367)描述了成功利用葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽轉(zhuǎn)入異源轉(zhuǎn)基因。所用的肽是來(lái)自Nicotianaplumbaginifolia的rbcS基因的轉(zhuǎn)運(yùn)肽(Poulsen等，分子基因遺傳學(xué)205193-200(1986))。利用限制酶DraI、SphI.prTsp5091和SphI，可從質(zhì)粒prbcS-8B中剪切編碼此轉(zhuǎn)運(yùn)肽的DNA序列并加以操作以用于上述任何一個(gè)構(gòu)件。DraI-SphI片段從對(duì)應(yīng)于起始rbcSATG的-58延伸到，并包括成熟肽的第一個(gè)氨基酸(也是甲硫氨酸)，它緊靠在轉(zhuǎn)入切割位點(diǎn)之后，而Tsp5091-SphI片段從對(duì)應(yīng)于起始rbcSATG的-8延伸到，并包括，成熟肽的第一個(gè)氨基酸。因此，這些片段可被適當(dāng)?shù)夭迦氲饺魏嗡x的表達(dá)盒的多銜接物中，形成所選啟動(dòng)子的不翻譯前導(dǎo)序列的轉(zhuǎn)錄融合體(例如，35S、PR-1a、肌動(dòng)蛋白、遍在蛋白質(zhì)等等)，從而能夠在轉(zhuǎn)運(yùn)肽的下游以正確的融合體插入一個(gè)NIM1基因。這種(融合體)構(gòu)建在本領(lǐng)域是常規(guī)的。例如，鑒于Dral末端已經(jīng)是平頭，5′Tsp5091位點(diǎn)可用T4聚合酶處理形成平頭，或者可以連接到銜接物或接頭(adaptor)序列幫助它與所選啟動(dòng)子的融合。3′SphI位點(diǎn)可被保留，或者可以連接到接頭或銜接物序列以幫助它插入到所選載體，這是采用這樣一種方式如產(chǎn)生適當(dāng)?shù)南拗莆稽c(diǎn)用于以后插入一個(gè)選擇的NIM1基因。理想地，SphI位點(diǎn)的ATG被保留并含有所選的NIM1基因的第一個(gè)ATG。Chen和Jagendorf提供為了向葉綠體轉(zhuǎn)入的理想切割共有序列，并且在每一種情況下在成熟蛋白質(zhì)的第一個(gè)位點(diǎn)優(yōu)選的是甲硫氨酸。在后面的位點(diǎn)有更多的變化并且氨基酸可以不那么嚴(yán)格。在任何情況下，融合構(gòu)件可以利用Bartlett等(見(jiàn)Edelmann等(編)葉綠體分子生物學(xué)方法，Elsevier第1081-1091頁(yè)(1982))和Wasmann等(分子基因遺傳學(xué)，205446-453(1986))描述的方法評(píng)價(jià)其體外轉(zhuǎn)入效率。一般，最好的方法是用所選NIM1基因或NIM1基因變形體產(chǎn)生在氨基末端沒(méi)有修飾的融合體，并且僅僅在明顯發(fā)現(xiàn)這種融合體不能以高效率向葉綠體轉(zhuǎn)入時(shí)才引入修飾，在這種情況下的修飾可以按照已公布的文獻(xiàn)進(jìn)行(Chen和Jagendorf；Wasman等；Ko和Ko，生物化學(xué)雜志26713910-13916(1992))。一個(gè)優(yōu)選的載體是通過(guò)將prbcS-8B的Dral-SphI轉(zhuǎn)運(yùn)肽編碼片段轉(zhuǎn)移到克隆載體pCGN1761ENX/Sph-而構(gòu)建的。將該質(zhì)粒用EcoRI切割并用T4DNA聚合酶處理形成平端。質(zhì)粒prbcS-8B用SphI切割并連接到一個(gè)序列的退火的分子接頭上，其序列為5′-CCAGCTGGAATTCCG-3′/5′-CGGAATTCCAGCTGGCATG-3′(SEQIDNO16和17)。形成的產(chǎn)物用T4激酶處理使5’末端被磷酸化。隨后用Dral切割釋放轉(zhuǎn)運(yùn)肽編碼片段，將其連接到上述改造的載體的平端外-EcoRI位點(diǎn)。通過(guò)測(cè)序鑒定以與35S啟動(dòng)子3’端相鄰的5’端插入定向的克隆。這些克隆攜帶35S前導(dǎo)序列與rbcS-8A啟動(dòng)子轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列的DNA融合體，該序列從相對(duì)于rbcSATG的-58延伸到成熟蛋白質(zhì)的ATG，并且在該區(qū)域含有一個(gè)單一SphI位點(diǎn)、一個(gè)新建立的EcoRI位點(diǎn)以及原有的pCGN1761ENX的NotI和XhoI位點(diǎn)。這個(gè)新載體命名為pCGN1761/CT。DNA序列被依讀框轉(zhuǎn)移到pCGN1761/CT，方法是用PCR技術(shù)加以擴(kuò)增并在擴(kuò)增的ATG處引入SphI、NsphI或NlaIII位點(diǎn)，其用適當(dāng)?shù)南拗泼盖懈詈筮B接到用SphI切割的pCGN1761/CT中。為幫助構(gòu)建，可能需要改變克隆基因產(chǎn)物的第二個(gè)氨基酸；然而，在大多數(shù)情況下利用PCR和標(biāo)準(zhǔn)的定點(diǎn)突變能夠使得在切割位點(diǎn)周圍和成熟蛋白的第一個(gè)甲硫氨酸處構(gòu)建任何所需的序列。一個(gè)更優(yōu)選的載體是通過(guò)用prbcS-8A的BamHI-SphI片段替換pCGN1761ENX的雙35S啟動(dòng)子構(gòu)建的，BamHI-SphI片段含有全長(zhǎng)的、光調(diào)節(jié)的rbcS-8A啟動(dòng)子，其從-1083(相對(duì)于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn))到成熟蛋白的第一個(gè)甲硫氨酸。帶有破壞了SphI的經(jīng)改造的pCGN1761用PstI和EcoRI切割，并用T4DNA聚合酶處理以產(chǎn)生平端。用SphI切割prbcS-8A，并連接到上述序列的退火的分子接頭上。形成的產(chǎn)物用T4激酶處理使5′末端被磷酸化。隨后用BamHI切割釋放含有啟動(dòng)子-轉(zhuǎn)運(yùn)肽的片段，其用T4DNA聚合酶處理形成BamHI平端。如此形成的啟動(dòng)子-轉(zhuǎn)運(yùn)肽片段被克隆到制備的pCGN1761ENX載體，形成了含有rbcS-8A啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)運(yùn)肽的構(gòu)件，并在切割位點(diǎn)有一個(gè)SphI位點(diǎn)用于外源基因插入。而且，在SphI位點(diǎn)的下游有EcoRI(重建的)、NotI和XhoI克隆位點(diǎn)。此構(gòu)件命名為pCGN1761rbcS/CT。利用來(lái)自其它來(lái)源(單子葉植物和雙子葉植物)和其它基因的GS2葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽編碼序列，可以進(jìn)行類似的操作。另外，類似的操作可以用于獲得向其它亞細(xì)胞區(qū)室如線粒體的定向。2.轉(zhuǎn)錄終止子大量的轉(zhuǎn)錄終止子可用在表達(dá)盒中。它們負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)基因和正確聚腺苷酸化后的轉(zhuǎn)錄終止。適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄終止子是那些已知在植物中起作用的，包括CaMV35S終止子、tml終止子、胭脂堿合成酶終止子和豌豆rbcSE9終止子。它們可在單子葉植物和雙子葉植物中使用。3.增強(qiáng)或調(diào)節(jié)表達(dá)的序列已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大量序列增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄單位內(nèi)的基因表達(dá)，這些序列連同本發(fā)明的基因可用于提高它們?cè)谵D(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)。已表明許多內(nèi)含子序列增強(qiáng)表達(dá)，特別是在單子葉植物細(xì)胞中。例如，已發(fā)現(xiàn)當(dāng)被導(dǎo)入玉米細(xì)胞中時(shí)玉米AdhI基因的內(nèi)含子顯著增強(qiáng)在其同源啟動(dòng)子控制下野生型基因的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子1特別有效，且增強(qiáng)與氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因融合構(gòu)件的表達(dá)(Callis等，基因發(fā)育(GeneDevelop.)11183-1200()1987))。在相同的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中，來(lái)自玉米bronzel基因的內(nèi)含子具有相似的增強(qiáng)表達(dá)的作用。內(nèi)含子序列已被常規(guī)地結(jié)合到植物轉(zhuǎn)化載體中，一般在非翻譯前導(dǎo)序列內(nèi)。已知衍生自病毒的大量非翻譯前導(dǎo)序列能增強(qiáng)表達(dá)，它們?cè)陔p子葉植物中特別有效。特別地，來(lái)自煙草花葉病毒(TMV，“W-序列”)、玉米褪綠斑駁病毒(MCMV)和苜?；ㄈ~病毒(AMV)的前導(dǎo)序列表現(xiàn)出在增強(qiáng)表達(dá)中有效(例如Gallie等，核酸研究158693-8711(1987)；Skuzeski等，植物分子生物學(xué)1565-79(1990))。4.基因產(chǎn)物在細(xì)胞中的定向已知植物中存在用于定向基因產(chǎn)物的各種機(jī)制，并且控制這些機(jī)制功能的序列已被一定程度地表征。例如，基因產(chǎn)物向葉綠體的定向是由一段信號(hào)序列控制的，該信號(hào)序列位于不同蛋白質(zhì)的氨基端，在轉(zhuǎn)入葉綠體形成成熟蛋白質(zhì)時(shí)被切割(如Comai等，生物化學(xué)雜志26315104-15109(1988))。這些信號(hào)序列可被融合到異源基因產(chǎn)物上，影響異源產(chǎn)物向葉綠體的轉(zhuǎn)入(VandenBroeck，等，自然313358-363(1985))。編碼合適的信號(hào)序列的DNA可從編碼RUBISCO蛋白、CAB蛋白、EPSP合成酶、GS2蛋白和許多其它已知定位于葉綠體的蛋白質(zhì)的cDNA的5′末端分離到。其它基因產(chǎn)物定位于其它器官如線粒體和過(guò)氧化物酶體(如Unger等，植物分子生物學(xué)，13411-418(1989))。編碼這些產(chǎn)物的cDNA也可經(jīng)操作以影響異源基因產(chǎn)物向這些器官的定向。這種序列的例子是核編碼的ATP酶和線粒體特異的天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶同工酶。定向細(xì)胞蛋白體已被Rogers等(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，826512-6516(1985))描述。另外，表征了引起基因產(chǎn)物向其它細(xì)胞區(qū)室向的序列。氨基末端序列負(fù)責(zé)向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、非原質(zhì)體和從糊粉體向胞外分泌的定向(Koehler和Ho，植物細(xì)胞2769-783(1990))。另外，氨基末端序列和羧基末端序列一起負(fù)責(zé)基因產(chǎn)物向液泡的定向(Shinshi等，植物分子生物學(xué)14357-368(1990))。通過(guò)將上述適當(dāng)?shù)亩ㄏ蛐蛄腥诤系侥繕?biāo)轉(zhuǎn)基因序列中，就有可能將基因產(chǎn)物定向到任何細(xì)胞或細(xì)胞區(qū)室。例如對(duì)于葉綠體的定向，來(lái)自RUBISCO基因、CAB基因、EPSP合成酶基因或GS2基因的葉綠體信號(hào)序列依讀框融合到轉(zhuǎn)基因的氨基末端ATG上。所選的信號(hào)序列應(yīng)含有已知的切割位點(diǎn)，并且構(gòu)建的融合體應(yīng)考慮到用于切割所需的切割位點(diǎn)后面的任何一個(gè)氨基酸。在一些情況下，這種要求可以通過(guò)在切割位點(diǎn)和轉(zhuǎn)基因的ATG之間加入小數(shù)目的氨基酸得到滿足，或者替換轉(zhuǎn)基因序列中的一些氨基酸。用于葉綠體轉(zhuǎn)入構(gòu)建的融合體可以通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄構(gòu)件的體外翻譯來(lái)測(cè)試葉綠體的吸收效率，隨后利用由Bartlett等，見(jiàn)Edelmann等編的葉綠體分子生物學(xué)方法，Elsevier第1081-1091頁(yè)(1982)和Wasmann等，分子基因遺傳學(xué)205446-453(1986)中所描述的方法進(jìn)行體外葉綠體吸收。這些構(gòu)建技術(shù)在本領(lǐng)域眾所周知，并且可以對(duì)等地用于線粒體和過(guò)氧化物酶體。上述用于細(xì)胞定向的機(jī)制不僅可以與其同源啟動(dòng)子一起應(yīng)用，還可以與異源啟動(dòng)子一起應(yīng)用以影響在啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)下的特定細(xì)胞定向目標(biāo)，該啟動(dòng)子具有不同于由定向信號(hào)驅(qū)動(dòng)的啟動(dòng)子的表達(dá)方式。C.轉(zhuǎn)化一旦NIM1編碼序列被克隆到一個(gè)表達(dá)系統(tǒng)中，它就被轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞中。適合轉(zhuǎn)化的植物組織包括葉組織、根組織、分生組織和原生質(zhì)體。本系統(tǒng)可用于任何可被轉(zhuǎn)化并再生的植物。這些用于轉(zhuǎn)化和再生的方法在本領(lǐng)域是眾所周知的。構(gòu)建植物表達(dá)盒的方法學(xué)以及外源基因向植物中的導(dǎo)入在本領(lǐng)域有描述。通常地，為了將外源DNA導(dǎo)入植物，采用Ti質(zhì)粒載體以輸運(yùn)外源DNA。用于這種輸運(yùn)的方法還有直接DNA吸收、脂質(zhì)體、電穿孔、顯微注射和微粒轟擊。這些方法在本領(lǐng)域已經(jīng)公開(kāi)。參閱，例如，Bilang等，(1991)基因100247-250；Scheid等，(1991)分子基因遺傳學(xué)228104-112；Guerche等，(1987)植物科學(xué)52111-116；Neuhause等，(1987)理論與應(yīng)用遺傳學(xué)7530-36；Klein等，(1987)自然32770-73；Howell等，(1980)科學(xué)2081256；Horsch等，(1985)科學(xué)2271229-1231；Deblock等，(1989)植物生理91694-701；植物分子生物學(xué)方法(Weissbach和Weissbach，編著)學(xué)院出版公司(1989)。還參閱美國(guó)專利5,625,136,在此完整引入作為參考。要理解轉(zhuǎn)化的方法依賴于待轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。煙草、番茄、馬鈴薯和擬南芥的轉(zhuǎn)化采用雙元Ti載體系統(tǒng)。植物生理81301-305，1986；Fry，J.，Barnason，A.，和Horsch，R.B.利用以根癌土壤桿菌為基礎(chǔ)的載體轉(zhuǎn)化蕓苔。植物細(xì)胞報(bào)告6321-325，1987；Block，M.d.利用根癌土壤桿菌的不依賴于基因型的葉盤轉(zhuǎn)化馬鈴薯(Solanumtuberosum)。理論與應(yīng)用遺傳學(xué)76767-774，1988；Deblock，M.，Brouwer，D.D.，和Tenning，P.利用根癌土壤桿菌轉(zhuǎn)化蕓苔和甘藍(lán)及在轉(zhuǎn)基因植物中bar和neo基因的表達(dá)。植物生理91694-701，1989；Baribault，T.J.，Skene，K.G.M.，Cain，P.A.，和Scott，N.S.轉(zhuǎn)基因葡萄表達(dá)β-葡糖苷酸酶的幼芽的再生。植物細(xì)胞報(bào)告411045-1049，1990；Hinchee，M.A.W.，Newell，C.A.，ConnorWard，D.V.，Armstrong，T.A.，Deaton，W.R.，Sato，S.S.，和Rozman，R.J.，非茄科作物的轉(zhuǎn)化和再生。Stadler.Genet.Symp.203212.203-212，1990；Barfield，D.G.和Pua，E.C.利用根癌土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化在芥菜中的基因轉(zhuǎn)移。植物細(xì)胞報(bào)告，10308-314，1991；Cousins，Y.L.，Lyon，B.R.，和Llewellyn，K.J.澳大利亞棉花栽培品種的轉(zhuǎn)化通過(guò)基因工程改良棉花的展望。澳大利亞植物生理雜志18481-494，1991；Chee，P.P.和Slightom，J.L.利用微粒轟擊鑒別含功能性或非功能性轉(zhuǎn)移基因的黃瓜組織的轉(zhuǎn)化?；?18255-260，1992；Christou，P.，F(xiàn)ord，T.L.，和Kofron，M.水稻的不依賴于品種的基因轉(zhuǎn)移方法進(jìn)展。生物技術(shù)進(jìn)展(TrendsBiotechnol.)10239-246，1992；D′Halluin，K.，Bossut，M.，Bonne，E.，Mazur，B.，Leemans，J.，和Botterman，J.甜菜(BetavulgarisL.)的轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)基因植物抗除草劑的評(píng)價(jià)。生物技術(shù)(Bio/Technol.)10309-314，1992；Dhir，S.K.，Dhir，S.，Savka，M.A.，Belanger，F(xiàn).，Kriz，A.L.，F(xiàn)arrand，S.K.，和Widholm，J.M.從電穿孔原生質(zhì)體再生轉(zhuǎn)基因大豆(GlycineMax)。植物生理9981-88，1992；Ha，S.B.，Wu，F(xiàn).S.，和Thorne，T.K.從原生質(zhì)體再生的轉(zhuǎn)基因草炭型高狐茅(FestucaarundinaceaSchreb.)植物。植物細(xì)胞報(bào)告11601-604，1992；Blechl，A.E.小麥改良第78次年會(huì)轉(zhuǎn)化新工具要點(diǎn)評(píng)述。禾谷類食物世界(CerealFoodWorld)38846-847，1993；Casas，A.M.，Kononowicz，A.K.，Zehr，U.B.，Tomes，D.T.，Axtell，J.D.，Butler，L.G.，Bressan，R.A.，和Hasegawa，P.M.通過(guò)微粒轟擊原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)基因高粱植物。美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)9011212-11216，1993；Christou，P依賴品種的基因轉(zhuǎn)移到頑固作物的哲學(xué)與實(shí)踐。體外細(xì)胞發(fā)育生物學(xué)-植物29P119-124，1993；Damiani，F(xiàn).，Nenz，E.，Paolocci，F(xiàn).，和Arcioni，S.通過(guò)發(fā)根土壤桿菌(Agrabacteriumrhizogenes)轉(zhuǎn)化將潮霉素抗性導(dǎo)入蓮類。轉(zhuǎn)基因研究2330-335，1993；Davies，D.R.，Hamilton，J.，和Mullineaux，P.豌豆的轉(zhuǎn)化。植物細(xì)胞報(bào)告12180-183，1993；Dong，J.Z.和Mchughen，A.從土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化嵌合再生體的轉(zhuǎn)基因亞麻植物及轉(zhuǎn)基因植物的遺傳。植物科學(xué)91139-148，1993；Fitch，M.M.M.，Manshardt，R.M.，Gonsalves，D.，和Slightom，J.L.從土壤桿菌介導(dǎo)的體細(xì)胞胚的轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因番木瓜植物。植物細(xì)胞報(bào)告12245-249，1993；Franklin，C.I.和Trieu，T.N.通過(guò)Biolistic轟擊介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)化飼料草高加索須芒草。植物生理102167，1993；Golovkin，M.V.，Abraham，M.，Morocz，S.，Bottka，S.，F(xiàn)eher，A.，和Dudits，D.通過(guò)直接DNA吸收進(jìn)入胚發(fā)生原生質(zhì)體產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因玉米植物。植物科學(xué)9041-52，1993；Guo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織和原生質(zhì)體、采用PEG或電穿孔轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體，以及從轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體再生為玉米植株的技術(shù)。Gordon-Kamm等(植物細(xì)胞2603-618(1990))和Fromm等(生物技術(shù)8833-839(1990))發(fā)表了利用粒子轟擊法轉(zhuǎn)化A188-衍生玉米系的技術(shù)。而且，申請(qǐng)WO93/07278(Ciba-Geigy)和Koziel等(生物技術(shù)11194-200(1993))描述了利用粒子轟擊法轉(zhuǎn)化玉米優(yōu)良自交系的技術(shù)。此技術(shù)利用未成熟的玉米胚，其長(zhǎng)度為1.5-2.5mm，采自授粉后14-15天的玉米穗，以及PDS-1000HeBiolistics轟擊設(shè)備。水稻的轉(zhuǎn)化也可以通過(guò)利用原生質(zhì)體或粒子轟擊法基因直接轉(zhuǎn)移技術(shù)來(lái)進(jìn)行。原生質(zhì)體介導(dǎo)的技術(shù)已被描述用于粳型稻和秈型稻(Zhang等，植物細(xì)胞報(bào)告7379-384(1988)；Shimarmoto等，自然338274-277(1989)；Datta等，生物技術(shù)8736-740(1990))。兩種類型都可以利用粒子轟擊法常規(guī)轉(zhuǎn)化(Christou等，生物技術(shù)9957-962(1991))。專利申請(qǐng)EP0332581(Ciba-Geigy)描述了用于形成、轉(zhuǎn)化和再生Pooideae原生質(zhì)體的技術(shù)。這些技術(shù)可以轉(zhuǎn)化鴨茅屬(Dactylis)和小麥。而且，小麥的轉(zhuǎn)化已被Vasil等(生物技術(shù)10667-674(1992)描述，利用粒子轟擊轉(zhuǎn)入C型長(zhǎng)期可再生愈傷組織，以及Vasil等(生物技術(shù)111553-1558(1993)和Weeks等(植物生理1021077-1084(1993))利用粒子轟擊未成熟胚和未成熟胚衍生的愈傷組織。但是，小麥轉(zhuǎn)化的一個(gè)優(yōu)選技術(shù)包括利用粒子轟擊未成熟胚轉(zhuǎn)化小麥，并包括在基因轉(zhuǎn)移前的一個(gè)高蔗糖或是高麥芽糖的步驟。轟擊前，任何數(shù)目的胚(0.75-1mm長(zhǎng))涂布到含3％蔗糖和用于體細(xì)胞胚誘導(dǎo)的3毫克/升的2，4-D的MS培養(yǎng)基上(Murashiga和Skoog，PhysiologiaPlantarum15473-497(1962))，在暗處進(jìn)行。在轟擊當(dāng)天，將胚從誘導(dǎo)培養(yǎng)基上移走并放到滲壓劑上(即以所需濃度，通常15％，添加蔗糖或麥芽糖的誘導(dǎo)培養(yǎng)基)。使胚進(jìn)行質(zhì)壁分離2-3小時(shí)然后進(jìn)行轟擊。一般每個(gè)靶板上有20個(gè)胚，但并不關(guān)鍵。將合適的帶有基因的質(zhì)粒(如pCIB3064和pSG35)用標(biāo)準(zhǔn)步驟沉淀到微米大小的金粒上。將每個(gè)胚板用DuPontBiolistics氦設(shè)備轟擊，轟擊壓約為1000psi，使用標(biāo)準(zhǔn)80目篩網(wǎng)。轟擊后，將胚放回到暗處恢復(fù)約24小時(shí)(仍然在滲壓劑上)。24小時(shí)后，將胚從滲壓劑上移出并放回到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在再生前放置約1個(gè)月。大約1個(gè)月后，將具有成胚愈傷組織的胚外植體轉(zhuǎn)移到再生培養(yǎng)基上(MS+1毫克/升NAA，5毫克/升GA)，并含有適當(dāng)?shù)倪x擇劑(pCIB3064質(zhì)粒用10毫克/升basta，pSG35質(zhì)粒用2毫克/升氨甲喋呤)。大約1月后，形成的芽轉(zhuǎn)移到較大的無(wú)菌容器如“GA7”，其中含有一半濃度的MS、2％蔗糖和相同濃度的選擇劑。專利申請(qǐng)08/147,161描述了小麥轉(zhuǎn)化的方法，在此引入作為參考。最近，利用土壤桿菌的單子葉植物的轉(zhuǎn)化已被描述。參閱，WO94/00977和美國(guó)專利5,591,616，將二者在此引入作為參考。育種本發(fā)明的經(jīng)分離的基因片段或NIM1基因變形體可用于賦予多種植物細(xì)胞以抗病性，包括裸子植物、單子葉植物和雙子葉植物。盡管基因可以插入到屬于這些大類的任何植物細(xì)胞中，但是在作物類植物中特別有用，例如水稻、小麥、大麥、黑麥、玉米、馬鈴薯、胡蘿卜、甜馬鈴薯、甜菜、菜豆、豌豆、菊苣、萵苣、白菜、花椰菜、花莖甘藍(lán)、蕪菁、蘿卜、菠菜、蘆筍、洋蔥、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、胡蘿卜、南瓜、西葫蘆、小西葫蘆、黃瓜、蘋果、梨、溫孛、甜瓜、李子、櫻桃、桃、蜜桃、杏、草莓、葡萄、覆盆子、黑莓、鳳梨、鱷梨、番木瓜樹(shù)、芒果、香蕉、大豆、煙草、番茄、高粱和甘蔗。SAR基因組成型表達(dá)所需的NIM1基因和其突變型的過(guò)量表達(dá)，與其它對(duì)于產(chǎn)量和質(zhì)量重要的性狀均可以通過(guò)育種引入到植物品系中。因此本發(fā)明的進(jìn)一步的實(shí)施方案是產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因親本植物的轉(zhuǎn)基因后代的方法，其中轉(zhuǎn)基因親本植物含有編碼本發(fā)明NIM1蛋白變形體的經(jīng)分離的DNA分子，該方法包括用本發(fā)明的重組載體分子轉(zhuǎn)化所說(shuō)的親本植物，并利用已知的植物育種技術(shù)將性狀轉(zhuǎn)移到所說(shuō)的轉(zhuǎn)基因親本植物的后代中。育種途徑和技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。參閱，如，WelshJ.R.，植物遺傳和育種基礎(chǔ)(FundamentalsofPlantGeneticsandBreeding)，JohnWiley&amp;Sons，NY(1981)；作物育種(CropBreeding)，WoodD.R.美國(guó)農(nóng)學(xué)會(huì)，Madison，Wisconsin(1983)；MayoO.，植物育種理論(TheTheoryofPlantBreeding)，第二版，Clarendon出版社，Oxford(1987)；Singh，D.P.，抗病和抗蟲(chóng)害育種(BreedingforResistancetoDiseasesandInsectPests)，Springer-Verlag，NY(1986)；和Wricke和Weber，數(shù)量遺傳學(xué)和選擇植物育種(QuantitativeGeneticsandSelectionPlantBreeding)，WalterdeGruyterandCo.，柏林(1986)。導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因種子和植物中的遺傳特性的傳播以及在后代植物中的維持導(dǎo)入上述轉(zhuǎn)基因種子和植物中的遺傳特性通過(guò)有性繁殖或營(yíng)養(yǎng)體生長(zhǎng)傳遞下去，因此可以在后代植物中維持和傳播。一般所說(shuō)的維持和傳播利用了已知發(fā)展為適合特定目的，例如耕種、播種或收獲的農(nóng)業(yè)方法。專門化的方法如水耕法和溫室技術(shù)也可以采用。因?yàn)樯L(zhǎng)的作物對(duì)由昆蟲(chóng)和感染引起的攻擊和傷害以及對(duì)雜草植物的競(jìng)爭(zhēng)十分脆弱，采取了控制雜草、植物疾病、昆蟲(chóng)、線蟲(chóng)和其它不利條件以提高產(chǎn)量的措施。它們包括機(jī)械化措施如耕地或除去雜草和被侵染的植物，以及利用農(nóng)業(yè)化學(xué)品如除草劑、殺真菌劑、殺配子劑、殺線蟲(chóng)劑、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、催熟劑和殺蟲(chóng)劑。在植物育種中可進(jìn)一步利用本發(fā)明轉(zhuǎn)基因植物和種子的有益的遺傳特性，形成具有改良特性的植物，如對(duì)害蟲(chóng)、除草劑或逆境的抗性、改善營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、增加產(chǎn)量或改善結(jié)構(gòu)使存放和粉碎時(shí)的損失減小。多種育種途徑均以明確的人類干預(yù)為特征，例如選擇合適的雜交品系、指導(dǎo)親本系授粉，或選擇合適的后代植物。根據(jù)所需特性可采取不同的育種策略。相關(guān)的技術(shù)在本領(lǐng)域是眾所周知的，包括但并不限于雜交、自交、回交育種、多系育種、變種融合、種間雜交、非整倍體技術(shù)等等。雜交技術(shù)還包括通過(guò)機(jī)械、化學(xué)或生化方法的植物不育化以獲得雄性或雌性不育植物。雄性不育植物與不同品系的花粉交叉授粉保證了雄性基因組不育，但雌性可育植物會(huì)一致地獲得雙親品系的特性。因此，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因種子和植物可用于改良的植物品系的育種，例如增加傳統(tǒng)方法，如用除草劑或殺蟲(chóng)劑處理的有效性或允許用所說(shuō)的方法根據(jù)其改造的遺傳特性進(jìn)行分配?；蛘撸梢缘玫骄哂懈纳颇婢晨剐缘男伦魑铮捎谄鋬?yōu)化的遺傳“裝備”，與不能耐受相似的不利發(fā)育條件的作物相比可獲得豐收的產(chǎn)量或更優(yōu)良的品質(zhì)。在種子生產(chǎn)中，發(fā)芽質(zhì)量和種子的一致性是重要的產(chǎn)品特性，而農(nóng)民收獲和出售的種子的發(fā)芽質(zhì)量和種子的一致性是不重要的。因?yàn)楹茈y使一種作物與其它作物和雜草種子分開(kāi)、難于控制種傳病害和生產(chǎn)發(fā)芽好的種子，相當(dāng)廣泛的和確切的種子生產(chǎn)實(shí)踐已被種子生產(chǎn)商開(kāi)發(fā)出來(lái)，他們?cè)诜N植、調(diào)節(jié)和營(yíng)銷純種子的領(lǐng)域有經(jīng)驗(yàn)。因此，對(duì)農(nóng)民來(lái)說(shuō)，購(gòu)買符合特定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的合格的種子而不是使用從他自己的作物中收獲的種子，是正常的習(xí)慣。采用的作為種子的繁殖材料通常用含有除草劑、殺蟲(chóng)劑、殺真菌劑、殺細(xì)菌劑、殺線蟲(chóng)劑、殺螺藥或其混合物的保護(hù)劑涂層處理。通常采用的保護(hù)劑涂層含有化合物如克菌丹，萎銹靈，福美雙(TMTD)，瑞毒霉(Apron)和甲基蟲(chóng)螨膦(Actellic)。需要的話，這些化合物可用另外的載體、表面活性劑或促進(jìn)應(yīng)用的助劑配制在一起，它們通常應(yīng)用在本領(lǐng)域的配方中，對(duì)由細(xì)菌、真菌或動(dòng)物害蟲(chóng)造成的傷害提供保護(hù)。保護(hù)劑涂層可采用用液體配方滲透?jìng)鞑ゲ牧?，或用組合的濕的或干的配方包衣。應(yīng)用的其它方法也是可能的，例如對(duì)芽或果實(shí)的處理。本發(fā)明的另一個(gè)方面是提供新的農(nóng)業(yè)方法例如上面闡述的方法，它們的特征為利用本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物、轉(zhuǎn)基因植物材料，或轉(zhuǎn)基因種子?？梢栽谟珊线m包裝材料構(gòu)成的袋中、容器或器皿中提供種子，袋或容器能夠封閉以存放種子。袋、容器或器皿可以設(shè)計(jì)成用于短期或長(zhǎng)期儲(chǔ)存種子，或用于短期和長(zhǎng)期儲(chǔ)存種子。合適的包裝材料的例子包括紙，如牛皮紙、硬或軟塑料或其它聚合物材料、玻璃或金屬。希望袋、容器或器皿含有多層相同或不同類型的包裝材料。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了袋、容器或器皿以排除或限制水和潮氣接觸種子。在一個(gè)實(shí)施方案中，密封了袋、容器或器皿，如熱密封，以防止水分或潮氣的進(jìn)入。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在包裝材料層之間放置了吸水性材料。在另一個(gè)實(shí)施方案中，袋、容器、器皿或所組成的包裝材料經(jīng)處理以限制、抑制或阻止病害、污染或其它對(duì)種子儲(chǔ)存或運(yùn)輸不利的影響。這種處理的一個(gè)例子是消毒，例如通過(guò)化學(xué)法或通過(guò)暴露在射線中。本發(fā)明包括裝有轉(zhuǎn)基因植物的種子的商品袋，該種子含有至少一種NIM1蛋白變形體或者在所說(shuō)的植物中比野生型植物表達(dá)水平高的NIM1蛋白，以及合適的載體，以及利用其賦予植物廣譜抗病性的使用說(shuō)明?？共⌒钥共⌒缘脑u(píng)價(jià)是根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行的。例如參閱，Uknes等，(1993)植物與微生物的分子相互作用6680-685；Gorlach等，(1996)植物細(xì)胞8629-643；Alexander等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)907327-7331。A.寄生疫霉(黑脛病)抗性分析對(duì)黑脛病致病菌寄生疫霉的抗性的分析是在按照Alexander等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)907327-7331中所述培養(yǎng)的6周齡植物上進(jìn)行的。給植物澆水，使排水良好，然后用10毫升孢子囊懸液(每毫升300孢子囊)接種到土壤中。被接種的植物放到溫室中，維持白天的溫度為23-25℃，夜間溫度為20-22℃。作為分析的枯萎指標(biāo)是0＝無(wú)癥狀；1＝無(wú)病癥；1＝一些枯萎的跡象，飽滿度降低；2＝明顯的枯萎癥狀，但沒(méi)有腐爛或發(fā)育遲緩；3＝明顯的枯萎癥狀，發(fā)育遲緩，但沒(méi)有明顯的莖腐；4＝嚴(yán)重枯萎，有可見(jiàn)莖腐和根系受到某種程度損傷；5＝象4一樣，但植株瀕臨死亡，并且根系嚴(yán)重?fù)p傷。所有分析都是在隨機(jī)設(shè)計(jì)的植物上進(jìn)行盲測(cè)。B.丁香假單胞菌抗性分析將丁香假單胞菌煙草致病變種菌株#551注射到幾株6-7周齡植物的兩片較矮的葉片中，細(xì)菌濃度為每毫升水106或3×106。在每一個(gè)時(shí)間點(diǎn)評(píng)價(jià)6株個(gè)體植株。被煙草假單胞菌感染的植株根據(jù)5點(diǎn)病害嚴(yán)重度進(jìn)行分級(jí)，5＝100％組織死亡，0＝無(wú)癥狀。對(duì)每天的評(píng)價(jià)進(jìn)行T-檢驗(yàn)(LSD)，病害分級(jí)值經(jīng)過(guò)平均后表示分組情況。在評(píng)價(jià)那天以相同字母表示的值在統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒(méi)有顯著差異。C.煙草尾孢菌(Cercosporanicotianae)抗性分析煙草尾孢菌(ATCC#18366)孢子懸液(每毫升100,000-150,000個(gè)孢子)噴霧葉片表面至即將流下來(lái)。植物在100％濕度下維持5天。然后將植物每天噴水5-10次。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)評(píng)價(jià)6株個(gè)體植株。煙草尾孢菌以表現(xiàn)病害癥狀的葉片面積的百分?jǐn)?shù)分級(jí)。對(duì)每天的評(píng)價(jià)進(jìn)行T-檢驗(yàn)(LSD)，病害分級(jí)值經(jīng)過(guò)平均后表示分組情況。在評(píng)價(jià)那天以相同字母表示的值在統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒(méi)有顯著差異。D.寄生霜霉抗性分析對(duì)寄生霜霉抗性的分析是在植物上按照Uknes等，(1993)所述進(jìn)行的。植物通過(guò)用分生孢子懸液(每毫升大約5×104孢子)噴霧接種相容性寄生霜霉分離物。接種的植物在生長(zhǎng)箱中培養(yǎng)在濕潤(rùn)、17℃條件下，以14小時(shí)白天/10小時(shí)夜間為一個(gè)循環(huán)。分生孢子接種后3-14天，優(yōu)選地7-12天檢測(cè)植物。另外，從每個(gè)處理中隨機(jī)選擇幾株植物用乳酚-錐蟲(chóng)藍(lán)染色(Keogh等，Trans.Br.Mycol.Soc.74329-333(1980))用于顯微鏡檢測(cè)。附圖簡(jiǎn)述圖1表示化學(xué)誘導(dǎo)物對(duì)野生型和nim1植物中SAR基因表達(dá)的誘導(dǎo)作用。SAR基因的化學(xué)誘導(dǎo)在nim1植物中消失。水、SA、INA、或BTH應(yīng)用于野生型(WT)和nim1植物。3天后，從這些植物中制備RNA并檢測(cè)PR-1、PR-2，和PR-5的表達(dá)。圖2描述在被病原體感染的Ws-O和nim1植物中PR-1基因的表達(dá)。病原體誘導(dǎo)的PR-1在nim1植物中消失。野生型(WT)和nim1植物用寄生霜霉Emwa種噴霧接種。在第0、1、2、4和6天收集樣品，用斑點(diǎn)雜交分析RNA，即用擬南芥PR-1cDNA探針檢測(cè)PR-1mRNA的積累。圖3表示病原體感染或化學(xué)處理后PR-1mRNA在nim1突變型和野生型植物中的積累。含有nim1等位基因nim1-1、-2、-3、-4、-5和-6的植物和Ws-O(Ws)的植物在RNA分離前3天用水(C)、SA、INA、或BTH處理。Emwa樣品含有從寄生霜霉Emwa分離物接種后14天的植物中分離的RNA。用擬南芥PR-1cDNA作探針進(jìn)行斑點(diǎn)雜交(Uknes等，1992)。圖4表示被丁香假單胞菌感染的Ws-O和nim1植物中SA積累的水平。nim1植物在接觸病原體后積累SNA。野生型和nim1植物的葉片用PstDC3000(avrRpt2)或載體介質(zhì)(10mMMgCl2)單獨(dú)浸濕。2天后，從未處理的、MgCl2處理的和DC3000(avrRpt2)處理的植物中收集樣品。用細(xì)菌處理的樣品分為初級(jí)(浸濕的)和次級(jí)(未浸濕的)葉片。用β-葡糖苷酶水解后的游離SA和總SA由HPLC定量。誤差帶(errorbar)表示三個(gè)重復(fù)樣品的標(biāo)準(zhǔn)差(SD)。圖5A-D列出了以NIM1為中心的分辨率增加的總體圖譜，指出了在NIM1區(qū)域的重組子，包括BAC、YAC和粘粒(A)NIM1在染色體1上的圖譜位置。配子總數(shù)為2276。(B)用于克隆NIM1的酵母人工染色體(以條紋線表示)，細(xì)菌人工染色體(BAC)，和P1克隆。(C)覆蓋NIM1座位的粘粒克隆。與nim1-1互補(bǔ)的三個(gè)粘粒以粗線表示。(D)在最小的互補(bǔ)基因組DNA片段上的四個(gè)推斷的基因區(qū)域。包括NIM1基因的四個(gè)開(kāi)放閱讀框以中空條表示。箭頭表示轉(zhuǎn)錄的方向。編號(hào)對(duì)應(yīng)于粘粒D7上擬南芥基因組DNA的第一個(gè)堿基。圖6表示NIM1基因的核酸序列和NIM1基因產(chǎn)物的氨基酸序列，包括在不同等位基因中的改變。位于SEQIDNO1上的9.9kb序列的相對(duì)鏈上的這個(gè)核酸序列也在SEQIDNO2中給出，NIM1基因產(chǎn)物的氨基酸序列也在SEQIDNO3中給出。圖7表示在野生型植物和nim1突變型等位基因植物中被INA、BTH、SA和病原體處理誘導(dǎo)的NIM1的積累。在圖3中的RNA凝膠斑點(diǎn)用衍生自圖6所示序列中的2081至3266的探針檢測(cè)RNA的表達(dá)。圖8是四個(gè)水稻基因序列(SEQIDNO4-11)的NIM1蛋白和cDNA蛋白產(chǎn)物的表達(dá)序列標(biāo)簽區(qū)的氨基酸序列比較；編號(hào)對(duì)應(yīng)于SEQIDNO3中的氨基酸位置。圖9是NIM1蛋白序列與小鼠、大鼠和豬的IκBα的序列比較。序列上面的垂直條(I)表示NIM1和IκBα序列之間相同(陣列評(píng)分等于1.5)；序列上面的雙點(diǎn)()表示相似得分＞0.5；序列上面的單點(diǎn)(.)表示相似得分＜0.5但＞0.0；而得分＜0.0表示沒(méi)有相似性并且序列上面沒(méi)有標(biāo)記(參閱實(shí)施例)。哺乳動(dòng)物的IκBα錨蛋白結(jié)構(gòu)域的位置根據(jù)deMartin等，基因152253-255(1995)鑒定。序列內(nèi)部的點(diǎn)表示NIM1和IκBα蛋白之間的間隔。IκBα中的5個(gè)錨蛋白重復(fù)以序列下面的虛線表示。氨基酸以對(duì)應(yīng)于NIM1蛋白加以編號(hào)，在適當(dāng)?shù)牡胤揭腴g隔。加號(hào)(+)放在每隔10個(gè)氨基酸的序列上面。保藏物下列載體分子已經(jīng)保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，12301ParklawnDriveRockville，MD20852，美國(guó)，保藏時(shí)間如下質(zhì)粒BAC-04于1996年5月8日保藏于ATCC，編號(hào)ATCC97543。質(zhì)粒P1-18于1996年6月13日保藏于ATCC，編號(hào)ATCC97606。粘粒D7于1996年9月25日保藏于ATCC，編號(hào)ATCC97736。序列表中序列的簡(jiǎn)述SEQIDNO1-圖5D中NIM1基因區(qū)2的9919-bp基因組序列。SEQIDNO2-圖6中的5655bp基因組序列(SEQIDNO1的相對(duì)鏈)，包括野生型擬南NIM1基因的編碼區(qū)。SEQIDNO3-由SEQIDNO2的cds編碼的野生型NIM1蛋白的氨基酸序列。SEQIDNO4-圖8的水稻-1的氨基酸序列33-155。SEQIDNO5-圖8的水稻-1的氨基酸序列215-328。SEQIDNO6-圖8的水稻-2的氨基酸序列33-155。SEQIDNO7-圖8的水稻-2的氨基酸序列208-288。SEQIDNO8-圖8的水稻-3的氨基酸序列33-155。SEQIDNO9-圖8的水稻-3的氨基酸序列208-288。SEQIDNO10-圖8的水稻-4的氨基酸序列33-155。SEQIDNO11-圖8的水稻-4的氨基酸序列215-271。SEQIDNO12-寡核苷酸。SEQIDNO13-寡核苷酸。SEQIDNO14-寡核苷酸。SEQIDNO15-寡核苷酸。SEQIDNO16-寡核苷酸。SEQIDNO17-寡核苷酸。SEQIDNO18是圖8的小鼠IκBα氨基酸序列。SEQIDNO19是圖8的大鼠IκBα氨基酸序列。SEQIDNO20是圖8的豬的IκBα氨基酸序列。SEQIDNO21是擬南芥NIM1基因的cDNA序列。SEQIDNO22和23分別是在氨基酸位點(diǎn)55和59以丙氨酸代替絲氨酸的一種顯性-負(fù)性形式的NIM1蛋白之DNA編碼序列和所編碼的氨基酸序列。SEQIDNO24和25分別是具有N-末端缺失的一種顯性-負(fù)性形式的NIM1蛋白之DNA編碼序列和所編碼的氨基酸序列。SEQIDNO26和27分別是具有C-末端缺失的一種顯性-負(fù)性形式的NIM1蛋白之DNA編碼序列和所編碼的氨基酸序列。SEQIDNO28和29分別是具有N-末端和C-末端氨基酸缺失的NIM1基因變形體之DNA編碼序列和所編碼的氨基酸序列。SEQIDNO30和31分別是NIM1的錨蛋白結(jié)構(gòu)域之DNA編碼序列和所編碼的氨基酸序列。SEQIDNO32至39是寡核苷酸引物。定義acd加速細(xì)胞死亡突變型植物AFLP擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性avrRpt2無(wú)毒基因Rpt2，分離自丁香假單胞菌BAC細(xì)菌人工染色體BTH苯并(1，2，3)噻二唑-7-硫代羧酸S-甲基酯CIM組成型免疫表型(SAR是組成型激活的)cim組成型免疫突變型植物cM厘摩cpr1PR基因突變型植物的組成型表達(dá)體Col-O擬南芥哥倫比亞生態(tài)型ECs酶結(jié)合物Emwa與擬南芥Ws-O生態(tài)型相容的寄生霜霉分離物EMS甲基磺酸乙酯INA2，6-二氯異煙酸Ler擬南芥Landsbergerecta生態(tài)型lsd病斑刺激病突變型植物nahG水楊酸羥化酶，將水楊酸轉(zhuǎn)化為兒茶酚的惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)NahG用nahG基因轉(zhuǎn)化的擬南芥品系ndr非種特異性抗病性突變型植物nim非誘導(dǎo)免疫突變型植物NIM1野生型基因，參與SAR信號(hào)傳導(dǎo)途徑級(jí)聯(lián)反應(yīng)NIM1由野生型NIM1基因編碼的蛋白質(zhì)nim1NIM1的突變型等位基因，賦予植物對(duì)病害敏感性；也指具有NIM1的nim1突變型等位基因的突變型擬南芥植物Noco與擬南芥Col-O生態(tài)型相容的寄生霜霉分離物ORF開(kāi)放閱讀框PCs引物結(jié)合物SA水楊酸SAR系統(tǒng)獲得性抗性SSLP簡(jiǎn)單序列長(zhǎng)度多態(tài)性UDS廣泛疾病敏感表型Wela與擬南芥Weiningen生態(tài)型相容的寄生霜霉分離物Ws-O擬南芥Issilewskijia生態(tài)型WT野生型YAC酵母人工染色體實(shí)施例本發(fā)明通過(guò)下面詳細(xì)的步驟、制備和實(shí)施例加以更詳細(xì)的說(shuō)明。實(shí)施例僅僅用于說(shuō)明，不能將其解釋為限制本發(fā)明的范圍。這里采用的標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA和分子克隆技術(shù)在本領(lǐng)域是眾所周知的并已被描述Sambrook，等，分子克隆，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約(1989)和T.J.Silhavy，M.L.Berman，和L.W.Enquist，基因融合實(shí)驗(yàn)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約(1989)以及Ausubel，F(xiàn).M.等，分子生物學(xué)中的現(xiàn)代技術(shù)，GreenePublishingAssoc.AndWiley-Interscience出版(1987)。A.nim1突變型的表征實(shí)施例1植物品系和真菌菌株擬南芥Isilewskijia生態(tài)型(Ws-O；保藏號(hào)CS2360)和T-DNA轉(zhuǎn)化品系的第4代(T4)種子來(lái)自俄荷俄州立大學(xué)擬南芥生物資源中心(Columbus，OH)。用甲基磺酸乙酯(EMS)誘變的Ws-O植物的第2代(M-2)種子來(lái)自LehleSeed(RoundRock，TX)。含有克隆avrRpt2基因的DC3000(avrRpt2)]的丁香假單胞菌番茄致病變種(Pst)DC3000菌株來(lái)自B.Staskawicz，加利福尼亞大學(xué)，Berkeley。寄生霜霉致病變種及其來(lái)源如下Emwa來(lái)自E.Holub和I.R.Crute，園藝研究站，EastMalling，Kent；Wela來(lái)自A.Slusarenko和B.Mauch-Mani，InstitutfurPflanzenbiologie，Zurich，瑞士；而Noco來(lái)自J.Parker，Sainsbury實(shí)驗(yàn)室，Norwich，英格蘭。真菌菌種通過(guò)培養(yǎng)在擬南芥上加以維持，對(duì)于寄生霜霉致病種Emwa、Wela和Noco分別用擬南芥生態(tài)型Ws-O、Weiningen和Col-O。實(shí)施例2突變型篩選M2或T4種子在土壤中生長(zhǎng)2周，每天光照14小時(shí)，用0.33mMINA(0.25mg/ml，由25％可濕性粉劑制成；Ciba，Basel，瑞士)噴霧，4天后通過(guò)噴霧寄生霜霉分生孢子懸液接種，懸液中每毫升水含5-10×104個(gè)分生孢子。此真菌通常對(duì)擬南芥Ws-O生態(tài)型有毒害，除非用異煙酸(INA)或一種相似的化合物先在植物中引入抗性。植物保持在潮濕條件下，18℃持續(xù)1周，然后檢查真菌孢子形成情況。經(jīng)INA處理后支持真菌生長(zhǎng)的植物被選作推斷的突變型。在高濕環(huán)境下培養(yǎng)后，鑒定具有可見(jiàn)病害癥狀的植物，一般在感染7天后。盡管應(yīng)用了抗性誘導(dǎo)化學(xué)品，這些植物也不表現(xiàn)對(duì)真菌的抗性，因此它們是潛在的nim(非誘導(dǎo)免疫)突變型植物。從360,000株植物中鑒定了75株潛在的nim突變型植物。這些潛在的突變型植物是從平原上分離的，放置在低濕度條件下，并使之結(jié)種子。從這些種子長(zhǎng)成的植物以相同的方式根據(jù)對(duì)真菌Emwa的敏感性進(jìn)行篩選，同樣經(jīng)過(guò)INA預(yù)處理后。顯示感病癥狀的子代植物定義為nim突變型。這樣鑒定了6個(gè)nim品系。-個(gè)品系(nim1-1)是從T-DNA群體中分離到的，5個(gè)(nim1-2，nim1-3，nim1-4，nim1-5，和nim1-6)是從EMS群體中分離到的。實(shí)施例3nim1植物的抗病性水楊酸(SA)和苯并(1，2，3)噻二唑-7-硫代羧酸S-甲基酯(BTH)是象INA一樣的化學(xué)品，在野生型植物中誘導(dǎo)廣譜的抗病性(SAR)。突變型植物用SA、INA和BTH處理，然后分析對(duì)寄生霜霉的抗性。寄生霜霉分離物“Emwa”是與Ws生態(tài)型相容的寄生霜霉分離物。相容性的分離物是那些能夠在特定宿主中引起病害的分離物。寄生霜霉分離物“Noco”與Ws不相容但與Columbia生態(tài)型相容。不相容的病原體被潛在的宿主識(shí)別，引起一種阻止病害發(fā)展的宿主反應(yīng).將野生型種子和每個(gè)nim1等位基因(nim1-1，-2，-3，-4，-5，-6)的種子播種到MetroMix300生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，用透明塑料圓頂覆蓋，并在4℃、黑暗處放置3天。3天4℃處理后，將植物移到人工氣候室中放置2周。通過(guò)約2周種植后，萌發(fā)的幼苗產(chǎn)生4片真葉。然后用水、5mMSA、300μMBTH或300μMINA處理植物?；瘜W(xué)品以細(xì)霧的形式使用，用chromister完全覆蓋幼苗。將水對(duì)照植物放回到生長(zhǎng)人工氣候室中，用化學(xué)處理的植物放在一個(gè)單獨(dú)的但相同的人工氣候室中。施用化學(xué)品3天后，將用水和化學(xué)處理的植物用相容的“Emwa”分離物接種。僅僅在水處理的植物上用“Noco”接種。接種后，將植物用透明塑料圓頂覆蓋以保持使寄生霜霉能夠成功感染的高濕度，并放置在一個(gè)生長(zhǎng)箱中，以白天19℃/夜間17℃和光照8小時(shí)/黑暗16小時(shí)為循環(huán)。為確定不同nim1等位基因的相對(duì)強(qiáng)度，接種后在不同時(shí)間點(diǎn)顯微分析每個(gè)突變型在正常生長(zhǎng)條件下和用SA、INA、或BTH處理后寄生霜霉的生長(zhǎng)。經(jīng)過(guò)放大，可以在病害發(fā)展的早期觀察到真菌的孢子形成。接種后，測(cè)定每盆植物中在第5天、第6天、第7天、第11天和第14天顯示孢子形成的植物的百分比，并檢查孢子形成密度。表1表示對(duì)于每一個(gè)nim1突變型植物品系，用寄生霜霉Emwa種感染后在至少一片葉子上顯示表面孢子的植物的百分比。寄生霜霉是在用水或化學(xué)品處理后3天接種到植物上的。表1表示感染后的天數(shù)，其中抗病性被分級(jí)。表1感染百分率-Emwa/對(duì)照突變型0天5天6天7天11天WsWT0102510090nim1-107595100100nim1-203085100100nim1-303090100100nim1-4080100100100nim1-5005100100nim1-6057080100感染百分率-Emwa/SA突變型0天5天6天7天11天WsWT053070100nim1-10595100100nim1-20595100100nim1-301090100100nim1-4075100100100nim1-5002075100nim1-6080100100100感染百分率-Emwa/INA突變型0天5天6天7天11天WsWT00000nim1-10580100100nim1-201595100100nim1-301060100100nim1-4080100100100nim1-500055nim1-6015090100感染百分率-Emwa/BTH突變型0天5天6天7天11天WsWT00000nim1-101530100nim1-2002590100nim1-301570100100nim1-4080100100100nim1-5001110nim1-60190100100如表1中所示，在正常生長(zhǎng)時(shí)，nim1-1，nim1-2，nim1-3，nim1-4和nim1-6都支持真菌以大約相同的速度生長(zhǎng)，其速度比Ws-0對(duì)照略快。其中的例外是nim1-5植物，其中真菌生長(zhǎng)與其它nim1突變型和Ws-0對(duì)照相比被延遲了數(shù)天，但最終所有nim1-5植物都死于真菌。SA處理后，突變型可分為三類nim1-4和nim1-6表現(xiàn)相對(duì)快的真菌生長(zhǎng)；nim1-1，nim1-2，nim1-3植物表現(xiàn)較慢的真菌生長(zhǎng)；而在nim1-5植物中的真菌生長(zhǎng)比未處理的Ws-0對(duì)照更慢。INA或BTH處理后，突變型也可分為三類，其中nim1-4是經(jīng)化學(xué)品處理后限制真菌生長(zhǎng)的能力受到最嚴(yán)重?fù)p害的；nim1-1、nim1-2、nim1-3和nim1-6都受到中等損害；而nim1-5僅受到輕微損害。在這些實(shí)驗(yàn)中，Ws-0經(jīng)INA或BTH處理后不支持真菌生長(zhǎng)。于是，從經(jīng)化學(xué)品處理后抑制真菌生長(zhǎng)來(lái)看，突變型分為三類，nim1-4受到最嚴(yán)重?fù)p害，nim1-1、nim1-2、nim1-3和nim1-6顯示中等的對(duì)真菌的抑制，而nim1-5僅輕微損害了真菌抗性。表2表示用寄生霜霉接種后7天和11天通過(guò)不同nim1等位基因以及NahG植物的感染分級(jí)所進(jìn)行的抗病性評(píng)價(jià)。WsWT表示W(wǎng)s野生型親本系，在其中發(fā)現(xiàn)了nim1等位基因。不同的nim1等位基因和NahG植物示于表中。NahG植物的描述在以前已經(jīng)發(fā)表了(Delaney等，科學(xué)266，第1247-1250頁(yè)(1994))。NahG擬南芥也在美國(guó)專利申請(qǐng)08/454,876中描述，在此引入作為參考。nahG是來(lái)自惡臭假單胞菌的基因，編碼水楊酸羥化酶，將水楊酸轉(zhuǎn)化為兒茶酚，因此消除了作為植物中SAR必需的信號(hào)傳導(dǎo)成分的水楊酸的積累。因此，NahG擬南芥植物不表現(xiàn)正常的SAR，并且通常它們表現(xiàn)出對(duì)病原體更強(qiáng)的敏感性。但是，NahG植物仍對(duì)化學(xué)誘導(dǎo)物INA和BTH有反應(yīng)。所以NahG植物可用作一種廣泛的敏感性對(duì)照。表2感染嚴(yán)重性-Emwa/水突變型7天11天WsWT33nim1-144.5nim1-234nim1-344nim1-455nim1-513.5nim1-634.5NahG45感染嚴(yán)重性-Emwa/SA突變型7天11天WsWT34nim1-134.5nim1-234nim1-334nim1-445nim1-533nim1-644.5NahG45感染嚴(yán)重性-Emwa/INA突變型突變型7天11天WsWT00nim1-12.54nim1-244nim1-333.5nim1-445nim1-512nim1-634.5NahG33感染嚴(yán)重性-Emwa/BTH突變型7天11天WsWT00nim1-12.54nim1-23.54nim1-333.5nim1-445nim1-51.52nim1-634NahG00從表2可以看出，nim1-4和nim1-6的寄生霜霉感染最嚴(yán)重；在早期可最容易地觀察到這一點(diǎn)。另外，nim1-5等位基因?qū)NA和BTH表現(xiàn)出最強(qiáng)的反應(yīng)，因此可被視為最弱的nim1等位基因。NahG植物對(duì)INA和BTH均表現(xiàn)較好的反應(yīng)，看上去與nim1-5等位基因非常相似。但是，在晚期(表中的第11天)，在NahG植物中被誘導(dǎo)的抗病性開(kāi)始減弱，并且在INA和BTH之間有復(fù)雜的區(qū)別，其在于與BTH誘導(dǎo)的NahG植物中的抗性相比，INA誘導(dǎo)的抗性減弱得更快并且更劇烈。在這些實(shí)驗(yàn)中還可看出，INA和BTH在Ws中誘導(dǎo)出對(duì)Emwa很好的抗性，而nim1-1，nim1-2和其它nim1等位基因在抗病性方面對(duì)SA或INA根本沒(méi)有表現(xiàn)出反應(yīng)。nim1植物不對(duì)SAR誘導(dǎo)化學(xué)品SA、INA、和BTH產(chǎn)生反應(yīng)，這說(shuō)明突變是這些化學(xué)品的信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的進(jìn)入點(diǎn)的下游，該信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致系統(tǒng)獲得性抗性。實(shí)施例4SAR基因表達(dá)的Northern分析因?yàn)镾A、INA和BTH不能誘導(dǎo)在任何nim1植物中的SAR，或SAR基因表達(dá)，有興趣檢測(cè)病原體感染是否誘導(dǎo)這些植物中的SAR基因表達(dá)，就象在野生型植物中那樣。所以，SAR基因mRNA的積累也被用作表征不同nim1等位基因的標(biāo)準(zhǔn)。將野生型種子和每個(gè)nim1等位基因(nim1-1，-2，-3，-4，-5，-6)的種子播種到MetroMix300生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，用透明塑料圓頂覆蓋，并在4℃、黑暗處放置3天。3天4℃處理后，將植物移到人工氣候室中放置2周。種植大約兩周后，形成的幼苗長(zhǎng)出4片真葉。然后用水、5mMSA、300μMBTH或300μMINA處理植物?；瘜W(xué)品以細(xì)霧的形式使用，用chromister完全覆蓋幼苗。將水對(duì)照植物放回到生長(zhǎng)人工氣候室中，用化學(xué)處理的植物放在一個(gè)單獨(dú)的但相同的人工氣候室中。施用化學(xué)品3天后，將用水和化學(xué)處理的植物用相容的Emwa分離物接種。僅僅在用水處理的植物上用Noco接種。接種后，將植物用透明塑料圓頂覆蓋以使保持寄生霜霉能夠成功感染的高濕度，并放置在一個(gè)生長(zhǎng)箱中，以白天19℃/夜間17℃和光照8小時(shí)/黑暗16小時(shí)進(jìn)行循環(huán)。從水或化學(xué)處理3天后的植物中，或從用相容性寄生霜霉Emwa分離物接種后的14天的植物中提取RNA。RNA用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行大小分級(jí)并轉(zhuǎn)移到GeneScreenPlus膜上(DuPont)。圖1-3給出了各種RNA凝膠斑點(diǎn)，表示SA、INA和BTH在nim1植物中既不誘導(dǎo)SAR也不誘導(dǎo)SAR基因表達(dá)。在圖1中，重復(fù)的點(diǎn)按照Uknes等，(1992)所述與擬南芥基因探針PR-1、PR-2和PR-5雜交。與野生型植物中的情況相反，化學(xué)品不能從nim1-1植物的這三個(gè)SAR基因的任何一個(gè)中誘導(dǎo)RNA積累。如在圖2中所示，感染病原體(Emwa)的野生型Ws-O植物在被感染后4天內(nèi)誘導(dǎo)PR-1基因表達(dá)。但是在nim1-1植物中，感染后直到6天PR-1基因才被誘導(dǎo)，而且其水平與同期的野生型相比也降低。因此病原體感染后，在nim1-1植物中PR-1基因表達(dá)被延遲并與野生型相比水平降低。圖3中的RNA凝膠斑點(diǎn)顯示野生型植物用SA、INA或BTH處理后或被寄生霜霉感染后，PR-1mRNA積累到高水平。在nim1-1、nim1-2、nim1-3植物中，PR-1mRNA的積累與用化學(xué)品處理后的野生型相比劇烈降低。用寄生霜霉感染后PR-1mRNA也降低，但是在這些突變型中仍有一定的積累。在nim1-4和nim1-6植物中，PR-1mRNA的積累與用化學(xué)品處理后的其它等位基因比降低更劇烈(長(zhǎng)期暴露更明顯)，并且用寄生霜霉感染后PR-1mRNA積累也明顯降低，支持了它們是強(qiáng)的nim1等位基因的觀點(diǎn)。PR-1mRNA的積累在nim1-5突變型中升高，但是被化學(xué)品處理或寄生霜霉感染后僅略微被誘導(dǎo)。根據(jù)PR-1mRNA的積累和真菌感染，突變型被確定分為三類受嚴(yán)重?fù)p害的等位基因(nim1-4和nim1-6)；受中等損害的等位基因(nim1-1、nim1-2和nim1-3)；以及受輕微損害的等位基因(nim1-5)。實(shí)施例5nim1植物中SA積累的檢測(cè)用引起壞死反應(yīng)的病原體感染野生型植物導(dǎo)致被感染組織中SA積累。內(nèi)源性SA是SAR途徑信號(hào)傳導(dǎo)所需的，因?yàn)閮?nèi)源性SA的降解導(dǎo)致抗病性降低。這表明SA的積累可作為SAR途徑中的標(biāo)記(Gaffney等，1993，科學(xué)261754-756)。nim1植物的表型表明SA的下游和SAR基因誘導(dǎo)的上游SAR途徑的一個(gè)成分被破壞。檢測(cè)了nim1植物被病原體感染后積累SA的能力。攜帶avrRpt2基因的丁香假單胞菌番茄菌株DC3000被注射到4周齡nim1植物的葉片中。2天后收獲葉片，按照Delaney等，1995，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)926602-6606中所述分析SA。分析表明nim1植物在被感染葉片中積累高水平的SA，如圖4所示。未受感染的葉片也積累SA，但未達(dá)到受感染葉片相同的水平，與在野生型擬南芥中觀察到的相似。這說(shuō)明nim突變位于信號(hào)傳導(dǎo)途徑中SA標(biāo)記的下游。而且，INA和BTH(在nim1植物中無(wú)活性)已經(jīng)表現(xiàn)出刺激SA下游的SAR途徑中的一個(gè)成分(Vernooij等，(1995)；Friedrich，等，(1996)；和Lawton，等，(1996))。另外，如上面所述，外源性使用的SA不能保護(hù)nim1植物免受Emwa的感染。實(shí)施例6遺傳分析為檢測(cè)表現(xiàn)nim1表型的多種突變型的顯性，將野生型植物的花粉轉(zhuǎn)移到nim1-1、-2、-3、-4、-5、-6的柱頭上。如果突變是顯性的，那么在產(chǎn)生的F1植物中會(huì)觀察到nim1表型。如果突變是隱性的，那么產(chǎn)生的F1植物將表現(xiàn)為野生型表型。表3中的數(shù)據(jù)說(shuō)明，當(dāng)nim1-1、-2、-3、-4和-6同野生型雜交時(shí)，產(chǎn)生的F1植物表型野生型。因此，這些突變是隱性的。相反，nim1-5×野生型的F1后代都表現(xiàn)出nim1表型，說(shuō)明這是一個(gè)顯性突變。用INA處理后，在野生型植物上沒(méi)有觀察到寄生霜霉孢子形成，而F1植物支持寄生霜霉的生長(zhǎng)和一些孢子形成。但是，這些F1植物中的nim1表型不及當(dāng)nim1-5為純合時(shí)觀察到的嚴(yán)重。為檢測(cè)等位性，將卡那霉素抗性nim1-1突變型植物的花粉轉(zhuǎn)移到nim1-2、-3、-4、-5、-6的柱頭上。將從雜交中產(chǎn)生的種子種植到含有25微克/毫升卡那霉素的Murashige-SkoogB5平板上以證明種子的雜交起源。將卡那霉素抗性(F1)植物轉(zhuǎn)移到土壤中并分析nim1表型。因?yàn)閚im1-5突變型與Ws野生型雜交的F1后代表現(xiàn)nim1表型，也進(jìn)行了對(duì)nim1-5×nim1-1的F2的分析。如表3所示，所有產(chǎn)生的F1植物表現(xiàn)nim1表型。因此，在nim1-2、-3、-4、-5、-6的突變未被nim1-1互補(bǔ)；這些植物都屬于相同的互補(bǔ)組，因此是等位基因。nim1-5×nim1-1雜交的F2代也表現(xiàn)nim1表型，證明了nim1-5是nim1-1的等位基因。表3nim突變型的遺傳分離表型突變型世代雌雄野生型anim1bnim1-1F1野生型cnim1-1240F29832nim1-2F1nim1-2野生型30nim1-3F1nim1-3野生型30nim1-4F1nim1-4野生型30nim1-5F1nim1-5野生型035F1野生型nim1-5018nim1-6F1nim1-6野生型30nim1-2F1nim1-2nim1-1015nim1-3F1nim1-3nin1-1010nim1-4F1nim1-4nim1-1015nim1-5F1nim1-5nim1-1014F2985nim1-6F1nim1-6nim1-1012aINA處理后PR-1mRNA的積累升高且無(wú)寄生霜霉的植物數(shù)目。bINA處理后沒(méi)有PR-1mRNA積累且有寄生霜霉的植物數(shù)目。c野生型指野生型Ws-O種B.nim1突變的作圖nim1突變的作圖在申請(qǐng)人于1996年12月27日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)08/773,559中有極詳細(xì)的描述，在此完整引入作為參考。實(shí)施例7NIM1座位中標(biāo)記物的鑒定及其遺傳作圖為測(cè)定NIM1的粗略圖譜位置，鑒定了來(lái)自nim1-1(Ws-O)和Landsbergerecta(Ler)雜交的74株nim植物對(duì)寄生霜霉的敏感性，和INA處理后缺乏PR-1mRNA積累的情況。利用簡(jiǎn)單序列長(zhǎng)度多態(tài)性(SSLP)標(biāo)記(Bell和Ecker1994)，nim1-1被確定位于染色體1的短臂上距nga128約8.2cM、距nga1118.2cM的位置。另外，nim1-1被確定位于nga111和距SSLP標(biāo)記ATHGENEA約4cM之間。(圖5A)為進(jìn)行精細(xì)結(jié)構(gòu)作圖，根據(jù)INA處理后不能積累PR-1mRNA的能力和支持真菌生長(zhǎng)的能力，鑒定了衍生自nim1-1和LerDP23雜交的F2群體中的1138株nim植物。從這些植物中提取DNA并在ATHGENEA和nga111處檢查接合性。如圖5A中所示，在ATHGENEA和nim1-1之間鑒定了93個(gè)重組子染色體，遺傳距離大約4.1cM(93比2276)，在nga111和nim1-1之間鑒定了239個(gè)重組子染色體，說(shuō)明遺傳距離約為10.5cM(239比2276)。在ATHGENEA和nga111的間隔之間具有信息的重組子進(jìn)一步用擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)分析(Vos等，1995)。ATHGENEA和nga111之間的AFLP標(biāo)記被鑒定并用于構(gòu)建該區(qū)域的低分辨率圖譜(圖5A和圖5B)。AFLP標(biāo)記W84.2(距nim1-11cM)和W85.1(距nim1-10.6cM)用于從CIC(Centred’EtudeduPolymorphismeHumain，INRA和CNRS)文庫(kù)(Creusot等，1995)中分離酵母人工染色體(YAC)克隆。2個(gè)YAC克隆CIC12H07和CIC12F04用W84.2標(biāo)記鑒定，2個(gè)YAC克隆CIC7E03和CIC10G07用W85.1標(biāo)記鑒定。(圖5B)為填補(bǔ)這兩套鄰近YAC克隆之間的間隔，細(xì)菌人工染色體(BAC)和與CIC12H07和CIC12F04部分重疊的P1克隆被分離并作圖，并進(jìn)行系列步行(Walking)步驟將BAC/P1毗連序列群向NIM1延伸(圖5C；Lin等，1995；Chio等，1995)。在步行中發(fā)展了針對(duì)BAC或P1克隆的新的AFLP，它們被用于測(cè)定NIM1是否被交叉。當(dāng)BAC和P1克隆被分離時(shí)NIM1被交叉，形成AFLP標(biāo)記L84.6a和L84.8。在P1克隆P1-18、P1-17和P1-21上發(fā)現(xiàn)的AFLP標(biāo)記L84.6a鑒定了三個(gè)重組子，而在P1克隆P1-20、P1-22、P1-23和P1-24上和BAC克隆BAC-04、BAC-05和BAC-06上發(fā)現(xiàn)的L84.8鑒定了1個(gè)重組子。因?yàn)檫@些克隆部分重疊形成大的毗連序列群(＞100kb)，并含有鄰近nim1的AFLP標(biāo)記，此基因被確定位于毗連序列群上。含有毗連序列群的BAC和P1克隆用于產(chǎn)生另外的AFLP標(biāo)記，說(shuō)明nim1位于L84.Y1和L84.8之間，代表了約0.09cM的間隔。C.NIM1基因的分離實(shí)施例8粘粒毗連序列群的構(gòu)建在土壤桿菌相容性T-DNA粘粒載體pCLD04541中利用從BAC-06、BAC-04和P1-18中用CsCl純化的DNA構(gòu)建了NIM1區(qū)域的粘粒文庫(kù)。將這三個(gè)克隆的DNA以等摩爾量混合并用限制酶Sau3A部分酶切。用蔗糖梯度分離20-25kb的片段，合并并用dATP和dGTP補(bǔ)齊(filledin)。質(zhì)粒pCLD04541用作T-DNA粘粒載體。這個(gè)質(zhì)粒含有一個(gè)寬宿主范圍的以pRK290為基礎(chǔ)的復(fù)制子、一個(gè)用于細(xì)菌選擇的四環(huán)素抗性基因和一個(gè)用于植物選擇的nptII基因。此載體用XhoI切割并用dCTP和dTTP補(bǔ)齊。然后將制備的片段連接到載體上。連接混合物經(jīng)包裝并導(dǎo)入大腸桿菌XL1-blueMR菌株(Stratagene)。通過(guò)用BAC04、BAC06和P1-18克隆雜交篩選產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化子，并分離陽(yáng)性克隆。從這些克隆中分離粘粒DNA，并用EcsEcoRI/MseI和HindIII/MseI制備模板DNA。分析產(chǎn)生的AFLP指紋類型以確定粘?？寺〉捻樞颉＿x出了交叉nim區(qū)域的一套15個(gè)半重疊的粘粒(圖5D)。粘粒DNA也用EcoRI、PstI、BssHII和SgrAI酶切。這使得能夠估計(jì)粘粒插入片段的大小，并且證實(shí)了通過(guò)AFLP指紋確定的各種粘粒之間的重疊。物理圖譜顯示L84.Y1和L84.8之間的物理距離為＞90kb，則遺傳圖譜與物理距離之比約等于每cM1兆堿基。為幫助鑒定NIM1基因，測(cè)定了BAC04的DNA序列。實(shí)施例9含NIM1基因的克隆的鑒定從交NIM1區(qū)域的克隆得到的粘粒通過(guò)三親交配接合轉(zhuǎn)移，利用輔助菌株HB101(pRK2013)轉(zhuǎn)移到根癌土壤桿菌AGL-1。這些粘粒用于通過(guò)真空滲透法(vacuuminfiltration)轉(zhuǎn)化卡那霉素敏感的nim1-1擬南芥品系(Bechtold等，1993；Mindrinos等，1994)。收獲被滲透植物的種子，使在GM瓊脂平板上發(fā)芽，GM瓊脂平板含50mg/ml卡那霉素作為選擇劑。只有被粘粒DNA轉(zhuǎn)化的小植物才能解除選擇劑的毒性并存活。在種板大約兩周后將存活下來(lái)的幼苗轉(zhuǎn)移到土壤中并按上述檢測(cè)nim1表型。不再具有nim1表型的轉(zhuǎn)化植物鑒定了含有功能性NIM1基因的粘粒。實(shí)施例10nim1表型的互補(bǔ)將轉(zhuǎn)移到土壤中的植物培養(yǎng)在人工氣候室中約1周。3000μMINA以細(xì)霧狀施用，采用chromister以完全覆蓋植物。2天后，收獲葉片提取RNA并進(jìn)行PR-1表達(dá)分析。植物然后再用寄生霜霉(Emwa分離物)噴霧并在一個(gè)生長(zhǎng)箱里在高濕度條件下培養(yǎng)，以白天19℃/夜間17℃和8小時(shí)光照/16小時(shí)黑暗為循環(huán)。真菌感染8到10天后，評(píng)價(jià)植物并檢查真菌生長(zhǎng)的陽(yáng)性或陰性。以同樣的方式處理Ws和nim1植物作為每次實(shí)驗(yàn)的對(duì)照。從收集的組織中用LiCl/酚提取緩沖液提取總RNA(Verwoerd，等，1989)。RNA樣品在甲醛瓊脂糖凝膠上電泳并轉(zhuǎn)移到GeneScreenPlus(DuPont)膜上。斑點(diǎn)用32P-標(biāo)記的PR-1cDNA探針雜交。將形成的斑點(diǎn)在膠片上曝光檢測(cè)哪個(gè)轉(zhuǎn)化子經(jīng)INA處理后能夠誘導(dǎo)PR-1表達(dá)。結(jié)果列于表4，顯示nim1表型被粘?？寺5、E1和D7互補(bǔ)。表4NA-不適用實(shí)施例11NIM1基因區(qū)測(cè)序用于序列分析的DNA來(lái)源于BAC04DNA(25微克，來(lái)自KeyGene)，因?yàn)檫@個(gè)BAC是完全包括與nim1突變型互補(bǔ)的該區(qū)域的克隆。將BAC04DNA在噴霧器(nebulizer)中隨機(jī)剪切形成平均長(zhǎng)度約2kb的片段。剪切片段的末端被修復(fù)并純化各片段。制備的DNA用EcoRV酶切的pBRKanF14(一種pBRK2nF1的衍生物(Bhat1993))連接。選擇產(chǎn)生的卡那霉素抗性克隆用于質(zhì)粒分離，采用WizardPlus9600微量制備系統(tǒng)(Promega)。采用染料終止子化學(xué)法(dyeterminatorchemistry)(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，F(xiàn)oster市，加拿大)將質(zhì)粒測(cè)序，使用設(shè)計(jì)的測(cè)序質(zhì)粒兩條鏈的引物(M13-21向前，T7向后，應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)。數(shù)據(jù)由ABI377DNA測(cè)序儀收集。將序列編輯并用Sequencher3.0(GeneCodes公司，AnnArbor，MI)組裝到毗連序列群中，Staden基因組組裝程序，phred，phrapandcrossmatch(PhilGreen，WanshingtonUniversity，St.Louis，MO)和consed(DavidGordon，WashingtonUniversity，St.Louis，MO)。粘粒中與nim1-1突變互補(bǔ)的DNA利用由Oligo5.0引物分析軟件(國(guó)家生物科學(xué)公司，Plymouth，MN)設(shè)計(jì)的引物測(cè)序。來(lái)自Ws-O和nim1等位基因的DNA和cDNA的測(cè)序基本上按照上述進(jìn)行。由粘粒E1和D7重疊確定的大約9.9kb的區(qū)域通過(guò)互補(bǔ)分析鑒定為含有nim1區(qū)。鄰近載體插入位點(diǎn)的和對(duì)粘粒骨架特異的引物由Olig5.0引物分析軟件(國(guó)家生物科學(xué)公司)設(shè)計(jì)。利用改進(jìn)的醋酸銨方法從粘粒D7和E1中分離DNA(Traynor，P.L.，1990。生物技術(shù)9(6)676)。此DNA直接用上述染料終止子化學(xué)法測(cè)序。得到的序列允許測(cè)定互補(bǔ)區(qū)的末端。由粘粒E1和D7重疊確定的區(qū)域表示為SEQIDNO1。還構(gòu)建了BamHI-EcoRV的被截短的版本，產(chǎn)生不含任何基因3區(qū)域的構(gòu)件(圖5D)。下列方法是必需的，因?yàn)樵贒NA的Bam-Spe區(qū)存在HindIII位點(diǎn)。BamHI-EcoRV構(gòu)件用SpeI完全酶切，然后分為兩個(gè)單獨(dú)的反應(yīng)進(jìn)行雙酶切。一份用BamHI酶切，另一份用HindIII酶切。從瓊脂糖凝膠(QiaQuick凝膠提取試劑盒)中分離了一個(gè)2816bp的BamHI-SpeI片段和1588bp的HindIII-Spel片段，并連接到用BamHI-HindIII酶切的pSGCG01。將DH5α用連接混合物轉(zhuǎn)化。通過(guò)用HindIII酶切，然后用WizardMagicMiniPreps(Promega)制備DNA篩選帶有正確插入的所得克隆。將一個(gè)含有正確構(gòu)件的克隆用電穿孔法導(dǎo)入土壤桿菌菌株GV3101用于轉(zhuǎn)化擬南芥植物。實(shí)施例12NIM1區(qū)的序列分析和亞克隆用Sequencer3.0和GCG軟件包分析含有NIM1基因的9.9kb區(qū)域是否在所有6個(gè)框中存在開(kāi)放閱讀框。4個(gè)含有大的開(kāi)放閱讀框的區(qū)域被鑒定為可能的基因(圖5D中的基因區(qū)域1-4)。從野生型親本和6個(gè)不同的nim1等位基因變種nim1-1、-2、-3、-4、-5和-6的DNA中用PCR擴(kuò)增這4個(gè)區(qū)。用于擴(kuò)增的引物是用Oligo5.0(國(guó)家生物科學(xué)公司)選擇并由整合DNA技術(shù)公司(IntegratedDNATechnologiesInc)合成的。PCR產(chǎn)物在1.0％瓊脂糖凝膠上分離，并用QIAquick凝膠提取試劑盒純化。純化的基因組PCR產(chǎn)物直接測(cè)序，其中采用起始擴(kuò)增所用的引物，以及另外設(shè)計(jì)的用于測(cè)序不被起始引物包含的任何序列的引物。這些基因區(qū)域的平均覆蓋率大約為3.5里茲(reads)/堿基。將序列用Sequencher3.0編輯并組裝。針對(duì)多種nim1等位基因的堿基改變被鑒定僅在命名為基因區(qū)2的區(qū)域，如下面表5所示，表示在所有6個(gè)nim1等位基因中的序列變化。表5<p>很明顯NIM1基因位于基因區(qū)2中，因?yàn)樵谒?個(gè)nim1等位基因中的基因區(qū)2之開(kāi)放閱讀框中發(fā)生了氨基酸改變或序列變化。同時(shí)，至少一個(gè)nim1等位基因在基因區(qū)1、3和4的開(kāi)放閱讀框中沒(méi)有顯示改變。因此，在9.9kb區(qū)域中含有NIM1基因的唯一的基因區(qū)是基因區(qū)2。表5中的Ws部分顯示擬南芥的Ws生態(tài)型相對(duì)于擬南芥的哥倫比亞生態(tài)型的變化。此處列出的序列對(duì)應(yīng)于擬南芥的哥倫比亞生態(tài)型，在此處所述的實(shí)驗(yàn)中其含有野生型基因。列出的變化是基因區(qū)2(NIM1區(qū))的氨基酸的變化以及在其它區(qū)的堿基對(duì)的變化。含有nim1基因的粘粒區(qū)被表示為～5.3kb的BamHI-EcoRV限制片段。.D7的粘粒DNA和pBlueScriptII(pBSII)的質(zhì)粒DNA用BamHI和用EcoRV(NEB)酶切。從瓊脂糖凝膠中分離了D7的5.3kb片段并利用QIAquick凝膠提取試劑盒(#28796，Qiagen)純化。將此片段過(guò)夜連接到以BamHI-EcoRV酶切的pBSII，并將連接混合物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株DH5α。選擇含有插入片段的克隆，分離DNA，并用HindIII酶切加以驗(yàn)證。再將BamHI-EcoRV片段導(dǎo)入雙元載體(pSGCG01)用于轉(zhuǎn)化擬南芥。實(shí)施例13四個(gè)基因區(qū)的Northern分析從分離自如前面Delaney，等(1995)中所述的用水、SA、BTH、和INA處理的Ws和nim1品系的RNA樣品中制作相同的Northern印跡。這些印跡與從9.9kbNIM1基因區(qū)(SEQIDNO1)上鑒定的四個(gè)基因區(qū)形成的PCR產(chǎn)物雜交。只有含有NIM1基因(基因區(qū)2)的基因區(qū)具有與RNA樣品可檢測(cè)的雜交，說(shuō)明只有NIM1含有可檢測(cè)的轉(zhuǎn)錄基因(圖5D和表5)。實(shí)施例14與基因區(qū)2互補(bǔ)通過(guò)進(jìn)行另外的互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)基因區(qū)2(圖5D)還含有功能性NIM1基因。含有基因區(qū)2的BamHI/HindIII基因組DNA片段分離自粘粒D7，并被克隆到含有卡那霉素抗性基因的雙元載體pSGCG01。產(chǎn)生的質(zhì)粒被轉(zhuǎn)化到土壤桿菌菌株GV3101，在卡那霉素上選擇陽(yáng)性克隆。PCR用于證明選出的克隆含有質(zhì)粒。卡那霉素敏感的nim1-1植物用這種細(xì)菌按前述進(jìn)行滲透。收獲產(chǎn)生的種子并種到含有50μg/ml卡那霉素的GM瓊脂板上。將經(jīng)選擇存活下來(lái)的植物轉(zhuǎn)移到土壤中并檢測(cè)互補(bǔ)性。被轉(zhuǎn)化的植物和對(duì)照Ws及nim1植物用300μMINA噴霧。2天后，收獲葉片提取RNA并分析PR-1表達(dá)。這些植物再用寄生霜霉(Emwa分離物)噴霧，并如前述加以培養(yǎng)。真菌感染10天后，評(píng)價(jià)植物并檢查真菌生長(zhǎng)陽(yáng)性或陰性。所有15個(gè)轉(zhuǎn)化植物以及Ws對(duì)照經(jīng)INA處理后真菌生長(zhǎng)均為陰性，而nim1對(duì)照真菌生長(zhǎng)陽(yáng)性。如上述提取這些轉(zhuǎn)化子和對(duì)照的RNA并分析。Ws對(duì)照和所有15個(gè)轉(zhuǎn)化子經(jīng)INA處理后表現(xiàn)出PR-1基因被誘導(dǎo)，而nim1對(duì)照未表現(xiàn)出被INA誘導(dǎo)。實(shí)施例15NIM1cDNA的分離將在IYES表達(dá)載體中構(gòu)建的擬南芥cDNA文庫(kù)(Elledge等，1991，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)88，1731-1735)涂布并制備噬菌斑等位濾膜。將濾膜用從基因區(qū)2(圖5D)形成的32P標(biāo)記的PCR產(chǎn)物雜交。從大約150000個(gè)噬菌斑中鑒定了14個(gè)陽(yáng)性噬菌斑。將每個(gè)噬菌斑純化，回收質(zhì)粒DNA。將插入的cDNA用EcoRI從載體上切下來(lái)，瓊脂糖凝膠純化并測(cè)序。從最長(zhǎng)的cDNA得到的序列表示在SEQIDNO2和圖6中。為了證實(shí)得到了cDNA的5’末端，根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明使用GibcoBRL5’RACE試劑盒。產(chǎn)生的RACE產(chǎn)物被測(cè)序并發(fā)現(xiàn)含有圖6中所示的額外的堿基。存在于cDNA克隆中的轉(zhuǎn)錄區(qū)和在RACE中檢測(cè)到的轉(zhuǎn)錄區(qū)在圖6中以大寫字母表示。等位基因中的改變表示在DNA鏈的上面。大寫字母表示存在cDNA克隆中的或經(jīng)RACEPCR后檢測(cè)到的序列。在誘導(dǎo)研究(圖3)中產(chǎn)生的相同的RNA樣品也利用全長(zhǎng)cDNA克隆為探針用NIM1基因進(jìn)行探查。在圖7中可以看出INA誘導(dǎo)了野生型Ws等位基因中的NIM1基因。然而，nim1-1突變等位基因顯示較低的本底水平的NIM1基因表達(dá)，并且它不能被INA誘導(dǎo)。這與在nim1-3等位基因和nim1-6等位基因中觀察到的相似。nim1-2等位基因在未處理的樣品中顯示大約正常水平的表達(dá)，并且顯示與野生型樣品相似的誘導(dǎo)，就象nim1-4等位基因那樣。nim1-5等位基因似乎表現(xiàn)出較高本底水平的NIM1基因表達(dá)，并且被化學(xué)誘導(dǎo)物誘導(dǎo)時(shí)表現(xiàn)出更強(qiáng)的表達(dá)。D.NIM1同系物實(shí)施例16用NIM1序列進(jìn)行搜索利用ClustalV構(gòu)建了一個(gè)多重序列比較(Higgins，DesmondG.和PaulM.Sharp(1989)，微型計(jì)算機(jī)上的快速和靈敏的多重序列比較，CABIOS5151-153)作為部分DNA*(1228SouthParkStreet，MadisonWisconsin，53715)基于Macintosh的激光基因生物計(jì)算軟件包(1994)。NIM1蛋白的某些區(qū)域的氨基酸序列與4種不同水稻cDNA蛋白質(zhì)產(chǎn)物是同源的。同源性用GeneBankBLAST搜索中的NIM1序列進(jìn)行鑒定。NIM1和水稻cDNA產(chǎn)物的同源區(qū)的比較示于圖8(另參閱，SEQIDNO3和SEQIDNO4-11)。NIM1蛋白片段與4種水稻產(chǎn)物具有36％至48％的相同的氨基酸序列。實(shí)施例17從其它植物中分離同源基因利用NIM1cDNA作探針，通過(guò)從不同作物中篩選基因組或cDNA文庫(kù)鑒定了擬南芥NIM1基因的同系物，其中不同的作物例如但并不限于在下面的實(shí)施例22中列出的那些。完成這種任務(wù)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)包括雜交篩選涂布的DNA文庫(kù)(或是噬菌斑或是菌落；參閱，例如，Sambrook等，分子克隆，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，(1989))以及用寡核苷酸引物通過(guò)PCR擴(kuò)增(參閱，例如Innis等，《PCR技術(shù)方法與應(yīng)用指南》，學(xué)院出版社(1990))。鑒定的同源區(qū)通過(guò)遺傳工程導(dǎo)入此處的表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化到上面列出的作物中。利用所檢測(cè)作物的相關(guān)病原體評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)化子增強(qiáng)的抗病性。在黃瓜、番茄、煙草、玉米、小麥和大麥基因組中的NIM1同源區(qū)已通過(guò)DNA印跡分析檢測(cè)。從黃瓜、番茄、煙草、玉米、小麥和大麥中分離基因組DNA，用限制酶BamHI、HindIII、XbaI或SalI酶切，在0.8％瓊脂糖凝膠上電泳分離并通過(guò)毛細(xì)印跡轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。通過(guò)紫外交聯(lián)結(jié)合DNA后，將膜在低度嚴(yán)格條件下[(1％BSA；520mMNaPO4，pH7.2；7％十二烷基硫酸鈉；1mMEDTA；250mMNaCl)，55℃雜交18-24小時(shí)]與32P標(biāo)記的擬南芥NIM1cDNA雜交。雜交后將印跡在低度嚴(yán)格條件下洗滌(55℃下在6×SSC中洗3次，每次15分鐘，在3×SSC中洗1次，15分鐘；1×SSC是0.15MNaCl、15mM檸檬酸鈉(pH7.0)，在X光膠片上曝光使相應(yīng)于NIM1的帶顯見(jiàn)出來(lái)。另外，利用與NIM1基因的相似性鑒定的表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)，例如在實(shí)施例16中描述的水稻EST，可以用于分離同系物。水稻的EST在從其它單子葉植物中分離NIM1同系物方面可能特別有用。同系物可以通過(guò)PCR得到。在這個(gè)方法中，在已知的同系物之間作比較(例如水稻和擬南芥)。氨基酸和DNA相似性高或相同性高的區(qū)域用于制備PCR引物。富含甲硫氨酸和色氨酸的區(qū)域后面最好緊隨富含苯丙氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、組氨酸、谷氨酰胺、賴氨酸和谷氨酸的區(qū)域，因?yàn)檫@些氨基酸是由有限數(shù)目的密碼子編碼的。一旦一個(gè)合適的區(qū)域被鑒定，通過(guò)在第三位密碼子位點(diǎn)引入不同的替換制備用于該區(qū)域的引物。在第三位點(diǎn)的不同的替換可能受到作為目標(biāo)的區(qū)域種類的限制。例如，玉米是富含GC的，如果可能的話設(shè)計(jì)的引物在第三個(gè)位點(diǎn)采用一個(gè)G或是一個(gè)C。在多種不同的標(biāo)準(zhǔn)條件下，從cDNA或基因組DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)。當(dāng)顯示出來(lái)一條帶時(shí)，將它克隆和/或測(cè)序以檢測(cè)它是否是NIM1同系物。E.NIM1過(guò)量表達(dá)賦予植物抗病性在轉(zhuǎn)基因植物中NIM1基因過(guò)量表達(dá)賦予植物CIM表型也在申請(qǐng)人于1996年12月27日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)08/773,554中有描述，在此完整引入作為參考。實(shí)施例18由于插入位點(diǎn)效應(yīng)引起的NIM1的過(guò)量表達(dá)為檢測(cè)是否上述實(shí)施例10/表4中的任何轉(zhuǎn)化子都由于插入位點(diǎn)效應(yīng)過(guò)量表達(dá)NIM1基因，將含有D7、D5或E1粘粒(含有NIM1基因)的初級(jí)轉(zhuǎn)化子自交并收集T2種子。來(lái)自一個(gè)E1種系、4個(gè)DS種系和95個(gè)D7種系的種子播種于土壤中，如上所述生長(zhǎng)。當(dāng)T2植物長(zhǎng)到至少4片真葉時(shí)，從每一株植物上分別單獨(dú)收獲一片葉子。從該組織中提取RNA并進(jìn)行PR-1和NIM1表達(dá)分析。然后用寄生霜霉(Emwa)接種植物，在感染后3-14天，優(yōu)選地7-12天分析真菌生長(zhǎng)。表現(xiàn)高于正常的NIM1和PR-1表達(dá)水平并顯示真菌抗性的植物說(shuō)明NIM1的過(guò)量表達(dá)賦予了CIM表型。表6顯示檢測(cè)多種轉(zhuǎn)化子對(duì)真菌感染的抗性的結(jié)果。從表中可以看出，許多轉(zhuǎn)化子表現(xiàn)出低于正常水平的真菌生長(zhǎng)，并且有幾株根本沒(méi)有可見(jiàn)的真菌生長(zhǎng)。從收集的樣品中制備RNA并如前述加以分析(Delaney等，1995)。品系D7-74、D5-6和E1-1表現(xiàn)PR-1基因表達(dá)的早期誘導(dǎo)，而真菌處理后24或48小時(shí)可見(jiàn)PR-1mRNA的出現(xiàn)。這三個(gè)品系還表現(xiàn)出對(duì)真菌感染的抗性。表6>植物用寄生霜霉Emwa分離物感染并在10天后檢查+，正常真菌生長(zhǎng)+/-，低于正常的真菌生長(zhǎng)陰性，無(wú)可見(jiàn)真菌生長(zhǎng)實(shí)施例19在自身啟動(dòng)子控制下的NIM1過(guò)量表達(dá)組成型表達(dá)NIM1基因的植物是從用BamHI-HindIIINIM1基因組片段(SEQIDNO2-堿基1249-5655)轉(zhuǎn)化的Ws野生型植物中得到的，該片段含有1.4kb的啟動(dòng)子序列。將此片段克隆到pSGCG01并轉(zhuǎn)化到土壤桿菌菌株GV3101(pMP90，Koncz和Schell(1986)，分子基因遺傳學(xué)204383-396)。Ws植物如前述滲透。收集產(chǎn)生的種子并種到含50μg/ml卡那霉素的GM瓊脂上。將存活下來(lái)的幼苗轉(zhuǎn)移到土壤中并如上述檢測(cè)對(duì)寄生霜霉Emwa分離物的抗性.將選擇出的植物自交并進(jìn)行隨后兩代選擇以形成純合系。將幾株這些純合系的種子播到土壤中，每個(gè)品系15-18株，生長(zhǎng)三周，再次檢測(cè)對(duì)Emwa的抗性，此前不用誘導(dǎo)化學(xué)品作任何處理。真菌處理后大約24小時(shí)、48小時(shí)和5天后，收集組織，合并并冷凍每個(gè)品系。接種后將植物在生長(zhǎng)箱中保持10天，然后檢查對(duì)Emwa的抗性。從所有收集的樣品中制備RNA并如前述加以分析(Delaney等，1995)。將斑點(diǎn)與擬南芥基因探針PR-1雜交(Uknes等，1992)。13個(gè)轉(zhuǎn)基因品系中的5個(gè)經(jīng)分析顯示PR1基因表達(dá)的早期誘導(dǎo)。對(duì)于這些品系，被真菌處理后24或48顯示出現(xiàn)PR-1mRNA。并且這5個(gè)品系沒(méi)有可見(jiàn)的真菌生長(zhǎng)。葉片如前述用乳酚藍(lán)染色(Dietrich等，1994)以證實(shí)在葉片中沒(méi)有真菌菌絲。在其它8個(gè)品系中48小時(shí)后PR-1基因表達(dá)沒(méi)有被誘導(dǎo)，且這些植物不表現(xiàn)對(duì)Emwa的抗性。還檢測(cè)了抗性品系的一個(gè)亞組對(duì)細(xì)菌病原體丁香假單胞菌DC3000的增強(qiáng)的抗性，以評(píng)價(jià)如Uknes等(1993)描述的抗性譜。實(shí)驗(yàn)基本上按照Lawton等(1996)所述進(jìn)行。在對(duì)Emwa表現(xiàn)組成型抗性的這些品系中細(xì)菌的生長(zhǎng)也較慢。這說(shuō)明在自身啟動(dòng)子控制下過(guò)量表達(dá)NIM1基因的植物有針對(duì)病原體基因的組成型免疫。為評(píng)價(jià)在這些品系中CIM表型的另外特征，評(píng)價(jià)未感染的植物中游離的水楊酸和結(jié)合葡萄糖的水楊酸，葉片用乳酚藍(lán)染色以評(píng)價(jià)微觀病斑的存在。抗性植物與SAR突變型如NahG和ndr1進(jìn)行有性雜交以建立抗性表型對(duì)其它突變型的上位關(guān)系，并評(píng)價(jià)NIM1的這些顯性負(fù)性突變型是如何影響依賴水楊酸的反饋環(huán)的。實(shí)施例2035S驅(qū)動(dòng)的NIM1的過(guò)量表達(dá)將全長(zhǎng)的NIM1cDNA(SEQIDNO21)克隆到pCGN1761ENX的EcoRI位點(diǎn)(Comai等，(1990)植物分子生物學(xué)15，373-381)。從產(chǎn)生的質(zhì)粒中得到一個(gè)含有增強(qiáng)CaMV35S啟動(dòng)子的XbaI片段、處于正確轉(zhuǎn)錄方向的NIM1cDNA和一個(gè)tml3’終止子。將此片段克隆到雙元載體pCIB200并轉(zhuǎn)化到GV3101。Ws植物按前述進(jìn)行滲透轉(zhuǎn)化。收集產(chǎn)生的種子并種到含50μg/ml卡那霉素的GM瓊脂上。將存活下來(lái)的幼苗轉(zhuǎn)移到土壤中并如上述加以檢測(cè)。將選擇出的植物自交并進(jìn)行隨后兩代選擇以形成純合系。測(cè)試的58個(gè)品系中的9個(gè)經(jīng)Emwa處理后表現(xiàn)出抗性，Emwa處理前沒(méi)有進(jìn)行化學(xué)品處理。因此，NIM1cDNA的過(guò)量表達(dá)也導(dǎo)致了抗病性植物。實(shí)施例21在作物類植物中高水平表達(dá)NIM1將那些賦予Col-0或Ws-0以及其它作物CIM表型的構(gòu)件轉(zhuǎn)化到作物類植物中進(jìn)行評(píng)價(jià)。盡管NIM1基因可以被插入到屬于這些種類廣泛的任何植物細(xì)胞中，它在作物類植物中特別有用，例如水稻、小麥、大麥、黑麥、玉米、馬鈴薯、胡蘿卜、甜馬鈴薯、甜菜、菜豆、豌豆、菊苣、萵苣、白菜、花椰菜、花莖甘藍(lán)、蕪菁、蘿卜、菠菜、蘆筍、洋蔥、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、胡蘿卜、南瓜、西葫蘆、小西葫蘆、黃瓜、蘋果、梨、溫孛、甜瓜、李子、櫻桃、桃、蜜桃、杏、草莓、葡萄、覆盆子、黑莓、鳳梨、鱷梨、番木瓜樹(shù)、芒果、香蕉、大豆、煙草、番茄、高粱和甘蔗。評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)化子增強(qiáng)的抗病性。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，NIM1基因的表達(dá)水平至少是野生型植物的NIM1基因表達(dá)水平的兩倍以上，優(yōu)選地是野生型表達(dá)水平的10倍以上。F.通常nim表型植物的其它應(yīng)用實(shí)施例22nim突變型在病害檢測(cè)上的應(yīng)用nim突變型用多種病原體侵襲，發(fā)現(xiàn)形成比野生型植物更大更快的病斑。這種表型稱為UDS(即廣泛病害敏感性)，這是突變型不能表達(dá)SAR基因影響植物對(duì)病原體防衛(wèi)的結(jié)果。nim突變型的UDS表型使它們可以被用作對(duì)照植物用于評(píng)價(jià)田間病原體實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)品系之病癥，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)中所謂的野生型品系的天然抗性表型可能各不相同(即抵抗不同病原體或?qū)ο嗤≡w的不同病變型)。因此，依賴病原體自然感染的田間環(huán)境評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)品系的抗性，適當(dāng)?shù)淖魑镱愔参锲贩N的nim突變系實(shí)驗(yàn)的引入使之能夠評(píng)價(jià)病原體壓力的真實(shí)水平和病害譜，而不會(huì)有使用非實(shí)驗(yàn)品系的內(nèi)在差異。實(shí)施例23轉(zhuǎn)基因用于抗病性的實(shí)用性評(píng)價(jià)將nim突變型作為轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化的宿主植物以幫助評(píng)價(jià)它們?cè)诳共⌒陨系膽?yīng)用。例如，以其UDS表型為特征的一個(gè)擬南芥nim突變型品系，用于經(jīng)抗病性候選基因的轉(zhuǎn)化從而使之能夠評(píng)價(jià)一個(gè)單獨(dú)基因?qū)Φ挚贡镜姿降腢DSnim突變型植物的貢獻(xiàn)。實(shí)施例24；nim突變型作為理解植物-病原體相互作用的工具nim突變型有助于理解植物與病原體的相互作用，特別是用于理解被病原體用來(lái)侵入植物細(xì)胞的過(guò)程。這是由于nim突變型不能對(duì)病原體的進(jìn)攻產(chǎn)生系統(tǒng)性反應(yīng)，而且病原體的不減弱的發(fā)生是研究病原體與宿主生物學(xué)相互作用的理想的方案。更重要的是觀察到宿主nim突變型植物可能對(duì)通常與該宿主結(jié)合而與不同宿主結(jié)合的病原體變得敏感。例如，一種擬南芥nim突變型如nim1-1、-2、-3、4、-5或-6受到通常只感染煙草的一系列病原體的進(jìn)攻，并且發(fā)現(xiàn)其對(duì)它們敏感。因此，引起UDS表型的nim突變型導(dǎo)致病原體范圍敏感性改變，這在宿主與病原體相互作用的分子、遺傳和生化分析方面具有重要應(yīng)用。實(shí)施例25nim突變型用于殺真菌劑篩選nim突變型在篩選具有殺真菌劑活性的新化學(xué)化合物上特別有用。在特定宿主中選擇的nim突變型對(duì)于利用該宿主及其病原體篩選殺真菌劑上具有相當(dāng)?shù)挠猛?。其?yōu)越性在于突變型的UDS表型克服了宿主對(duì)不同病原體和病變型具有不同敏感性的問(wèn)題，或者甚至對(duì)一些病原體或病變型具抗性的問(wèn)題。以舉例的方式，小麥中的nim突變型可有效用于殺真菌劑的篩選，用于多種小麥病原體和病變型，因?yàn)橥蛔冃筒荒軐?duì)引入的病原體產(chǎn)生抗性反應(yīng)，故不能對(duì)不同的病變型產(chǎn)生不同的抗性，否則就需要使用多個(gè)小麥品系，其中每一個(gè)都對(duì)特定的供試病原體足夠敏感。具有特殊興趣的小麥病原體包括(但并不限于)禾白粉菌(Erisyphegraminis)(霜霉病的致病菌)，立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)(尖眼點(diǎn)病(sharpeyespot)的致病菌)，假尾孢菌(Pseudocercosporellaherpotrichoides)(眼點(diǎn)病的致病菌)，銹病菌(Pucciniaspp.)(銹病的致病菌)和潁枯殼針孢(Septorianodorum)。相似地，玉米的nim突變型可能對(duì)玉米病原體高度敏感，因此可用于篩選針對(duì)玉米病害具有活性的殺真菌劑中。nim突變型更可用于從異源宿主中篩選多種病原體和病變型，即通常不屬于特定病原體的宿主種類范圍，并且特別容易操作的宿主(例如擬南芥)中。由于其UDS表型，異源宿主對(duì)其它植物品種的病原體敏感，包括重要的經(jīng)濟(jì)作物品種。因此，例如，相同的擬南芥nim突變型可用小麥病原體如禾白粉菌(霜霉病的致病菌)或玉米病原體如玉蜀黍長(zhǎng)蠕孢(Helminthosporiummaydis)感染，并用于檢測(cè)候選殺真菌劑的效果。這種方法的效果在最近用于篩選個(gè)體作物品種和具有不同病原體和病變型之不同品種的過(guò)程中有了相當(dāng)大的提高，不同的病原體和病變型對(duì)不同的作物品種具有不同的毒性。而且，擬南芥的應(yīng)用具有優(yōu)越性，因?yàn)樗w積小，因此可利用有限的空間資源進(jìn)行更多的實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例26NIM1是IκBα的同系物進(jìn)行NIM1和IκB的蛋白基因產(chǎn)物之間的多重序列比較，據(jù)此確定NIM1基因產(chǎn)物是IκBα的同系物(圖9)。利用BLAST進(jìn)行序列同源性搜索(Altschul等，分子生物學(xué)雜志215403-410(1990))。利用ClustalV(Higgins等，CABIOS5，151-153(1989))建立多重序列比較，ClustalV是DNASTAR的激光基因生物計(jì)算軟件包的一部分(Madison，WI)。在比較中使用的序列是NIM1(SEQIDNO3)、小鼠IκBα(SEQIDNO18，GeneBank保藏號(hào)1022734)，大鼠IκBα(SEQIDNO19，GeneBank保藏號(hào)57674和X63594；Tewari等，核酸研究20，607(1992))和豬IκBα(SEQIDNO20；GeneBank保藏號(hào)Z21968；deMartin等，EMBOJ.12，2773-2779(1993))；GeneBank保藏號(hào)517193，deMartin等，基因152，253-255(1995))。用于Clustal分析的參數(shù)是罰區(qū)間10和罰區(qū)間長(zhǎng)度10。用PAM250權(quán)重表(weighttable)計(jì)算進(jìn)化分歧距離(Dayhoff等，“蛋白質(zhì)中的進(jìn)化變化模型，檢測(cè)距離關(guān)系的矩陣”，《蛋白質(zhì)序列與結(jié)構(gòu)圖集》，第5期，增刊3，M.O.，Dayhoff，編(國(guó)家醫(yī)學(xué)研究基金會(huì)，華盛頓，D.C.)，第345-358頁(yè)(1978))。殘基的相似性用改進(jìn)的Dayhoff表計(jì)算(Schwartz和Dayhoff，“蛋白質(zhì)進(jìn)化變化模型”，《蛋白質(zhì)序列與結(jié)構(gòu)圖集》，M.O.，Dayhoff，編(國(guó)家醫(yī)學(xué)研究基金會(huì)，華盛頓，D.C.)，第353-358頁(yè)(1979))；Gribskov和Burgess，核酸研究14，6745-6763(1986))。同源性搜索顯示NIM1與幾種蛋白質(zhì)的錨蛋白結(jié)構(gòu)域相似，包括錨蛋白、NF-κB和IκB。對(duì)IκB及其相關(guān)分子具有最完全的同源性(圖9)。NIM1在氨基酸位點(diǎn)55和59含有兩個(gè)絲氨酸，位點(diǎn)59的絲氨酸處于序列(D/E×××××S)和位點(diǎn)(N-末端)中，其作用與依賴于磷酸化的、遍在蛋白質(zhì)介導(dǎo)的可誘導(dǎo)降解的角色相符。所有IκB都具有這些N-末端絲氨酸并且它們是IκB失活及隨后釋放NF-IκBα所需的。NIM1具有錨蛋白結(jié)構(gòu)域(氨基酸262-290和323-371)。據(jù)信錨蛋白參與蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，并且是IκB和NF-κB分子遍在蛋白質(zhì)化的特征。IκB的C-末端可以是不同的。在一些IκB的C-末端發(fā)現(xiàn)NIM1與富含QL的區(qū)域有一些同源性(氨基酸491-499)。實(shí)施例27NIM1變形體的形成-將絲氨酸殘基55和59變成丙氨酸殘基人IκBα中絲氨酸殘基的磷酸化是IκBα的刺激激活降解所需的并籍此活化NF-κB。在人IκBα中絲氨酸殘基(S32-S36)突變形成丙氨酸殘基，抑制了由刺激誘導(dǎo)的磷酸化，因而阻斷了IκBα蛋白體介導(dǎo)的降解(E.Britta-MareenTraenckner等，EMBOJ.142876-2883(1995)；Brown等，科學(xué)2671485-1488(1996)；Brockman等，分子和細(xì)胞生物學(xué)152809-2818(1995))；Wang等，科學(xué)274784-787(1996))。這個(gè)IκBα變形體作為一種顯性負(fù)性形式使NF-κB保留在胞質(zhì)中，從而阻斷下游信號(hào)傳導(dǎo)。根據(jù)NIM1和IκB序列的比較，NIM1的絲氨酸55(S55)和59(S59)與人IκBα的S32和S36同源。為建立NIM1的顯性-負(fù)性形式，將在氨基酸位點(diǎn)55和59的絲氨酸誘變成丙氨酸殘基。這可以通過(guò)任何為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所知道的方法進(jìn)行，例如，使用QuikChange定點(diǎn)突變盒(#200518Strategene)。使用含有42bp5’非翻譯序列(UTR)和187bp3’UTR的全長(zhǎng)NIM1cDNA(SEQIDNO21)，采用下列引物按照生產(chǎn)商的說(shuō)明可以得到突變的構(gòu)件(SEQIDNO21，位點(diǎn)192-226)5’-CAACAGCTTCGAAGCCGTCTTTGACGCGCCGGATG-3’(SEQIDNO32)和5’-CATCCGGCGCGTCAAAGACGGCTTCGAAGCTGTTG-3’(SEQIDNO33)，其中有下劃線的堿基表示突變。策略如下將克隆至載體pSE936(Elledge等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)881731-1735(1991))的NIM1cDNA變性，將含有改變的堿基引物退火。DNA聚合酶(Pfu)通過(guò)非鏈置換延伸引物產(chǎn)生有缺刻的環(huán)狀鏈。DNA用只切甲基化位點(diǎn)(非突變的模板DNA)的DpnI限制性內(nèi)切酶酶切。保留的環(huán)狀雙鏈DNA轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株XL1-Blue。從形成的克隆中提取質(zhì)粒并測(cè)序以證明突變堿基的存在和證實(shí)沒(méi)有發(fā)生其它突變。用限制性內(nèi)切核酸酶EcoRI酶切突變的NIM1cDNA并克隆到pCGN1761中，其受花椰菜花葉病毒的雙35S啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。含有35S啟動(dòng)子、NIM1cDNA和tml終止子的轉(zhuǎn)化盒是通過(guò)XbaI部分限制性酶切從pCGN1761中釋放下來(lái)的，并將它連接到去磷酸化的pCIB200的XbaI位點(diǎn)。SEQIDNO22和23分別表示這個(gè)NIM1基因變形體的DNA編碼序列和所編碼的氨基酸序列。本發(fā)明還包括NIM1等位基因的變形體，其中這樣一個(gè)等位基因的編碼序列在下列條件下與SEQIDNO22中的編碼序列雜交在1％BSA；520mMNaPO4，pH7.2；7％十二烷基硫酸鈉；1mMEDTA；250mMNaCl，55℃雜交18-24小時(shí)，55℃下在6×SSC中洗3次，每次15分鐘，在3×SSC中洗1次15分鐘。在這些實(shí)施方案中，在這些條件下與SEQIDNO22雜交的NIM1等位基因被改變，使得編碼產(chǎn)物在相應(yīng)于SEQIDNO22的位點(diǎn)55和59的氨基酸位點(diǎn)上的絲氨酸變成丙氨酸。.實(shí)施例28形成NIM1變形體-N-端缺失人IκBα含有K21、K22、S32和S36，其中氨基酸1-36(Brockman等；Sun等)或1-72(Sun等)的缺失導(dǎo)致在被轉(zhuǎn)染的人細(xì)胞培養(yǎng)物中的顯性-負(fù)性IκBα表型。NIM1cDNA編碼產(chǎn)物的大約前125個(gè)氨基酸的N-末端缺失去除了可作為潛在遍在蛋白質(zhì)化位點(diǎn)的8個(gè)賴氨酸殘基，還去除了在S55和S59的推斷的磷酸化位點(diǎn)(見(jiàn)實(shí)施例2)。這種改變的基因構(gòu)件可通過(guò)任何為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的方法產(chǎn)生。例如，利用Ho等，基因7751-59(1989)的方法，可以產(chǎn)生一種NIM1形式，其中編碼大約前125個(gè)氨基酸的DNA被刪除了。下列引物產(chǎn)生一個(gè)1612-bp的PCR產(chǎn)物(SEQIDNO21418-2011)5’-ggaattca-ATGGATTCGGTTGTGACTGTTTTG-3’(SEQIDNO34)和5’-ggaattcTACAAATCTGTATACCATTGG-3’(SEQIDNO35)，其中合成的起始密碼子加下劃線(ATG)，EcoRI銜接物序列為小寫字母。利用一反應(yīng)混合物擴(kuò)增片段，其中含有0.1-100ng模板DNA，10mMTrispH8.3/50mMKCl/2mMMgCl2/0.001％明膠/0.25mM各種dNTP/0.20mM每個(gè)引物和1個(gè)單位的rTthDNA聚合酶，終體積為50μL，使用PerkinElmerCetus9600PCR儀。PCR的條件如下94℃3分鐘35×(94℃30秒52℃1分鐘72℃2分鐘)72℃10分鐘。PCR產(chǎn)物被直接克隆到pCR2.1載體(Invitrogen)。由PCR形成的PCR載體上的插入片段通過(guò)EcoRI限制性內(nèi)切酶酶切被釋放，并連接到去磷酸化的pCGN1761的EcoRI位點(diǎn)，其受雙35S啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。將構(gòu)件測(cè)序以證明合成的起始ATG的存在，并證實(shí)在PCR過(guò)程中沒(méi)有發(fā)生其它突變。含有35S啟動(dòng)子、改造的NIM1cDNA和tml終止子的轉(zhuǎn)化盒是通過(guò)XbaI部分限制性酶切從pCGN1761ENX中釋放下來(lái)的，并將它連接到pCIB200的XbaI位點(diǎn)。SEQIDNO24和25分別表示具有N-末端氨基酸缺失的NIM1基因變形體的DNA編碼序列和所編碼的氨基酸序列。本發(fā)明還包括NIM1等位基因的變形體，其中這樣一個(gè)等位基因的編碼序列在下列條件下與SEQIDNO24中所示的編碼序列雜交在1％BSA；520mMNaPO4，pH7.2；7％十二烷基硫酸鈉；1mMEDTA；250mMNaCl，55℃雜交18-24小時(shí)，55℃下在6×SSC中洗3次，每次15分鐘，在3×SSC中洗1次，15分鐘。在這些實(shí)施方案中，在這些條件下與SEQIDNO24雜交的NIM1的等位基因被改變，使得編碼產(chǎn)物的N-末端缺失，去除了可作為潛在遍在蛋白質(zhì)化位點(diǎn)的賴氨酸殘基，以及在相應(yīng)于野生型基因產(chǎn)物的位點(diǎn)55和59的氨基酸位點(diǎn)上的絲氨酸。實(shí)施例29形成NIM1變形體-C-端缺失人IκBα的氨基酸261-317的缺失據(jù)信可通過(guò)阻斷C-末端的絲氨酸和蘇氨酸殘基的組成型磷酸化導(dǎo)致內(nèi)在穩(wěn)定性增強(qiáng)。一個(gè)富含絲氨酸和蘇氨酸的區(qū)域存在于NIM1之C-末端的氨基酸522-593處。NIM1基因的C-末端編碼區(qū)可以通過(guò)刪除編碼氨基酸522-593的核苷酸序列進(jìn)行改造。利用Ho等，(1989)的方法，NIM1cDNA的C-末端編碼區(qū)和3’UTR(SEQIDNO211606-2011)通過(guò)PCR被刪除，用下列引物形成了一個(gè)1623bp的片段5’-cggaattcGATCTCTTTAATTTGTGAATTTC-3’(SEQIDNO36)和5’-ggaattcTCAACAGTTCATAATCTGGTCG-3’(SEQIDNO37)，其中合成的終止密碼加下劃線(在互補(bǔ)鏈上為TGA)，EcoRI銜接物序列為小寫字母。PCR反應(yīng)的組分如前面所述，循環(huán)參數(shù)如下94℃3分鐘30×(94℃30秒52℃1分鐘72℃2分鐘)72℃10分鐘。PCR產(chǎn)物被直接克隆到pCR2.1載體(Invitrogen)。由PCR形成的PCR載體上的插入片段通過(guò)EcoRI限制性內(nèi)切酶酶切被釋放，并連接到含有雙35S啟動(dòng)子的去磷酸化的pCGN1761之EcoRI位點(diǎn)。將構(gòu)件測(cè)序以證明合成依讀框的終止密碼子的存在，并證實(shí)在PCR過(guò)程中沒(méi)有發(fā)生其它突變。含有35S啟動(dòng)子、改造的NIM1cDNA和tml終止子的轉(zhuǎn)化盒是通過(guò)XbaI部分限制性酶切從pCGN1761ENX中釋放下來(lái)的，并將它連接到去磷酸化的pCIB200的XbaI位點(diǎn)。SEQIDNO26和27分別表示具有C-末端氨基酸缺失的NIM1基因變形體的DNA編碼序列和所編碼的氨基酸序列。本發(fā)明還包括NIM1等位基因的變形體，其中這樣一個(gè)等位基因的編碼序列在下列條件下與SEQIDNO26中所示的編碼序列雜交在1％BSA；520mMNaPO4，pH7.2；7％十二烷基硫酸鈉；1mMEDTA；250mMNaCl，55℃雜交18-24小時(shí)，55℃下在6×SSC中洗3次，每次15分鐘，在3×SSC中洗1次，15分鐘。在這些實(shí)施方案中，在上述條件下與SEQIDNO26雜交的NIM1的等位基因被改變，使得編碼產(chǎn)物的C-末端缺失，去除了絲氨酸和蘇氨酸殘基。實(shí)施例30形成NIM1變形體-N-末端/C-端缺失嵌合體一個(gè)N-末端和C-末端缺失形式的NIM1是利用位點(diǎn)819(SEQIDNO21)的單一KpnI限制位點(diǎn)形成的。N-末端缺失形式(實(shí)施例28)用EcoRI/KpnI限制性內(nèi)切酶酶切，通過(guò)凝膠電泳回收相應(yīng)于改造的N-末端的415bp片段。同樣地，C-末端缺失形式(實(shí)施例29)用EcoRI/KpnI限制性內(nèi)切酶酶切，通過(guò)凝膠電泳回收相應(yīng)于改造的C-末端的790bp片段。此片段在15℃用EcoRI酶切以消除EcoRI多聯(lián)體，并克隆到去磷酸化的pCGN1761的EcoRI位點(diǎn)。N/C-末端缺失形式的NIM1受雙35S啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。類似地，形成嵌合體形式的NIM1，它含有與C-末端缺失(實(shí)施例29)融合的S55/S59突變的推斷的磷酸化位點(diǎn)(實(shí)施例27)。此構(gòu)件按上述形成。將構(gòu)件測(cè)序以證明起始和終止密碼的忠實(shí)性，并證實(shí)在克隆過(guò)程中沒(méi)有發(fā)生突變。含有35S啟動(dòng)子、NIM1嵌合體和tml終止子的各自的轉(zhuǎn)化盒通過(guò)XbaI部分酶切從pCGN1761中釋放，并連接到去磷酸化pCIB200的XbaI位點(diǎn)。SEQIDNO28和29分別表示具有N-末端和C-末端氨基酸缺失的NIM1基因變形體的DNA編碼序列和所編碼的氨基酸序列。本發(fā)明還包括NIM1等位基因的變形體，其中這樣一個(gè)等位基因的編碼序列在下列條件下與SEQIDNO28中所示的編碼序列雜交在1％BSA；520mMNaPO4，pH7.2；7％十二烷基硫酸鈉；1mMEDTA；250mMNaCl，55℃雜交18-24小時(shí)，55℃下在6×SSC中洗3次，每次15分鐘，在3×SSC中洗1次，15分鐘。在這些實(shí)施方案中，在上述條件下與SEQIDNO28雜交的NIM1的等位基因被改變，使得編碼產(chǎn)物既具有N-末端缺失，其去除了可作為潛在遍在蛋白質(zhì)化位點(diǎn)的賴氨酸殘基和相應(yīng)于野生型基因產(chǎn)物的位點(diǎn)55和59的氨基酸位點(diǎn)上的絲氨酸，還具有C-末端缺失，其去除了絲氨酸和蘇氨酸殘基。實(shí)施例31形成NIM1變形體-錨蛋白結(jié)構(gòu)域大約在氨基酸103-362處NIM1表現(xiàn)出與錨蛋白基元件的同源性。利用Ho等，(1989)的方法，編碼推斷的錨蛋白結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO23093-3951)的DNA序列從NIM1cDNA(SEQIDNO21349-1128)中經(jīng)PCR擴(kuò)增(條件為94℃3分鐘35×(94℃30秒62℃30秒72℃2分鐘)72℃10分鐘)，采用下列引物5’-ggaattcaATGGACTCCAACAACACCGCCGC-3’(SEQIDNO38)和5’-ggaattcTCAACCTTCCAAAGTTGCTTCTGATG-3’(SEQIDNO39)。形成的產(chǎn)物用EcoRI限制性內(nèi)切酶酶切，并連接到去磷酸化的pCGN1761的EcoRI位點(diǎn)，受雙35S啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄調(diào)控。將此構(gòu)件測(cè)序以證明合成的起始密碼(ATG)和依讀框的終止密碼(TGA)的存在，并證實(shí)在PCR過(guò)程中沒(méi)有發(fā)生其它突變。含有35S啟動(dòng)子、錨蛋白結(jié)構(gòu)域和tml終止子的轉(zhuǎn)化盒是通過(guò)XbaI部分限制性酶切從pCGN1761中釋放，并連接到去磷酸化pCIB200的XbaI位點(diǎn)。SEQIDNO30和31分別表示NIM1的錨蛋白結(jié)構(gòu)域的DNA編碼序列和所編碼的氨基酸序列。本發(fā)明還包括NIM1等位基因的變形體，其中這樣一個(gè)等位基因的編碼序列在下列條件下與SEQIDNO30中所示的編碼序列雜交在1％BSA；520mMNaPO4，pH7.2；7％十二烷基硫酸鈉；1mMEDTA；250mMNaCl，55℃雜交18-24小時(shí)，55℃下在6×SSC中洗3次，每次15分鐘，在3×SSC中洗1次，15分鐘。在這些實(shí)施方案中，在上述條件下與SEQIDNO30雜交的NIM1的等位基因被改變，使得編碼產(chǎn)物基本上由野生型基因產(chǎn)物的錨蛋白結(jié)構(gòu)域組成。實(shí)施例32嵌合基因的構(gòu)建為了增加NIM1變形體在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間和空間表達(dá)的可能性，含有NIM1啟動(dòng)子及基因的一個(gè)4407bpHindIII/BamHI片段(SEQIDNO2堿基1249-5655)和/或一個(gè)5655bpEcoRV/BamHI片段(SEQIDNO2堿基1-5655)被用于建立在上述實(shí)施例27-31中的NIM1變形體。盡管構(gòu)建的步驟有所不同，其概念卻是與前述實(shí)施例可比的。變形體強(qiáng)的過(guò)量表達(dá)可能是潛在地致死的。因此，在實(shí)施例27-31中描述的NIM1基因變形體被置于除內(nèi)源NIM1啟動(dòng)子以外的啟動(dòng)子的調(diào)控之下，啟動(dòng)子包括但并不限于nos啟動(dòng)子或Rubisco啟動(dòng)子的小亞單位。同樣地，NIM1變形體可以在應(yīng)答病原體的啟動(dòng)子PR-1(美國(guó)專利5,614,395)的調(diào)控下表達(dá)。這種表達(dá)僅在受到病原體攻擊或其它SAR激活條件下允許NIM1變形體強(qiáng)表達(dá)。而且，當(dāng)用通常并不激活SAR的SAR激活化合物(即BTH或INA)的濃度處理時(shí)，在受PR-1啟動(dòng)子調(diào)控下表達(dá)NIM1變形體的轉(zhuǎn)化子中可見(jiàn)抗病性，因而激活了一個(gè)反饋環(huán)(Weymann等，(1995)植物細(xì)胞72013-2022)。實(shí)施例33將NIM1變形體轉(zhuǎn)化到擬南芥中將形成的構(gòu)件(實(shí)施例27-32)通過(guò)電穿孔轉(zhuǎn)移到根癌土壤桿菌菌株GV3101中。這些構(gòu)件被用于通過(guò)真空滲透(Mindrinos等，細(xì)胞78，1089-1099(1994))或通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的根轉(zhuǎn)化技術(shù)轉(zhuǎn)化擬南芥生態(tài)型Col-0和Ws-0。收獲這些植物的種子并使之在添加了作為選擇劑的卡那霉素(或另一種適當(dāng)?shù)目股?的瓊脂板上發(fā)芽。只有被粘粒DNA轉(zhuǎn)化的幼苗能夠解除選擇劑的毒性并存活下來(lái)。將在選擇中存活下來(lái)的幼苗轉(zhuǎn)移到土壤中并測(cè)試CIM(組成型免疫)表型。根據(jù)與野生型相比較可見(jiàn)的表型差異評(píng)價(jià)植物。實(shí)施例34用NIM1變形體轉(zhuǎn)化的植物的CIM表型的評(píng)價(jià)收獲每個(gè)初級(jí)轉(zhuǎn)化子的葉子，分離RNA(Verwoerd等，1989，核酸研究，2362)，并通過(guò)RNA印跡分析(Uknes等，1992)測(cè)試組成型PR-1表達(dá)。評(píng)價(jià)每個(gè)轉(zhuǎn)化子的作為組成型SAR表達(dá)分析指示之增強(qiáng)的抗病性反應(yīng)(Uknes等，1992)。制備兩種相容性的寄生霜霉分離物，Emwa和Noco(就是說(shuō)這些真菌菌株分別在野生型Ws-0和Col-0植物引起病害)的分生孢子懸液，濃度為5-10×104個(gè)孢子/ml，根據(jù)轉(zhuǎn)化子的生態(tài)型用適當(dāng)?shù)姆蛛x物噴霧。接種的植物在高溫下培養(yǎng)7天。在第7天將植物進(jìn)行病害分級(jí)，收獲一片葉子，利用一種提供測(cè)量真菌感染的工具的探針用于RNA印跡分析。將表現(xiàn)CIM表型的轉(zhuǎn)化子長(zhǎng)到T1代并鑒定純合植物。轉(zhuǎn)化子進(jìn)行一組下述的抗病性測(cè)試。重復(fù)用Noco和Emwa的真菌感染，將葉片用乳酚藍(lán)染色按照Dietrich等，(1994)中的描述鑒定真菌菌絲體的存在。將轉(zhuǎn)化子用細(xì)菌病原體丁香假單胞菌DC3000感染以評(píng)價(jià)如Uknes等，(1993)中所述的抗性譜。評(píng)價(jià)未感染的植物中游離的和與葡萄糖結(jié)合的SA，將葉片用乳酚藍(lán)染色以評(píng)價(jià)微觀病斑的存在?？剐灾参锱cSAR突變型如NahG(美國(guó)專利5,614,395)和ndr1進(jìn)行有性雜交，以建立抗性表型與其它突變型的上位關(guān)系，并評(píng)價(jià)這些NIM1的顯性-負(fù)性突變型是如何影響依賴于SA的反饋環(huán)的。實(shí)施例35NIM1同系物的分離使用NIM1cDNA(SEQIDNO21)作探針，通過(guò)從不同作物中篩選基因組或cDNA文庫(kù)鑒定了擬南芥NIM1的同系物，不同作物例如但并不限于在下面的實(shí)施例36中列出的那些。完成此種任務(wù)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)包括雜交篩選涂布的DNA文庫(kù)(或是噬菌斑或是菌落；參閱，例如，Sambrook等，分子克隆，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，(1989))以及用寡核苷酸引物通過(guò)PCR擴(kuò)增(參閱，例如Innis等，PCR技術(shù)方法與應(yīng)用指南》，學(xué)院出版社(1990))。鑒定的同系物一般通過(guò)遺傳工程導(dǎo)入表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化到上面列出的作物中。利用所檢測(cè)作物的相應(yīng)的病原體評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)化子增強(qiáng)的抗病性。在黃瓜、番茄、煙草、玉米、小麥和大麥基因組中的NIM1同系物已通過(guò)DNA印跡分析檢測(cè)。從黃瓜、番茄、煙草、玉米、小麥和大麥中分離基因組DNA，用限制酶BamHI、HindIII、XbaI或SalI酶切，在0.8％瓊脂糖凝膠上電泳分離并通過(guò)毛細(xì)印跡轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。通過(guò)紫外交聯(lián)結(jié)合DNA后，將膜在低度嚴(yán)格條件下[(1％BSA；520mMNaPO4，pH7.2；7％十二烷基硫酸鈉；1mMEDTA；250mMNaCl)，55℃雜交18-24小時(shí)]與32P標(biāo)記的擬南芥NIM1cDNA雜交。雜交后將印跡在低度嚴(yán)格條件下洗滌(55℃下在6×SSC中洗3次，每次15分鐘，在3×SSC中洗1次，15分鐘；1×SSC是0.15MNaCl、15mM檸檬酸鈉(pH7.0)在X光膠片上曝光使相應(yīng)于NIM1的帶顯見(jiàn)出來(lái)。另外，利用與NIM1基因的相似性鑒定的表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)鑒定同系物。例如幾種水稻EST已鑒定為與NIM1基因有相似性。利用ClustalV構(gòu)建了一個(gè)多重序列比較(Higgins，DesmondG.和PaulM.Sharp(1989)，快速和靈敏的多重序列比較在微型計(jì)算機(jī)上進(jìn)行，CABIOS5151-153)作為部分DNA*(1228SouthParkStreet，MadisonWisconsin，53715)基于Macintosh的激光基因生物計(jì)算軟件包(1994)。NIM1蛋白的某些區(qū)域的氨基酸序列與4種不同水稻cDNA蛋白產(chǎn)物是同源的。同源性用GeneBankBLAST搜索中的NIM1序列進(jìn)行鑒定。NIM1和水稻cDNA產(chǎn)物的同源區(qū)的比較示于圖8(另參閱，SEQIDNO3和SEQIDNO4-11)。NIM1蛋白片段與4種水稻產(chǎn)物具有36％至48％的相同的氨基酸序列。這種水稻的EST在從其它單子葉植物中分離NIM1同系物方面可能特別有效。同系物可以通過(guò)PCR得到。在這個(gè)方法中，在已知的同系物之間作比較(例如水稻和擬南芥)。氨基酸和DNA相似性或相同性高的區(qū)域用于制備PCR引物。富含甲硫氨酸和色氨酸的區(qū)域后面最好緊隨富含苯丙氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、組氨酸、谷氨酰胺、賴氨酸和谷氨酸的區(qū)域，因?yàn)檫@些氨基酸是由有限數(shù)目的密碼子編碼的。一旦一個(gè)合適的區(qū)域被鑒定，通過(guò)在第三位密碼子位點(diǎn)引入不同的替換制備該區(qū)域的引物。在第三位點(diǎn)的不同的替換可能受到作為目標(biāo)的該區(qū)域種類的限制。例如，玉米是富含GC的，如果可能的話設(shè)計(jì)的引物在第三位點(diǎn)采用一個(gè)G或是一個(gè)C。在多種不同的標(biāo)準(zhǔn)條件下，從cDNA或基因組DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)。當(dāng)一條帶顯示出來(lái)時(shí)，它被克隆并/或被測(cè)序以檢測(cè)它是否是NIM1同系物。實(shí)施例36在作物類植物中表達(dá)NIM1變形體將那些在Col-0或Ws-0中賦予CIM表型的構(gòu)件轉(zhuǎn)化到作物類植物中進(jìn)行評(píng)價(jià)?；蛘?，將從前面例子中作物中分離的改變的天然NIM1基因放回到各自作物中。盡管NIM1基因可以插入到屬于這些大類的任何植物細(xì)胞中，但是在作物類植物中特別有用，例如水稻、小麥、大麥、黑麥、玉米、馬鈴薯、胡蘿卜、甜馬鈴薯、甜菜、菜豆、豌豆、菊苣、萵苣、白菜、花椰菜、花莖甘藍(lán)、蕪菁、蘿卜、菠菜、蘆筍、洋蔥、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、胡蘿卜、南瓜、西葫蘆、小西葫蘆、黃瓜、蘋果、梨、溫孛、甜瓜、李子、櫻桃、挑、蜜桃、杏、草莓、葡萄、覆盆子、黑莓、鳳梨、鱷梨、番木瓜樹(shù)、芒果、香蕉、大豆、煙草、番茄、高粱和甘蔗。評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)化子增強(qiáng)的抗病性。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，NIM1基因變形體的表達(dá)水平至少是在野生型植物中的天然NIM1基因表達(dá)水平的2倍以上，優(yōu)選地是野生型表達(dá)水平的10倍以上。參考文獻(xiàn)下列每個(gè)文獻(xiàn)的公開(kāi)都被清楚地引入到本發(fā)明中Altschul，S.F.，Gish，W.，Miller，W.，Myers，E.W.和Lipman，D.J.(1990)?；镜木植繉?duì)比搜索工具，分子生物學(xué)雜志215，403-410。Ausubel，F(xiàn).M.，Brent，R.，Kingston，R.E.，Moore，D.D.，Seidman，J.G.，Smith，J.A.，和Struhl，K.，編(1987)，《現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)》，(紐約J.Wiley和Sons).Bechtold，N.，Ellis，J.，和Pelletier，G.(1993).作物土壤桿菌介導(dǎo)的基因滲透轉(zhuǎn)移成年擬南芥植物。ComptesRendusdeI’AcademiedesSciencesParis，SerieSciencesDeLaVie316，494-499。Bell，C.，和Ecker，J.(1994).30個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在擬南芥連接圖上的分配?；蚪M學(xué)19，137-144。Bhat，K.(1993).用于通過(guò)快速多定點(diǎn)突變?nèi)笔Э寺〉馁|(zhì)粒載體的形成，基因134，83-87。Bi，Y.M.，Kenton，P.，Mur，L.，Darby，R.，和Draper，J.(1995)，過(guò)氧化氫不能在誘導(dǎo)PR蛋白表達(dá)的水楊酸的下游起作用。植物雜志8，235-245。Bowling，S.A.，Guo，A.，Cao，H.，Gordon，A.S.，Klessig，D.F.，和Dong，X.I.(1994)，導(dǎo)致系統(tǒng)獲得性抗性的擬南芥的一個(gè)突變，植物細(xì)胞，6，1845-1857。Cameron，R.K.，Dixon，R.A.，和Lamb，C.J.(1994)，擬南芥中的生物學(xué)誘導(dǎo)的系統(tǒng)獲得性抗性。植物雜志5，715-725。Century，K.S.，Holub，E.B.，和Staskawicz，B.J.(1995).NDR1，一個(gè)為細(xì)菌和真菌病原體抗性所需的擬南芥的位點(diǎn)。美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)92，6597-6601。Chio，S.，Creelman，R.，J.，M.，和Wing，R.(1995)一個(gè)擬南芥的細(xì)菌人工染色體文庫(kù)的構(gòu)建和鑒定。植物分子生物學(xué)13，124-128。Creusot，F(xiàn).，F(xiàn)ouillox，E.，Dron，M.，Lafleuriel，J.，Picard，G.，Billaut，A.，LePaslier，D.，Cohen，D.，Chaboute，M.E.，Durr，A.，F(xiàn)leck，J.，Gigot，C.，Camilleri，C.，Bellini，C.，Caboche，M.，和Bouchez，D.(1995).CIC文庫(kù)用于擬南芥基因組作圖的一個(gè)大的插入YAC文庫(kù)。植物雜志8，763-770。Delaney，T.P.(1997)獲得性抗病性的遺傳解析。植物生理113，5-12。Delaney，T.P.，Uknes，S.，Vernooij，B.，F(xiàn)riedrich，L.，Weymann，K.，Negrotto，D.，Gaffney，T.，Gutrella，M.，Kessmann，H.，Ward，E.，和Ryals，J.(1994).水楊酸在植物抗病性的中心角色?？茖W(xué)266，1247-1250。Delaney，T.P.，F(xiàn)riedrich，L.，和Ryals，J.A.(1995).化學(xué)和生物學(xué)誘導(dǎo)的抗病性缺陷的擬南芥信號(hào)傳導(dǎo)突變型。美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)92，6602-6606。Dempsey，D.A.，和Klessig，D.F.(1995).植物抗病性中的信號(hào)。BulletindeL’institutPasteur93，167-186。Dietrich，R.A.，Delaney，T.P.，Uknes，.J.，Ward，E.R.，Ryals，J.A.，和Dangl，J.L.(1994).模擬抗病性反應(yīng)的擬南芥突變型。細(xì)胞77，565-577。Friedrich，L，Lawton，K.，Ruess，W.，masner，P.，Specker，N.，GutRella，M.，Meier，B.，Dincher，S.，Metraux，J.-P.，Kessmann，H.，和Ryals，J.(1996).在煙草中誘導(dǎo)系統(tǒng)獲得性抗性的一個(gè)苯并噻二唑衍生物。植物雜志10(1)，61-70.Elledge，S.，Mulligan，J.，Ramer，S.，Spottswood，M.，和Davis，R.(1991).用于酵母和大腸桿菌突變互補(bǔ)分離基因的一個(gè)多功能cDNA表達(dá)載體。美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)88，1731-1735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CATGTCTCG432ArgLysGluLeuGlyLeuGluValProLysValLysLysHisValSer130135140AATGTACATAAGGCACTTGACTCGGATGATATTGAGTTAGTCAAGTTG480AsnValHisLysAlaLeuAspSerAspAspIleGluLeuValLysLeu145150155160CTTTTGAAAGAGGATCACACCAATCTAGATGATGCGTGTGCTCTTCAT528LeuLeuLysGluAspHisThrAsnLeuAspAspAlaCysAlaLeuHis165170175TTCGCTGTTGCATATTGCAATGTGAAGACCGCAACAGATCTTTTAAAA576PheAlaValAlaTyrCysAsnValLysThrAlaThrAspLeuLeuLys180185190CTTGATCTTGCCGATGTCAACCATAGGAATCCGAGGGGATATACGGTG624LeuAspLeuAlaAspValAsnHisArgAsnProArgGlyTyrThrVal195200205CTTCATGTTGCTGCGATGCGGAAGGAGCCACAATTGATACTATCTCTA672LeuHisValAlaAlaMetArgLysGluProGlnLeuIleLeuSerLeu210215220TTGGAAAAAGGTGCAAGTGCATCAGAAGCAACTTTGGAAGGTAGAACC720LeuGluLysGlyAlaSerAlaSerGluAlaThrLeuGluGlyArgThr225230235240GCACTCATGATCGCAAAACAAGCCACTATGGCGGTTGAATGTAATAAT768AlaLeuMetIleAlaLysGlnAlaThrMetAlaValGluCysAsnAsn245250255ATCCCGGAGCAATGCAAGCATTCTCTCAAAGGCCGACTATGTGTAGAA816IleProGluGlnCysLysHisSerLeuLysGlyArgLeuCysValGlu260265270ATACTAGAGCAAGAAGACAAACGAGAACAAATTCCTAGAGATGTTCCT864IleLeuGluGlnGluAspLysArgGluGlnIleProArgAspValPro275280285CCCTCTTTTGCAGTGGCGGCCGATGAATTGAAGATGACGCTGCTCGAT912ProSerPheAlaValAlaAlaAspGluLeuLysMetThrLeuLeuAsp290295300CTTGAAAATAGAGTTGCACTTGCTCAACGTCTTTTTCCAACGGAAGCA960LeuGluAsnArgValAlaLeuAlaGlnArgLeuPheProThrGluAla305310315320CAAGCTGCAATGGAGATCGCCGAAATGAAGGGAACATGTGAGTTCATA1008GlnAlaAlaMetGluIleAlaGluMetLysGlyThrCysGluPheIle325330335GTGACTAGCCTCGAGCCTGACCGTCTCACTGGTACGAAGAGAACATCA1056ValThrSerLeuGluProAspArgLeuThrGlyThrLysArgThrSer340345350CCGGGTGTAAAGATAGCACCTTTCAGAATCCTAGAAGAGCATCAAAGT1104ProGlyValLysIleAlaProPheArgIleLeuGluGluHisGlnSer355360365AGACTAAAAGCGCTTTCTAAAACCGTGGAACTCGGGAAACGATTCTTC1152ArgLeuLysAlaLeuSerLysThrValGluLeuGlyLysArgPhePhe370375380CCGCGCTGTTCGGCAGTGCTCGACCAGATTATGAACTGTTGA1194ProArgCysSerAlaValLeuAspGlnIleMetAsnCys*385390395(2)SEQIDNO29的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度398個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)SEQIDNO29的序列描述MetAspSerValValThrValLeuAlaTyrValTyrSerSerArgVal151015ArgProProProLysGlyValSerGluCysAlaAspGluAsnCysCys202530HisValAlaCysArgProAlaValAspPheMetLeuGluValLeuTyr354045LeuAlaPheIlePheLysIleProGluLeuIleThrLeuTyrGlnArg505560HisLeuLeuAspValValAspLysValValIleGluAspThrLeuVal65707580IleLeuLysLeuAlaAsnIleCysGlyLysAlaCysMetLysLeuLeu859095AspArgCysLysGluIleIleValLysSerAsnValAspMetValSer100105110LeuGluLysSerLeuProGluGluLeuValLysGluIleIleAspArg115120125ArgLysGluLeuGlyLeuGluValProLysValLysLysHisValSer130135140AsnValHisLysAlaLeuAspSerAspAspIleGluLeuValLysLeu145150155160LeuLeuLysGluAspHisThrAsnLeuAspAspAlaCysAlaLeuHis165170175PheAlaValAlaTyrCysAsnValLysThrAlaThrAspLeuLeuLys180185190LeuAspLeuAlaAspValAsnHisArgAsnProArgGlyTyrThrVal195200205LeuHisValAlaAlaMetArgLysGluProGlnLeuIleLeuSerLeu210215220LeuGluLysGlyAlaSerAlaSerGluAlaThrLeuGluGlyArgThr225230235240AlaLeuMetIleAlaLysGlnAlaThrMetAlaValGluCysAsnAsn245250255IleProGluGlnCysLysHisSerLeuLysGlyArgLeuCysValGlu260265270IleLeuGluGlnGluAspLysArgGluGlnIleProArgAspValPro275280285ProSerPheAlaValAlaAlaAspGluLeuLysMetThrLeuLeuAsp290295300LeuGluAsnArgValAlaLeuAlaGlnArgLeuPheProThrGluAla305310315320GlnAlaAlaMetGluIleAlaGluMetLysGlyThrCysGluPheIle325330335ValThrSerLeuGluProAspArgLeuThrGlyThrLysArgThrSer340345350ProGlyValLysIleAlaProPheArgIleLeuGluGluHisGlnSer355360365ArgLeuLysAlaLeuSerLysThrValGluLeuGlyLysArgPhePhe370375380ProArgCysSerAlaValLeuAspGlnIleMetAsnCys*385390395(2)SEQIDNO30的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度786個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1..786(D)其它信息/產(chǎn)物＝“NIM1改變的形式”/注釋＝“NIM1的錨蛋白結(jié)構(gòu)域”(xi)SEQIDNO30的序列描述ATGGACTCCAACAACACCGCCGCCGTGAAGCTCGAGCTTAAGGAGATT48MetAspSerAsnAsnThrAlaAlaValLysLeuGluLeuLysGluIle151015GCCAAGGATTACGAAGTCGGTTTCGATTCGGTTGTGACTGTTTTGGCT96AlaLysAspTyrGluValGlyPheAspSerValValThrValLeuAla202530TATGTTTACAGCAGCAGAGTGAGACCGCCGCCTAAAGGAGTTTCTGAA144TyrValTyrSerSerArgValArgProProProLysGlyValSerGlu354045TGCGCAGACGAGAATTGCTGCCACGTGGCTTGCCGGCCGGCGGTGGAT192CysAlaAspGluAsnCysCysHisValAlaCysArgProAlaValAsp505560TTCATGTTGGAGGTTCTCTATTTGGCTTTCATCTTCAAGATCCCTGAA240PheMetLeuGluValLeuTyrLeuAlaPheIlePheLysIleProGlu65707580TTAATTACTCTCTATCAGAGGCACTTATTGGACGTTGTAGACAAAGTT288LeuIleThrLeuTyrGlnArgHisLeuLeuAspValValAspLysVal859095GTTATAGAGGACACATTGGTTATACTCAAGCTTGCTAATATATGTGGT336ValIleGluAspThrLeuValIleLeuLysLeuAlaAsnIleCysGly100105110AAAGCTTGTATGAAGCTATTGGATAGATGTAAAGAGATTATTGTCAAG384LysAlaCysMetLysLeuLeuAspArgCysLysGluIleIleValLys115120125TCTAATGTAGATATGGTTAGTCTTGAAAAGTCATTGCCGGAAGAGCTT432SerAsnValAspMetValSerLeuGluLysSerLeuProGluGluLeu130135140GTTAAAGAGATAATTGATAGACGTAAAGAGCTTGGTTTGGAGGTACCT480ValLysGluIleIleAspArgArgLysGluLeuGlyLeuGluValPro145150155160AAAGTAAAGAAACATGTCTCGAATGTACATAAGGCACTTGACTCGGAT528LysValLysLysHisValSerAsnValHisLysAlaLeuAspSerAsp165170175GATATTGAGTTAGTCAAGTTGCTTTTGAAAGAGGATCACACCAATCTA576AspIleGluLeuValLysLeuLeuLeuLysGluAspHisThrAsnLeu180185190GATGATGCGTGTGCTCTTCATTTCGCTGTTGCATATTGCAATGTGAAG624AspAspAlaCysAlaLeuHisPheAlaValAlaTyrCysAsnValLys195200205ACCGCAACAGATCTTTTAAAACTTGATCTTGCCGATGTCAACCATAGG672ThrAlaThrAspLeuLeuLysLeuAspLeuAlaAspValAsnHisArg210215220AATCCGAGGGGATATACGGTGCTTCATGTTGCTGCGATGCGGAAGGAG720AsnProArgGlyTyrThrValLeuHisValAlaAlaMetArgLysGlu225230235240CCACAATTGATACTATCTCTATTGGAAAAAGGTGCAAGTGCATCAGAA768ProGlnLeuIleLeuSerLeuLeuGluLysGlyAlaSerAlaSerGlu245250255GCAACTTTGGAAGGTTGA786AlaThrLeuGluGly*260(2)SEQIDNO31的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度262個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)SEQIDNO31的序列描述MetAspSerAsnAsnThrAlaAlaValLysLeuGluLeuLysGluIle151015AlaLysAspTyrGluValGlyPheAspSerValValThrValLeuAla202530TyrValTyrSerSerArgValArgProProProLysGlyValSerGlu354045CysAlaAspGluAsnCysCysHisValAlaCysArgProAlaValAsp505560PheMetLeuGluValLeuTyrLeuAlaPheIlePheLysIleProGlu65707580LeuIleThrLeuTyrGlnArgHisLeuLeuAspValValAspLysVal859095ValIleGluAspThrLeuValIleLeuLysLeuAlaAsnIleCysGly100105110LysAlaCysMetLysLeuLeuAspArgCysLysGluIleIleValLys115120125SerAsnValAspMetValSerLeuGluLysSerLeuProGluGluLeu130135140ValLysGluIleIleAspArgArgLysGluLeuGlyLeuGluValPro145150155160LysValLysLysHisValSerAsnValHisLysAlaLeuAspSerAsp165170175AspIleGluLeuValLysLeuLeuLeuLysGluAspHisThrAsnLeu180185190AspAspAlaCysAlaLeuHisPheAlaValAlaTyrCysAsnValLys195200205ThrAlaThrAspLeuLeuLysLeuAspLeuAlaAspValAsnHisArg210215220AsnProArgGlyTyrThrValLeuHisValAlaAlaMetArgLysGlu225230235240ProGlnLeuIleLeuSerLeuLeuGluLysGlyAlaSerAlaSerGlu245250255AlaThrLeuGluGly*260(2)SEQIDNO32的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度35個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(xi)SEQIDNO32的序列描述CAACAGCTTCGAAGCCGTCTTTGACGCGCCGGATG35(2)SEQIDNO33的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度35個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(xi)SEQIDNO33的序列描述CATCCGGCGCGTCAAAGACGGCTTCGAAGCTGTTG35(2)SEQIDNO34的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度32個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(xi)SEQIDNO34的序列描述GGAATTCAATGGATTCGGTTGTGACTGTTTTG32(2)SEQIDNO35的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度28個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(xi)SEQIDNO35的序列描述GGAATTCTACAAATCTGTATACCATTGG28(2)SEQIDNO36的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度31個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(xi)SEQIDNO36的序列描述CGGAATTCGATCTCTTTAATTTGTGAATTTC31(2)SEQIDNO37的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度29個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(xi)SEQIDNO37的序列描述GGAATTCTCAACAGTTCATAATCTGGTCG29(2)SEQIDNO38的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度31個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(xi)SEQIDNO38的序列描述GGAATTCAATGGACTCCAACAACACCGCCGC31(2)SEQIDNO39的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度33個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(xi)SEQIDNO39的序列描述GGAATTCTCAACCTTCCAAAGTTGCTTCTGATG3權(quán)利要求1.一種編碼NIM1蛋白變形體的DNA分子。2.權(quán)利要求1的DNA分子，它在SAR信號(hào)傳導(dǎo)途徑中作為一種顯性-負(fù)性調(diào)節(jié)子。3.權(quán)利要求1的DNA分子，其中所說(shuō)的NIM1蛋白變形體在相應(yīng)于SEQIDNO3的55和59氨基酸位點(diǎn)上以丙氨酸替換絲氨酸。4.權(quán)利要求3的DNA分子，其中所說(shuō)的NIM1蛋白變形體含有在SEQIDNO23中所示的氨基酸序列。5.權(quán)利要求4的DNA分子，其中所說(shuō)的DNA分子含有在SEQIDNO22和所有DNA中所示的核苷酸序列。6.權(quán)利要求1的DNA分子，其中所說(shuō)的NIM1蛋白變形體是NIM1基因產(chǎn)物被截短了的版本。7.權(quán)利要求1的DNA分子，其中所說(shuō)的NIM1蛋白變形體在相應(yīng)于SEQIDNO3的大約氨基酸位點(diǎn)1-125的N-末端氨基酸被截短。8.權(quán)利要求7的DNA分子，其中所說(shuō)的NIM1蛋白變形體含有SEQIDNO25中所示的氨基酸序列。9.權(quán)利要求8的DNA分子，其中所說(shuō)的DNA分子含有在SEQIDNO24中所示的核苷酸序列。10.權(quán)利要求1的DNA分子，其中所說(shuō)的NIM1蛋白變形體在相應(yīng)于SEQIDNO3的大約氨基酸位點(diǎn)522-593的C-末端氨基酸被截短。11.權(quán)利要求22的DNA分子，其中所說(shuō)的NIM1蛋白變形體含有SEQIDNO27中所示的氨基酸序列。12.權(quán)利要求23的DNA分子，其中所說(shuō)的DNA分子含有在SEQIDNO26中所示的核苷酸序列。13.權(quán)利要求1的DNA分子，其中所說(shuō)的NIM1蛋白變形體在相應(yīng)于SEQIDNO2的大約氨基酸位點(diǎn)1-125的N-末端氨基酸被截短，且在相應(yīng)于SEQIDNO3的大約氨基酸位點(diǎn)522-593的C-末端氨基酸被截短。14.權(quán)利要求13的DNA分子，其中所說(shuō)的NIM1蛋白變形體含有SEQIDNO29中所示的氨基酸序列。15.權(quán)利要求14的DNA分子，其中所說(shuō)的DNA分子含有在SEQIDNO28中所示的核苷酸序列。16.權(quán)利要求1的DNA分子，其中所說(shuō)的NIM1蛋白變形體基本上由相應(yīng)于SEQIDNO3的大約氨基酸位點(diǎn)103-362的錨蛋白基元組成。17.權(quán)利要求16的DNA分子，其中所說(shuō)的NIM1蛋白變形體含有SEQIDNO31中所示的氨基酸序列。18.權(quán)利要求17的DNA分子，其中所說(shuō)的DNA分子含有在SEQIDNO30中所示的核苷酸序列。19.權(quán)利要求1的DNA分子，其中所說(shuō)的DNA分子在下列條件下與選自SEQIDNO22、SEQIDNO24、SEQIDNO26、SEQIDNO28和SEQIDNO30的核苷酸序列雜交在1％BSA；520mMNaPO4，pH7.2；7％十二烷基硫酸鈉；1mMEDTA；250mMNaCl，55℃雜交18-24小時(shí)，55℃下在6×SSC中洗3次，每次15分鐘，在3×SSC中洗1次，15分鐘。20.一種嵌合基因，它含有一個(gè)有效地連接到權(quán)利要求1-19中任何一個(gè)權(quán)利要求的DNA分子上的植物中有活性的啟動(dòng)子。21.一種含有權(quán)利要求20的嵌合基因的重組載體，其中所說(shuō)的載體能夠被穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中。22.一種在植物中激活SAR的方法，包括用權(quán)利要求21的重組載體轉(zhuǎn)化植物，其中所說(shuō)的NIM1蛋白變形體在所述經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物中表達(dá)，且在該植物中激活SAR。23.一種賦予植物廣譜抗病性的方法，包括用權(quán)利要求21的重組載體轉(zhuǎn)化植物，其中所說(shuō)的NIM1蛋白變形體在所述經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物中表達(dá)，并賦予該植物廣譜的抗病性。24.一種賦予植物CIM表型的方法，包括用權(quán)利要求21的重組載體轉(zhuǎn)化植物，其中所說(shuō)的NIM1蛋白變形體在所述經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物中表達(dá)，并賦予該植物CIM表型。25.一種用權(quán)利要求21的載體穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。26.權(quán)利要求25的宿主細(xì)胞，它是植物細(xì)胞。27.一種含有權(quán)利要求19的嵌合基因的植物、植物細(xì)胞及其后代，它們具有廣譜的抗病性。28.一種植物、植物細(xì)胞及其后代，其中參與導(dǎo)致植物中系統(tǒng)獲得性抗性的信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的NIM1蛋白在所述經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物中以高于野生型植物的水平表達(dá)。29.一種權(quán)利要求27或28的植物、植物細(xì)胞及其后代，其中所說(shuō)的植物選自裸子植物、單子葉植物和雙子葉植物。30.一種權(quán)利要求27或28的植物、植物細(xì)胞及其后代，其中所說(shuō)的植物是作物類植物。31.一種權(quán)利要求27或28的植物、植物細(xì)胞及其后代，其中所說(shuō)的植物選自水稻、小麥、大麥、黑麥、玉米、馬鈴薯、胡蘿卜、甜馬鈴薯、甜菜、菜豆、豌豆、菊苣、萵苣、白菜、花椰菜、花莖甘藍(lán)、蕪菁、蘿卜、菠菜、蘆筍、洋蔥、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、胡蘿卜、南瓜、西葫蘆、小西葫蘆、黃瓜、蘋果、梨、溫孛、甜瓜、李子、櫻桃、桃、蜜桃、杏、草莓、葡萄、覆盆子、黑莓、鳳梨、鱷梨、番木瓜樹(shù)、芒果、香蕉、大豆、煙草、番茄、高粱和甘蔗。32.一種賦予植物細(xì)胞、植物及其后代CIM表型的方法，其包括用含有嵌合基因的重組載體轉(zhuǎn)化植物，嵌合基因含有一個(gè)有效地連接到一種DNA分子的在植物中有活性的啟動(dòng)子，該DNA分子編碼參與導(dǎo)致植物中系統(tǒng)獲得性抗性的信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的NIM1蛋白，其中所說(shuō)的載體能夠穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞，其中所說(shuō)的NIM1蛋白在所述經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物中以高于野生型植物的水平表達(dá)。33.一種在植物細(xì)胞、植物及其后代中激活系統(tǒng)獲得性抗性的方法，其包括用含有嵌合基因的重組載體轉(zhuǎn)化植物，嵌合基因含有一個(gè)有效地連接到一種DNA分子的在植物中有活性的啟動(dòng)子，該DNA分子編碼參與導(dǎo)致植物系統(tǒng)獲得性抗性的信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的NIM1蛋白，其中所說(shuō)的載體能夠穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞，其中所說(shuō)的NIM1蛋白在所述經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物中以高于野生型植物的水平表達(dá)。34.一種賦予植物細(xì)胞、植物及其后代廣譜抗病性的方法，其包括用含有嵌合基因的重組載體轉(zhuǎn)化植物，嵌合基因含有一個(gè)有效地連接到一種DNA分子的在植物中有活性的啟動(dòng)子，該DNA分子編碼參與導(dǎo)致植物系統(tǒng)獲得性抗性的信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的NIM1蛋白，其中所說(shuō)的載體能夠穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞，其中所說(shuō)的NIM1蛋白在所述經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物中以高于野生型植物的水平表達(dá)。35.一種含有權(quán)利要求20的嵌合基因的轉(zhuǎn)基因植物或其后代在農(nóng)業(yè)方法中的用途。36.一種含有轉(zhuǎn)基因植物種子的商業(yè)袋，其中含有至少一種在所述經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物中以高于野生型植物的水平表達(dá)的NIM1蛋白變形體或NIM1蛋白，以及數(shù)量足夠作為SAR信號(hào)傳導(dǎo)途徑的顯性-負(fù)性調(diào)節(jié)子的適當(dāng)?shù)妮d體，以及用于其賦予植物廣譜抗病性的應(yīng)用的標(biāo)簽說(shuō)明。全文摘要本發(fā)明涉及一個(gè)基因(命名為NIM1)的定位和表征,該基因是SAR途徑的重要成分,并與化學(xué)和生物誘導(dǎo)因子聯(lián)合作用誘導(dǎo)SAR基因的表達(dá),并賦予植物廣譜的抗病性。NIM1基因產(chǎn)物是哺乳動(dòng)物信號(hào)傳導(dǎo)因子IκB的α亞類的結(jié)構(gòu)同系物。本發(fā)明利用此發(fā)現(xiàn)以提供NIM1的變形體,其作為系統(tǒng)獲得性抗性(SAR)信號(hào)傳導(dǎo)途徑的顯性—負(fù)性調(diào)節(jié)子。在用這些NIM1變形體轉(zhuǎn)化的植物中,這些NIM1變形體賦予與nim1突變型相反的表型,即轉(zhuǎn)基因植物表現(xiàn)為組成型SAR基因表達(dá)和組成型免疫(CIM)表型。本發(fā)明進(jìn)一步涉及在植物中過(guò)量表達(dá)NIM1基因的轉(zhuǎn)化載體和方法。這樣建立的轉(zhuǎn)基因植物具有廣譜的抗病性。本發(fā)明進(jìn)一步涉及編碼NIM1基因變形體的DNA分子、含有此DNA分子的表達(dá)載體以及由其轉(zhuǎn)化的植物和植物細(xì)胞。本發(fā)明進(jìn)一步涉及在植物中過(guò)量表達(dá)NIM1基因的的轉(zhuǎn)化載體和方法。公開(kāi)了用于在植物中產(chǎn)生過(guò)量表達(dá)NIM1基因的載體和方法。本發(fā)明還涉及在植物中激活SAR,以及通過(guò)用編碼NIM1基因產(chǎn)物變形體的DNA分子轉(zhuǎn)化植物以賦予植物CIM表型和廣譜抗病性的方法。文檔編號(hào)C12N15/82GK1241215SQ97180553公開(kāi)日2000年1月12日申請(qǐng)日期1997年12月12日優(yōu)先權(quán)日1997年12月12日發(fā)明者J·A·賴亞爾斯,K·A·勞頓,S·J·尤肯斯,H－Y·斯坦納,M·D·亨特,L·B·弗里德里克申請(qǐng)人:諾瓦提斯公司