專利名稱：：抗病植物的制作方法抗病植物本發(fā)明涉及抗病植物，特別是抗真菌界及卵菌(化歷/C0")門生物體一一卵菌的植物。本發(fā)明還涉及能賦予疾病抗性的植物基因和獲得這種抗病植物的方法，用于提供針對卵菌病原體的保護。已廣泛地研究過植物對真菌及卵菌病原體的抗性，包括病原體特異性的和廣譜的抗性兩個方面。在很多情況下是通過抗性顯性基因表明了抗性。這些品種-特異性或基因-對-基因的抗性基因已被鑒定了許多，其通過直接或間接地與無毒性基因產(chǎn)物或來自病原體的其它分子相互作用來介導(dǎo)病原體識別。這種識別導(dǎo)致許多植物防御反應(yīng)的活化，這些反應(yīng)會阻滯病原體生長。在植物育種中經(jīng)常想要鑒定主要為單基因顯性抗性基因的新來源。在新引入了單抗性基因的栽培品種中，抗病保護通常會迅速地被破壞，因為病原體進化和適應(yīng)的頻率極快，能恢復(fù)成功感染寄主植物的能力。因此，非常需要獲得新的疾病抗性來源。其它抗性機理例如通過調(diào)節(jié)植物中的防御反應(yīng)起作用，如通過隱性邊/o基因在大麥中介導(dǎo)的針對白粉菌病原體禾布氏白粉菌大麥專化型(Bl腸riag濯inisf.sp.hordei)的抗性。帶有野生型則基因突變等位基因的植物顯示出幾乎完全抗性，與真菌試圖穿透單個受攻擊的表皮細胞的細胞壁受挫相符。因此野生型巡。基因作為病原體應(yīng)答的一種負向調(diào)節(jié)子發(fā)揮作用。這在W09804586中有說明。其它實例是隱性白粉菌抗性基因，是在篩選對二孢白粉菌(i"i^y/;/ec/c力oracearw邁)的易感性喪失的過程中凈皮發(fā)現(xiàn)的。至今已經(jīng)克隆了三個基因，稱為的戶#)^編碼一種果膠酸裂合酶-樣蛋白質(zhì)，PMR4編碼胼胝質(zhì)合酶，和PMR5編碼未知功能的蛋白質(zhì)。邁/o和/wr兩個基因似乎能夠特異性地引發(fā)對白粉菌的抗性，而非對卵菌如霜霉。已經(jīng)通過兩個主要方式獲得廣i普的病原體抗性，或系統(tǒng)形式的抗性如SAR。第一個是通過植物防御和細胞死亡的負調(diào)節(jié)子的突變，例如在擬南芥屬(Arabidopsis)的c/r，hcT和acd突變體中。第二個是通過植物防御的誘導(dǎo)物或調(diào)節(jié)子的轉(zhuǎn)基因過表達，例如在vV/^/過表達植物中。這些已知的抗性機理的缺點是除病原體抗性之外，這些植物通常顯示可檢測的附加和不良表型，例如生長受礙或自發(fā)形成的細胞死亡。本發(fā)明的一個目的是提供一種廣譜的，持久的而且不伴隨不良表型的抗性形式。在促成本發(fā)明的研究中，篩選對霜霉病病原體——寄生霜霉(輛/o;e,o/70，ra;ar3"'〃ca)的敏感度降低的擬南芥(々a6油"/sf力a//續(xù))突變體。在高度易感的擬南芥品系Leredsl-2中產(chǎn)生了EMS-突變體。詳細分析了八種霜霉抗性(突變體，對應(yīng)于6個不同的基因座。顯微鏡分析顯示，在所有的突變體中，寄生霜霉的生長被嚴重降低。d邁i^、^z/r4和fltei^的抗性與植物防御的組成型活化有關(guān)。此外，血rJ和rffiw^(但非還能夠抗丁香假單胞菌(Pseudomonassyringae)和6Wc^/"o/!7/ce51oro/7〃厶相比之下，在^z/W、rfa/i^和cfe/^"突變體內(nèi)沒有觀察到植物防御的活化增加。該研究結(jié)果已經(jīng)在VanDamme等人(2005)MolecularPlant-MicrobeInteractions18(6)583-592中被描述。但是該文章沒有公開DMR基因的鑒定和表征。cfei^突變體是在擬南芥Zerec^/-j背景下篩選易感性喪失時鑒定出的。"#7^基因現(xiàn)在已經(jīng)克隆并定性了。這樣，發(fā)現(xiàn)了/Wif就是基因At5g24530，該基因編碼了一種氧化還原酶(DNA及氨基酸序列在圖2中描述)。氧化還原酶是催化電子從一個分子(氧化劑)轉(zhuǎn)移到另一個分子(還原劑)上的一類酶。根據(jù)本發(fā)明，發(fā)現(xiàn)缺少功能性DMR6蛋白質(zhì)會導(dǎo)致霜霉病抗性的產(chǎn)生。因此本發(fā)明提供了一種植物，其對病毒、細菌、真菌或卵菌來源的病原體有抗性，特征為這種植物與不具對所述病原體有抗性的植物相比，具有降低水平的、降低活性的或者完全缺乏DMR6蛋白。這種抗性形式對下述的病原體特別有效卵菌門，比如白銹菌屬(J/一o)，絲嚢霉屬(J/7力s/o邁/ce51)，圓梗霉屬(勘^W一ors)，盤梗霉屬(Are/z//a),^ra/o/7erooc^/ora，戶ac力戸e"a，類霜霉屬(,sra/7ero/705770ra)，？ero,a5"c/a，霜疫霉屬(戶ero/7o/7力W力(zra)，霜霉屬(戶ero/7C^/7ora)，霜指霉屬(？erowc^c/eros;7ora)，戶//〃咖，疫霉屬(戶Ar帥力由ra)，單軸霉屬(/7as卿ara)，尸r"c^re歷/a，假霜霉屬(/^ef^/ojero加577ora)，指梗霉屬(5Wer0577ora)，f7e/7力o〃a物種，以及屬于真菌的病原體。根據(jù)本發(fā)明的抗性基于植物中DMR6蛋白質(zhì)的改變，具體而言是其水平降低、活性降低或完全缺失。"DMR6蛋白質(zhì)，，這一術(shù)語在這一點上涉及2Wi^基因產(chǎn)物，如由擬南芥屬中At5g24530基因編碼的蛋白質(zhì)。這種改變可以通過多種方式實現(xiàn)。在本發(fā)明的一個實施方式中，DMR6蛋白質(zhì)的水平降低是內(nèi)源/Wif基因表達減少的結(jié)果。減少內(nèi)源DMR6基因表達可以通過直接方法如基因沉默，或間接方法，通過修飾其調(diào)控序列或激活該基因的抑制來實現(xiàn)。可以在不同的水平實現(xiàn)調(diào)節(jié)DMR6基因以降低其活性或表達。首先，該內(nèi)源的基因可以被直接突變。這可以通過誘變處理獲得。備選地，可以通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)或通過漸滲雜交(introgression)將修飾的DMR6基因引入植物，或者可以在調(diào)控的水平上降低DMR6的表達，例如通過修飾調(diào)控序列或通過基因沉默。在本發(fā)明的另一個實施方式中，DMR6蛋白質(zhì)水平降低是"^(5"基因中的突變造成的，該突變導(dǎo)致DMR6的表達相對于無此突變存在的野生型DMR6基因降低，或?qū)е耺RNA或蛋白質(zhì)穩(wěn)定性降低。在一個具體的實施方式中，這是通過在DMR6的編碼序列中產(chǎn)生突變導(dǎo)致產(chǎn)生無功能DMR6蛋白質(zhì)(即沒有酶活性或酶活性降低)而實現(xiàn)的。在本發(fā)明的另一個實施方式中，表達降低可以通過轉(zhuǎn)錄水平或翻譯水平上/Wi6基因表達下調(diào)而實現(xiàn)，如，通過基因沉默或通過影響8/Wi^基因表達的突變。本發(fā)明基于在擬南芥屬中對寄生霜霉的抗性的研究，但這是可以更廣泛地應(yīng)用于植物的總構(gòu)思，具體而言是對病原體例如卵菌門和真菌感染敏感的農(nóng)作物。本發(fā)明適于由卵菌所引起的許多植物疾病，例如但不限于萵苣的萵苣盤梗霉(Are歷/a/a"wcse)，菠菜的粉霜霉(？ero/K^/7ora尸ar//70^)，葫蘆科成員例如黃瓜和甜瓜的古巴假霜霉(/^ewdo/7ero/c^/7oracw6e/^2's)，洋蔥的毀壞霜霉(尸ero/70s;70rafl^y^r"c"r)，十字花科成員例如巻心菜的寄生霜霉，葡萄的葡萄生單軸霉(尸/a^zzo/7aran7/co/a)，番茄和馬鈴薯的致病疫霉(戶力7"/^^力o"/"尸es"/^)，和大豆的大豆疫霉(戶A^o/力Moraso乂ae)。當通過遺傳修飾DMR6基因或通過鑒定DMR6基因的突變來改變植物中的/W)^"基因表達，而該基因仍未知時，必須首先對其進行鑒定。為通過遺傳修飾DMR6基因或通過鑒定DMR6基因中的突變而產(chǎn)生病原體-抗性植物，特別是農(nóng)作物，必須從這些植物物種中分離出直向同源的DMR6基因。各式各樣的方法可用于鑒定其它植物中的直向同源序列。鑒定植物物種中的DMR6直向同源序列的方法，舉例來說可以包含，在數(shù)據(jù)庫中鑒定該植物物種的DMR6EST;設(shè)計擴增完整DMR6轉(zhuǎn)錄物或cDNA的引物；用該引物進行擴增實驗，獲得相應(yīng)的完整轉(zhuǎn)錄物或cDNA;和測定該轉(zhuǎn)錄物或cDNA的核香酸序列。在僅部分編碼序列已知的情況下擴增完整的轉(zhuǎn)錄物或cDNA的適用方法，是高級PCR技術(shù)5，RACE,3，RACE,TAIL-PCR，RLM-RACE和小載體PCR(vectorettePCR)。備選地，如果得不到該目的植物物種的核香酸序列，就以與該目的植物密切相關(guān)的植物物種的DMR6基因來設(shè)計引物，基于通過多重核苷酸序列比對確定的保守結(jié)構(gòu)域，用于PCR擴增直向同源序列。這類引物是適當簡并的引物。評價指定序列是否為DMR6直向同源物的另一個可靠的方法是鑒定交互最佳命中(reciprocalbesthit)。當使用Blast程序，用擬南芥屬或別的植物物種的匿R6蛋白質(zhì)或DNA序列檢索時，一個指定植物物種的候選直向同源DMR6序列被鑒定為來自DNA數(shù)據(jù)庫的最佳命中。使用BlastX檢索法，檢索該指定植物物種的所獲的候選直向同源核苷酸序列與該DNA數(shù)據(jù)庫(例如在NCBI或TAIR)之中存在的所有擬南芥屬蛋白質(zhì)的同源性。如果最佳命中和得分是與擬南芥屬DMR6蛋白質(zhì)，則該指定DNA序列可以被描述為是直向同源物或直向同源序列。DMR6在擬南芥屬中由單個基因編碼，如從對這些才直物物種7>眾可獲得的完整基因組序列推導(dǎo)而來。已經(jīng)在稻3直向同源物基因組及白楊2直向同源物的基因組中鑒定出該基因。在至今試驗過的大部分其它植物物種中，DMR6似乎是由單個基因編碼，如通過分析來自公共DNA數(shù)據(jù)庫的mRNA序列和EST數(shù)據(jù)而確定的。用公共數(shù)據(jù)庫之中存在的信息，通過核苷酸和氨基酸比較，鑒定這些植物中的直向同源基因和蛋白質(zhì)。備選地，如果得不到所需植物物種的DNA序列，可通過異源雜交分離直向同源序列，其中使用擬南芥屬或其他植物的DMR6基因的DNA探針，或者通過PCR方法，利用在DMR6編碼序列中的保守結(jié)構(gòu)域來限定引物。對于許多作物物種，可得到能夠用于設(shè)計引物的部分DMR6mRNA序列，用于隨后PCR擴增完整mRNA或基因組序列，以進行DM序列分析。在一個具體的實施方案中，直向同源物是基因，其編碼的蛋白質(zhì)與擬南芥屬DMR6蛋白質(zhì)(A"g24S30)或其它植物DMR6蛋白質(zhì)具有至少50%同一性。在一個更具體的實施方案中，同一性是至少55%,更具體地60%，更具體地65%，70%，75%,80%,85%,90%，95%或99%。圖1顯示在/>眾可用的數(shù)據(jù)庫中鑒定的以及通過對cDNA進行PCR擴增且隨后測序而獲得的直向同源DMR6序列(表1中進行描述)。鑒定直向同源賜R6序列后，調(diào)控以及編碼序列的完整核苷酸序列。對此，通過用來源于已知的DMR6基因的探針或《j物進行DNA雜交或PCR，篩選該植物物種的基因組文庫，用于鑒定含有iW^"基因的基因組克隆。備選地，高級的PCR方法，例如RNA連接酶介導(dǎo)的RACE(RLM-RACE)，可用于直接從基因組DNA或反轉(zhuǎn)錄的raRNA擴增基因以及cDNA序列。DNA測序隨后即可表征該完整的基因或編碼序列。一旦已知該基因的DNA序列，將該信息用于制備以調(diào)節(jié)/Wi(f基因表達的手段。為獲得降低的DMR6蛋白活性，可以通過氨基酸替換下調(diào)DMR6基因的表達，或降低該DMR6蛋白質(zhì)的酶活性，所述替換來自DMR6編碼序列中核苷酸的改變。在本發(fā)明的一個具體實施方式中，DMR6基因表達的下調(diào)是使用RMi通過基因-沉默獲得。為此，產(chǎn)生表達DMR6反義構(gòu)建體、最優(yōu)化的微-RNA構(gòu)建體、反向重復(fù)構(gòu)建體或聯(lián)合的有義-反義構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植物，以便產(chǎn)生能導(dǎo)致基因沉默的相應(yīng)于DMR6的dsRM。在備選的實施方案中，通過RNAi下調(diào)了DMR6基因的一種或多種調(diào)節(jié)子(在轉(zhuǎn)錄激活子的情況下)。在另一實施方案中，調(diào)節(jié)子通過轉(zhuǎn)基因過表達被上調(diào)(在阻遏蛋白的情況下)。在一個具體的實施方案中，通過從強啟動子表達DMR6基因的阻遏蛋白獲得過表達，強啟動子例如通常用于植物生物技術(shù)的35S啟動子。還可以通過在啟動子，終止子區(qū)域或可能的內(nèi)含子中調(diào)控元件的誘變獲得DMR6基因的下調(diào)。在很多情況下，/W)^f編碼序列中的突變導(dǎo)致氨基酸替換或成熟前終止密碼子，其負向影響所編碼的DMR6蛋白質(zhì)的表達或活性。通過使用誘變化學(xué)物質(zhì)例如乙基甲磺酸酯(EMS),用y射線或快中子照射植物材料，或用其它方式，在植物中誘導(dǎo)這些突變。產(chǎn)生的核苷酸改變是隨機的，但是在經(jīng)誘變處理植物的一個大集合中，DMR6基因中的突變可以使用TILLING(基因組中的靶向誘導(dǎo)的局部損害)方法(McCallum等人(2000)Targetedscreeningforinducedmutations.Nat.Biotechnol.18，455—457，以及Henikoff等人(2004)TILLING.Traditionalmutagenesismeetsfunctionalgenomics.PlantPhysiol.135，630—636)容易地鑒定。該方法的原理是基于從M2代經(jīng)誘變植物的大集合的基因組DNA中PCR擴增目的基因。通過DM測序或通過使用單鏈特異性核酸酶例如CEL-I核酸酶尋找點突變(Till等人(2004)Mismatchcleavagebysingle-strandspecificnucleases.NucleicAcidsRes.32,2632-2641)，鑒定了在目的基因中具有突變的個體植物。通過篩選許多植物，獲得了突變等位基因的大集合，每個對基因表達或酶活性產(chǎn)生不同影響。例如基因表達或蛋白質(zhì)水平可以如下測試通過分析DMR6轉(zhuǎn)錄物的水平(例如通過RT-PCR)，或者用抗體定量DMR6蛋白質(zhì)水平。然后對具有所需降低了的DMR6水平或iW)^表達的植物進行回交或者與其他種系雜交，以便只將所需的新等位基因轉(zhuǎn)移到所需作物的背景中。本發(fā)明進一步涉及突變的DMR6基因。在特定實施方式中，本發(fā)明涉及具有成熟前終止密碼子的dmr6等位基因，如dmr6-l等位基因。在另一實施方案中，本發(fā)明涉及萵苣、黃瓜以及菠菜的DMR6基因的突變型，如圖3-5所示。本發(fā)明證實不具有或者具有降低水平的功能性DMR6基因產(chǎn)物的植物顯示出對病原體，特別是卵菌和真菌來源病原體的抗性。利用這些知識，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以鑒定給定植物物種的至今未知的天然變體，其具有導(dǎo)致功能性DMR6蛋白質(zhì)的水平降低或缺失的DMR6基因變體、或DMR6蛋白質(zhì)的突變形式，以及根據(jù)本發(fā)明使用這些天然變體。本發(fā)明進一步涉及使用DMR6啟動子為植物提供疾病抗性，即，為植物提供對病毒、細菌、真菌或卵菌來源的病原體的抗性。根據(jù)本發(fā)明，已經(jīng)證實DMR6響應(yīng)病原體感染應(yīng)答而轉(zhuǎn)錄上調(diào)。轉(zhuǎn)錄物分析及啟動子DMR6-報告子品系二者都支持了該發(fā)現(xiàn)(見實施例1，下文)。因此，根據(jù)本發(fā)明的可被病原體誘導(dǎo)的DMR6啟動子對控制導(dǎo)致植物的疾病抗性的可誘導(dǎo)系統(tǒng)的表達尤其有用。這種可誘導(dǎo)系統(tǒng)的一個實例導(dǎo)致在植物中產(chǎn)生了疾病抗性，且其中根據(jù)本發(fā)明的DMR6啟動子是有效的，例如在WO99/45125中有所描述，其中，對于一個與C-5卟啉代謝途徑調(diào)控相關(guān)基因的反義核苷酸序列可操作地連接到一個可被病原體誘導(dǎo)的啟動子上，并用于轉(zhuǎn)化植物細胞。該反義核苷酸序列在對病原體應(yīng)答時產(chǎn)生表達，從而有效地破壞了被轉(zhuǎn)化植物細胞的卟啉代謝，而且破壞了包含病原體擴散的局部損害的產(chǎn)生。WO96/36697還公開了導(dǎo)致植物中疾病抗性的可誘導(dǎo)系統(tǒng)，其中可誘導(dǎo)啟動子控制了一種蛋白質(zhì)的表達，該蛋白質(zhì)能夠激發(fā)植物中的超敏應(yīng)答。EP0474857進一步公開了在植物中誘導(dǎo)產(chǎn)生病原體抗性的方法，包括用編碼病原體-衍生-無毒-基因/植物-衍生-抗性-基因這一對的多聚核苷酸序列轉(zhuǎn)化植物，其中一種或兩種誘導(dǎo)子肽的表達及抗性基因的表達都由可被病原體誘導(dǎo)的啟動子調(diào)控。導(dǎo)致植物中產(chǎn)生病原體抗性的可誘導(dǎo)系統(tǒng)進一步的實例在例如WO98/32325中有所描述。在一個具體優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明涉及為植物提供疾病抗性的方法，包括用含有至少一種可表達核酸的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細胞，其中可表達核酸被可操作地連接到可被病原體誘導(dǎo)的啟動子上，該啟動子在植物細胞中可以操作，并且從所述的植物細胞中再生出轉(zhuǎn)化的植物，其中可被病原體誘導(dǎo)的啟動子為DMR6啟動子，且其中可表達核酸的表達賦予該轉(zhuǎn)基因植物疾病抗性。本發(fā)明還涉及通過所述方法獲得的疾病抗性植物，及植物組織和由所述植物獲得的種子。本發(fā)明具體而言涉及對病毒、細菌、真菌或卵菌來源的病原體有抗性的植物，其中的植物在其基因組內(nèi)含有DNA構(gòu)建體，該構(gòu)建體含有至少一種可表達核酸，該核酸可操作地連接到可被病原體誘導(dǎo)的啟動子上，其中所述可被病原體誘導(dǎo)的啟動子為DMR6啟動子。本發(fā)明還涉及DM構(gòu)建體本身，其含有至少一種可表達核酸，該核酸可操作地連接到可被病原體誘導(dǎo)的啟動子上，其中所述可被病原體誘導(dǎo)的啟動子為DMR6啟動子。本發(fā)明的構(gòu)建體可用來轉(zhuǎn)化能再生為轉(zhuǎn)化植物的植物細胞。而且，可以得到轉(zhuǎn)化的植物組織和種子。將本發(fā)明構(gòu)建體引入植物細胞的合適的方法為技術(shù)人員所知。根據(jù)本發(fā)明，通過"可操作性連接"指啟動子和可表達核酸，如將基因通過能使可表達核酸(例如基因)由啟動子起始轉(zhuǎn)錄的方式連接。通過"可表達核酸，，所指的是可在細胞中表達的核酸(如，基因或基因的部分)，即能轉(zhuǎn)錄為mRNA并最終可被翻譯成蛋白質(zhì)的核酸。這種可表達核酸可以是基因組DNA、cDNA或化學(xué)合成DNA或其任何組合形式。根據(jù)本發(fā)明，DNA構(gòu)建體包括所有使特定核酸在細胞中表達(即轉(zhuǎn)錄)的必需核酸元件。該構(gòu)建體典型地含有可表達核酸(即要轉(zhuǎn)錄的核酸)和啟動子。該構(gòu)建體能適當?shù)卣系饺缳|(zhì)?；蛟泽w中?？杀磉_核酸優(yōu)選的為參與植物防御應(yīng)答的基因，如，與植物的超敏應(yīng)答(hypersensitivityresponse)相聯(lián)系的基因。在植物的超敏應(yīng)答(HR)中，植物在病原體侵入的位點通過一種自殺機制的誘導(dǎo)表達產(chǎn)生局部細胞死亡，該自殺機制應(yīng)答病原體而觸發(fā)所述的局部細胞死亡。通過這種方式，僅僅犧牲了少量植物細胞，病原體擴散就被有效地阻滯。參與植物防御反應(yīng)的所述基因的實例有調(diào)控蛋白質(zhì)醒1/N皿(Friedrichetal.，Mol.PlantMicrobeInteract.14(9):1114-1124，2001)和轉(zhuǎn)錄因子MYB30(Vai1leauetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA99(15):10179-10184，2002)。在一個具體的實施方式中，可表達核酸編碼了一種自體或異源的多肽，其能賦予植物疾病抗性。通過"自體多肽"所指的是轉(zhuǎn)化的植物細胞中由轉(zhuǎn)化植物細胞天然產(chǎn)生的基因表達出的任何多肽。通過"異源多肽"所指的是轉(zhuǎn)化的植物細胞中由相對于轉(zhuǎn)化植物細胞部分或完全外源(即不是由該轉(zhuǎn)化植物細胞天然產(chǎn)生)的基因表達出的任何多肽。這種多肽的實例有哺乳動物Bax蛋白質(zhì)，其編碼一種促凋亡蛋白質(zhì)并導(dǎo)致植物中細胞死亡(Lacomme和SantaCruz,Proc.Natl.Acad.Sci.USA96(14):7956-61，1999)，及真菌幾丁質(zhì)酶(delasMercedesDanaetal.，Plant25Physiol.142(2):722-730，2006)。優(yōu)選地，DMR6啟動子為擬南芥屬DMR6啟動子。DMR6啟動子包括擬南芥眉漢6編碼區(qū)域(ATG起始密碼子)上游的3000bp的區(qū)域并包括5，UTR區(qū)域。優(yōu)選地，匿R6啟動子包括如圖11中所定義的核酸序列，和/或任何其功能性片段，即仍能起始與其可操作性相連的可表達核酸轉(zhuǎn)錄的所述序列的任何片段(或部分)，和/或其天然變體，即該啟動子的天然變體，其可能含有小的多態(tài)性，但一般至少具有90%的同一性。在另一個優(yōu)選的實施方式中，DMR6啟動子為直向同源DMR6啟動子，即直向同源DMR6基因的啟動子。鑒定DMR6直向同源物的方法在下文實例2中有描述。一旦鑒定了DMR6直向同源物，則本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠使用標準分子生物學(xué)技術(shù)分離所述直向同源物各自的啟動子。根據(jù)本發(fā)明，證明DMR6啟動子能^皮病原體強烈地誘導(dǎo)，且DMR6啟動子在其他非感染組織中沒有高表達。因此，這是非常適合的啟動子，可用于為植物提供對病毒、細菌、真菌或卵菌來源的病原體抗性的可誘導(dǎo)系統(tǒng)。使用本發(fā)明的DMR6啟動子的可誘導(dǎo)系統(tǒng)能適用的具體病原體和植物的實例在上文中給出。在下面實施例中舉例說明了本發(fā)明，但并非旨在以任何方式限制本發(fā)明。在實施例中參考下列附圖。表1顯示擬南芥屬DMR6mRM及來自其他植物物種直向同源物序列的Genbank登錄號及Genlnfo標識符。表2顯示用于基于圖語的DMR6克隆的標記物的PCR引物。表3顯示在合適的植物表達載體中克隆血r6直向同源物的引物對。圖l顯示擬南芥的DMR6蛋白質(zhì)和來自耬斗菜物種(j^/27eg/as/ec/es)、甜橙(s/z7e/^2's)、中果咖啡(Co/7"eaca力e/7力ora)、黃瓜(^/c膨？、陸地棉(^ys/;7/"邊力/m7咖)、萵苣(s"/m)、蒺藜苜覆"w3C"w/a)、稻(。r，s"/^2)(3)、毛果楊(Populustrichocarpa)(2)、番癡(5Wa"咖//cm'c"/z7)(2)、高梁(5"oi^力"歷6/co/c>r)、菠菜(加'/7ac/ao/eracea)、葡萄(f7〃s7//7/尸era)、玉米(Zea邁a/s)及姜(///7^76er0/77"'/a/e)的直向同源物的氨基酸序列的比對，使用CLUSTALW(1.83)多重序列比對程序(EBI)。在序列下方保守氨基酸以點標明，相同的氨基酸用星號標明。圖2分別顯示擬南芥DMR6基因(At5g24530，gi42568064，GenbankNM-122361)和蛋白質(zhì)(gi15238567，GenbankNP—197841)的核酸及氨基酸序列序列。圖3分別顯示萵苣的DMR6直向同源物的核酸和衍生氨基酸序列。圖4分別顯示菠菜的DMR6直向同源物的核酸和衍生氨基酸序列。圖5顯示了黃瓜和甜瓜的DMR6直向同源物的核酸和衍生氨基酸序列。圖6顯示擬南芥屬^w^突變體的霜霉病抗性。(a)定量接種后7天，ctor(5W突變體(BC2，E37品系)相對其親本品系LerWW-2上寄生霜霉分離林Waco9形成的分生孢子梗的定量；及oto/^-2突變體(FLAG_445D09T-DNA品系)相對其親本品系Ws-4上寄生霜霉分離林Waco9形成的分生孢子梗的定量。(b)在^z7rf-7突變體中通過與At5g24530互補重建易感性。定量Leredsl-2，dmr6-1及5號互補品系((#1H、l22、211、231和241)上每毫克苗重的寄生霜霉孢子。圖7顯示擬南芥屬/Wi^f基因及^zw6-7和^z/i^-2突變的結(jié)構(gòu)。/Wi^基因含有4個外顯子，編碼序列為1026個堿基。指出了兩個等位基因；dmr6-l在2號外顯子上有一個堿基改變，dmr6-2的2號內(nèi)含子中插入了一個T-DNA。圖8顯示在空白處理的Ler植物中或接種了兼容或非兼容寄生霜霉分離抹的Ler植物中，ZWj^的相對轉(zhuǎn)錄物水平。接種后不同日期確定轉(zhuǎn)錄物水平。周期閾值(ACT)的差異反映了達到相對于^C77;^任意閾值產(chǎn)物濃度所需的附加的PCR擴增循環(huán)數(shù)。較低的ACT值表明了較高的轉(zhuǎn)錄物水平。圖9顯示DMR6啟動子-報告子(pDMR6::GUS)構(gòu)建體在轉(zhuǎn)基因擬南芥屬品系中的表達，通過僅以X-gluc(圖d和e)或品紅-Xgluc(圖a-c)作底物和寄生霜霉生長的臺盼藍染色來觀察。(a)Lere"/-2(p/y^沃GUS)以寄生霜霉，Cala2分離林接種后3天，(b)Co卜0(p/W76:GUS)以寄生霜霉，Waco9分離林接種后3天，(c)LerecTW-2(p/Wi6::GUS)以寄生霜霉，Emoy2分離林接種后3天，(d)Co卜0(p"膽6:GUS)創(chuàng)傷后3天，(e)Col-0(p/M沃GUS)BTH使用后3天。圖IO顯示這些基因的轉(zhuǎn)錄物水平的Q-PCR分析；選擇At4g14365、Atlgl4880、ACD6、PR-1、PR-2和PR-5，因為它們在ctorf-7微陣列分析中顯示上調(diào)。(a)這六個基因在t/邁r^-7中相對于Lerecrw-2的轉(zhuǎn)錄水平以及另外的DMR6轉(zhuǎn)錄物。(b)^w^-2相對于Ws-4,六個防御相關(guān)基因的基因轉(zhuǎn)錄物增加。ACT反映了達到^677#2轉(zhuǎn)錄物水平所需的附加的PCR循環(huán)數(shù)。較低的ACT值表明了較高的轉(zhuǎn)錄物水平。圖11顯示DMR6基因起始密碼子上游的3kb區(qū)域的核苷酸序列。擬南芥的(at5g24530)，包括啟動子和5，-UTR(下劃線部分)。圖12分別顯示了番茄的DMR6直向同源物的核酸和衍生氨基酸序列。圖13分別顯示了本生煙(iV/co〃a/7a6e/^力s邁/a"a)的DMR6直向同源物的核酸和衍生氨基酸序列。圖l4顯示了擬南芥屬flT邁i^-7與來自甜瓜(Cs)、菠菜(So)、萵苣(Ls)和番茄(Sl)的DMR6的互補。實施例1擬南芥屬DMR6(At5g24530)基因為霜霉病易感性所需要實驗步驟寄生霜霉生長和感染寄生霜分離林Wco9由M.Aarts博士(WUR，Wageningen，NL)提供，Cala2分離抹由E.Holub博士(WarwickHRI，Wellsbo證e，UK)提供,分別在擬南芥屬Ws-0和Ler上維持生長。每周將培養(yǎng)液(400000孢子/ml)用噴槍轉(zhuǎn)移至lO天大小的健康幼苗(Holub，E.B.等人，Mol.PlantMicrobeInteract.7:223-239，1994)。幼苗在空氣中干燥大約45分鐘并在生長室里置于封口蓋下于相對濕度100°/。、16'C下培養(yǎng)，每天給予9小時光照(100mE/m2/s)。在接種之后(dpi)7天定量孢子形成水平，可以通過計數(shù)每個幼苗產(chǎn)生的分生孢子梗，每個試驗品系至少需要40個幼苗(圖6a)，或者可以通過在5dpi在水中分離孢子并確定孢子濃度，得出每mg葉組織的孢子數(shù)(圖6b)。產(chǎn)生回交的ofei^品系dmr6突變體與親本品系Lere^y/-2及Ler回交兩次(BC2)。通過PCR分析就野生型f/57基因選擇用Ler產(chǎn)生的BC2品系。克隆/Wi^通過使用Cereon數(shù)據(jù)庫設(shè)計的PCR標記物完成fltor6基因的精確作圖，鑒定出Col-O和Ler之間插入和缺失(IND)的差異。標記物At5G24210基因中IND—M0P9;At5G2442Q基因中IND—K16H17;At5G24820基因中IND一T4C12;At5G24950—60基因中畫一T11H3及At5G25270基因中IND—F21J6，這些用來作圖(表2)。對新重組體的附加篩選起始于300個Fz植物，得到兩個IND的標記物IND-M0P9與IND-T4C12之間的8個F2重組植物，這兩個標記物在61個基因的兩側(cè)。7個附加的標記物(M450-M590;表2)將區(qū)域減少到At5g24420與At5g24590之間的cfei^基因座的18個候選基因。At5g24530的序列分析表明有一個點突變導(dǎo)致了^/r6-7突變體中2號外顯子內(nèi)的一個終止密碼子。cr邁rf的T-DNA插入品系的鑒定鑒定了第二個d/JW^等位基因，445D09,在Ws-4隱性背景中由INRAVersailles產(chǎn)生的FLAGT-DNA插入品系。用在At5g24530基因中設(shè)計的引物——LP引物(5，-caggtttatggcatatctcacgtc-3，)，結(jié)合T-DM右邊界引物Tag3,(5，一ctgataccagacgttgcccgcataa-3，)或RB4(5,-tcacgggttggggtttctacaggac-3，)進行PCR證實了此T-腿插入。At5g24530第二個內(nèi)含子中精確的T-DNA插入是通過測序由來自左右邊界T-DNA引物結(jié)合基因特異性引物L(fēng)P或RP(5，-atgtccaagtccaatagccacaag-3，)擴增出的擴增子而得到的。cDNA合成RNA(來自IO天幼苗的大約100mg葉組織)用RNaesy試劑盒(Qiagen，Venlo，TheNetherlands)提取并用無RNase的DNase試劑盒(Qiagen)處理?？俁NA用UVmini-1240分光光度計(Shimadzu，KyotoJapan)定量。cDNA用SuperscriptIII逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen，Carlsbad,CA，USA)及oligo(dT)15(Promega，Madison,WI，USA)按照制造商說明書合成。fl^r(f-7突變體的互4卜通過4吏用才艮癌農(nóng)牙干菌(J^ro6a"er/w7fwzze/ac/e/Ly)的浸花法(floraldipmethod,CloughandBent，1998)轉(zhuǎn)化cT邁rf植物而產(chǎn)生互補品系，該根癌農(nóng)桿菌含有在35S啟動子后的、來自Co卜O的At5g24530基因。該構(gòu)建體通過PCR擴增來自Col-0cDNA的全長At5g24530而產(chǎn)生，所用引物含有定向克隆所用的限制性位點。正向引物(5，-ttctgggatccaATGGCGGCAAAGCTGATATC—3，)含有一個靠近起始密碼子(ATG)的BamHI限制性位點，擴增/v^5"的5，-末端且用反向引物(5，-gatatatgaattcttagttgtttagaaaattctcgaggc-3，)在終止密碼子之后的3，-末端產(chǎn)生了一個EcoRI位點。將35S-ZM^-Tn克隆到pGreenl10229(Hellens，R.P.，Edwards,E.A.，Leyland，N.R.，Bean，S.，andMul1ineaux，P.M.(2000))中。pGreen是一個多用途且靈活的二元Ti載體，用于土壤桿菌屬介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化(PlantMol.Biol.42，819-832)。分離對300fiM的DL-草胺膦(BASTA)抗性的幼苗，分析其寄生霜霉易感性及通過RT-PCR分析其DMR6表達水平。通過RNAi建立DMR6的敲減(Knockdown)品系在Lere^y7-2和Col-0的背景中產(chǎn)生RNAi品系。產(chǎn)生了Col-0At5g24530基因的782bp長的cDNA擴增子。用PhusionDNA聚合酶(2UL)并使用兩套不同的引物組合完成該PCR反應(yīng)。來自第一套DMR6基因特異性引物組合(RNA匿R6F:5，-aaaaagcaggctGACCGTCCACGTCTCTCTGAA-3，和RNAiDMR6R:5，-AGAAAGCTGGGTGAAACGATGCGACCGATAGTC-3，)的擴增子用作第二輪PCR擴增的模板，這輪擴增用的是允許重組進GateWay克隆系統(tǒng)的pD0NR7載體的通用引物。第二輪PCR中，使用了10jil第一輪PCR(98。C變性30sec;接著為10個循環(huán)98°C10sec;58°C30sec;72°C30sec)產(chǎn)物作為模板，在總體積20pl中。第二輪PCR以attBl(5,-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3,)及attB2(5，-ggggaccactttgtacaagaaagctgggt-3，)為引物在50jil反應(yīng)體系中進行(變性30sec;接著是5個循環(huán)98°C10sec;45。C30sec;72°C30sec及20個循環(huán)98°C10sec;55匸30sec;72°C30sec;最后是72。C下進行最后一步10min的延伸)。PCR產(chǎn)物經(jīng)過凝膠純化后，4吏用克隆酶BP酶將50ng片段重組入150ng的pD0NR7載體中。將載體轉(zhuǎn)化入電感受態(tài)(electrocompotent)DH5a大腸桿菌細胞，并且分離含有正確插入片段的質(zhì)粒，將具有DMR6擴增子的100ngpD0NR7用于LR反應(yīng)從而將插入片段以兩個相反方向重組入150ng的pHellsgate8載體中。在轉(zhuǎn)化入大腸桿菌之后，選取spectomycin抗性克隆，分離的質(zhì)粒通過經(jīng)Notl消化得到正確的片段大小及通過對At5G24530的一個單內(nèi)部引物(DfragmentF:5，-gagaagtgggatttaaaatagaggaa-3，進行菌落PCR來驗證，如果插入片段以相反的方向插入2次，則能夠檢測稻1420bp的擴增子。將具有相反方向的雙插入片段的正確pHellsgate8質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入電感受態(tài)土壤桿菌屬菌林C58C1。從土壤桿菌分離質(zhì)粒，并再次轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中以通過No11消化驗證質(zhì)粒和插入片段的正確大小。經(jīng)過再次驗證的土壤桿菌屬菌林用于浸花法轉(zhuǎn)化Col-O和LerecTW-植物。在1/2xGM平板上就卡那霉素抗性篩選得出的種子，移出Ti幼苗，下一代種子T2用于分析DMR6表達及寄生霜霉易感性。按上文所述的方法分離總RM。通過MessageAmpaRNA試劑盒(Ambion)擴增mRNA。CATMA陣列(Croweetal.,2003)片上含有大約25000個基因特異性標簽，將其按deJong等人描述的標準化條件(deJongM.，vanBreukelenB.，Wittink,F.R.，Menke,F丄，Weisbeek,P.J.,及VandenAckervekenG.(2006)。Membrane—associatedtranscriptsinArabidopsis;theirisolationandcharacterizationbyDMmicroarrayanalysisandbioinformatics.PlantJ.46,708—721)進行雜交。cDNA才莫板按前述方法產(chǎn)生，用于定量PCR。用ABIPRISM7700序列檢測系統(tǒng)(AppliedBiosystems,FosterCity,CA，USA),使用SYBRGreenI(AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity,CA，USA)作為才艮告子染料重復(fù)三次測定每個轉(zhuǎn)錄物的循環(huán)閾值。轉(zhuǎn)錄物的引物對為ZWi^(QDMR6F:5,-TGTCATCAACATAGGTGACCAG-3，和QDMR6R:5，-CGATAGTCACGGATTTTCTGTG-3，)，Atlgl4880(QAtlgl4880F:5，-CTCAAGGAGAATGGTCCACA—3,和QAtlgl4880R:5，-CGACTTGGCCAAATGTGATA-3，)，At4gl4365(QAt4gl4365F:5，-TGGTTTTCTGAGGCATGTAAA-3，和QAt4gl4365R:5，-AGTGCAGGAACATTGGTTGT-3,),ACD6(QACD6F:5，-TGGACAGTTCTGGAGCAGAT-3，和QACD6R:5，-CAACTCCTCCGCTGTGAG-3，)，PR-5(QPR-5F:5，-GGCAAATATCTCCAGTATTCACA-3，和QPR-5R:5'-GGTAGGGCAATTGTTCCTTAGA-3，)，PR-2(QPR-2F:5，-AAGGAGCTTAGCCTCACCAC-3，和QPR-2R:5，-GAGGGAAGCAAGAATGGAAC-3，)，PR-1(QPR-1F:5，-GAACACGTGCAATGGAGTTT-3，和QPR-1R:5，-GGTTCCACCATTGTTACACCT-3，)和ACT-2(QACT2F:5，-AATCACAGCACTTGCACCA-3，和QACT2R:5,-GAGGGAAGCAAGAATGGAAC-3，)，產(chǎn)生100個堿基對的片段。結(jié)果fl^/^突變體中負責(zé)病原體抗性的基因的特征VanDamme等人2GO5,如上文所述公布了一種對寄生霜霉有抗性的dmr6突變體?？剐运娇梢酝ㄟ^計數(shù)接種寄生霜霉(分離株Waco9或Cala2，得自G.VandenAckerveken博士，Plant-MicrobeInteractionsGroup,Utrecht大學(xué)，Utrecht,NL)后七天每個幼苗的分生孢子梗的數(shù)目而檢驗。親本品系Ler(Parker等人，1996，PlantCell8:2033-2046)是高度易感的，其被用作陽性對照(定為100%)。圖6a顯示，相對于親本品系的幼苗，感染的ctoi^突變體上分生孢子梗的形成減少了，其中顯示了與親本品系Lere^s7-2回交兩次的霜霉病抗性血^^-/突變體及突變體o^nf-2(FLAG-445D09T-DNA品系)上寄生霜霉Waco9的孢子形成(分生孢子梗/幼苗)相對于對照品系的定量結(jié)果。根據(jù)本發(fā)明，vanDamme等人，2005，如上文，其中描述的dmr6突變體中負責(zé)對寄生霜霉抗性的基因通過作圖和測序候選基因的組合而被克隆。之前，將隱性d邁r6突變作圖在5號染色體上的ngal39標記物附近，在包含74個基因的區(qū)域內(nèi)。精確的作圖將dmr6基因座關(guān)聯(lián)到位于相應(yīng)基因上的、標記物At5g24420和At5g24590之間含有BACsT13K7和K18P6的一個作圖區(qū)間。這j吏得dmr6區(qū)間;故限定在一個含18個候選基因的區(qū)域。對dmr6及親本品系Lere^/-2中的18個基因的比較序列分析揭示了At5gM530基因第二個外顯子上有一個點突變。這個G變成了A的單堿基突變對于EMS突變是典型的，它將編碼序列的核苷酸691號位TGG(trp密碼子)變成了TGA(成熟前終止密碼子)(圖7)。這個提前的終止密碼子將342個aa的預(yù)期氧化還原酶在保守催化結(jié)構(gòu)域之前的141號位置截短了，說明d/zzLnf是個無功能等位基因。預(yù)期At5g24530編碼序列(圖2)編碼分子量為39.4kDa的蛋白質(zhì)。目前還沒有描述At5g24530的生物學(xué)功能。At5g24530就是層f在來自INRA，Versailles的突變體集合的T-DNA插入品系(FLAG—445D09)中鑒定出第二個等位基因，dmr6-2。T-DM插入片段在At5g24530的第二個內(nèi)含子當中的存在以及位置(圖7)通過PCR和序列分析而確定(數(shù)據(jù)未顯示)。對T-DNA插入片段為純合的FLAG-445D09品系子代對寄生霜霉分離林Waco9有抗性，而親本品系(Ws-4)對其易感(圖6a)。At5g24530轉(zhuǎn)錄物可以使用在Ws-4中2、3號外顯子中的引物通過RT-PCR來擴增，但不能用純合的^r^-2^^^Wf/參f炎凝,^^乂，表明可認為dmr6-2是第二個無功能等位基因。為確證At5g24530是對寄生霜霉易感性所必需的這一想法，cte/^-7突變體用來自At5g24530的、^皮克隆受35S啟動子控制的cDM進行轉(zhuǎn)化。在五個獨立cto/^-7T2幼苗中，通過RT-PCR所證實At5g24530的強烈過表達(數(shù)據(jù)未顯示)。所有對轉(zhuǎn)基因純合的T3品系都顯示重建了對寄生霜霉分離林Cala2的易感性(圖6b)，這證實了At5g24530就是/Wi^。該互補與兩個相互獨立的cto/^突變體的鑒定一起清楚表明了對寄生霜霉的易感性需要功能性/#)^基因。/WWf在寄生霜霉感染期間被轉(zhuǎn)錄激活為研究寄生霜霉感染期間的"#)^表達，從接種后第0天(2小時)到接種后(dpi)第5天的6個不同時間點，通過定量PCR測量相對轉(zhuǎn)錄物水平(圖8)。從10天的Ler幼苗分離RNA，這些幼苗分別用水(空白)、兼容或非兼容的寄生霜霉分離林而噴灑接種。接種后2小時(Odpi)不同處理中的DMR6轉(zhuǎn)錄物水平相等。從1dpi起，兼容或非兼容相互作用中的幼苗與空白處理幼苗相比，/Wv^轉(zhuǎn)錄物水平顯著增加。1dpi時非兼容相互作用(ACT為3.5，大約有l(wèi)l倍的誘導(dǎo))中DMR6轉(zhuǎn)錄物水平略微提高但比兼容相互作用(ACT為3.0,大約有8倍的誘導(dǎo))中的顯著更高。表達水平隨時間進一步提高，在4-5dpi時達到穩(wěn)定的高水平。在這些時間點上，/Wi^轉(zhuǎn)錄物水平在兼容相互作用中比在非兼容相互作用中更高。在兼容和非兼容寄生霜霉相互作用期間升高的DMR6轉(zhuǎn)錄物水平提示/Wi^f在植物防御中起作用。在我們的三種防雄卩增強突變體d邁r乂^z/r4和(VandenAckerveken等人，未發(fā)表)中都證實了DMR6的防御相關(guān)表達。而且，在GenevestigatorMutantSurveyor中進行的"#>^水平計算機模擬分析(Zimmermann，P.，Hennig，L.,和Gruissera，W.(2005).GeneexpressionanalysisandnetworkdiscoveryusingGenevestigator.TrendsPlantSci.10,407—409)表明該基因纟且病原體抗性突變體邁/7W和c/7rJ中強烈被誘導(dǎo)。在cpr5/nprl雙突變體中，DMR6轉(zhuǎn)錄物維持高水平表明/Wi^表達的誘導(dǎo)大部分是不依賴于^ZV7的。水楊酸似乎是衰老時DMR6表達誘導(dǎo)時一個重要信號，因為/za^7轉(zhuǎn)基因植物(表達細菌水楊酸水解酶基因)只有低水平的/WW6轉(zhuǎn)錄物。為更詳細研究/Wi^的表達是如何在生物和非生物壓力下激活的，產(chǎn)生/Wi^"報告品系。在轉(zhuǎn)基因Co卜0和Lere^/-2植物中研究了/WWf表達的定位，所述植物含有連接于"/W(beta-葡萄糖苷酸酶GUS)報告基因(pDMR6::GUS)的/W;^啟動子。為觀察寄生霜霉菌絲生長，使用臺盼藍染色，為觀察GUS活性，使用品紅-Xgluc作為P-葡萄糖苷酸酶底物產(chǎn)生品紅沉淀。在未感染的植物中，不同植物器官——根、分裂組織、花、花粉和種子中都沒有檢測到GUS表達。"yWf的表達在兼容相互作用中被誘導(dǎo)——感染了Cala2的Lere&7-2(圖9a)及感染了分離抹Waco9的Col-0(圖9b)。GUS表達還在非兼容相互作用一一用分離株Emoy2接種的LerecTW-2——中被誘導(dǎo)(圖9c)。如圖9a和9b所顯示的，ZW)^表達限定在其中寄生霜霉已經(jīng)形成吸器的細胞當中。含有最新形成的吸器的植物細胞沒有顯示出可檢測的GUS活性水平(圖9a，用星號表示)。在非兼容相互作用中(圖9c),ZM6啟動子的活性只能在與初始侵入菌絲接觸的細胞中檢測到。在由超敏應(yīng)答(HR，通過臺盼藍染色所顯示，圖9c中用星號標明)導(dǎo)致死亡的細胞中未能檢測到GUS活性，可能是由于這些細胞中的蛋白質(zhì)降解。為測試含吸器細胞中^漢6的表達是否由類創(chuàng)傷應(yīng)答引起，用剪刀切割損傷幼苗，并在3天后就GUS活性染色。沒有觀察到可檢測的啟動子/W)f的GUS表達，表明/iW漢f的表達不是由創(chuàng)傷誘導(dǎo)的(圖9d)。而且，測試/Wi^表達的局部誘導(dǎo)對苯丙噻二唑(BTH，一種水楊酸(SA)的功能類似物)的應(yīng)答。在BTH處理后3天，GUS活性主要局限于新形成的葉子，而非成熟葉子中(圖9e)。對pDMR6::GUS品系的分析證實了上述表達數(shù)據(jù)且突出了/Wi^對寄生霜霉感染應(yīng)答時嚴格局限的誘導(dǎo)。dmr6-l突變體組成型地表達防御相關(guān)轉(zhuǎn)錄物為闡明缺乏"lv^如何導(dǎo)致寄生霜霉抗性，將dmr6-1突變體與Ler0&/-2親本品系的轉(zhuǎn)錄組比較進行分析。來自血i^-7和Lere^y/-2的14天幼苗地上部分的mRNA的探針在全基因組CATMA^:陣列上進行雜交?？偣舶l(fā)現(xiàn)58個基因在^z/i^-7中有顯著的差別表達，其中51個基因轉(zhuǎn)錄物水平提高，7個基因轉(zhuǎn)錄物水平降低。這51個誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄物中有一組明顯鑒定為植物防御反應(yīng)激活相關(guān)的基因，例如ACD6、PR-5、PR-4/HEL和PAD4。這些數(shù)據(jù)表明ZW)^丟失導(dǎo)致一組特異性防御相關(guān)轉(zhuǎn)錄物的激活。發(fā)現(xiàn)/Wi(5"是被dmr6-1誘導(dǎo)的基因之一確證了/WW《是防御相關(guān)的。為測試防御相關(guān)基因的誘導(dǎo)表達是否由/W7(f丟失造成，而不是由于留存于回交的f/邁i^-7突變體中附加的曱基磺酸乙酉旨(ethanemethylsulfonate,EMS)突變造成的,選擇一組基因(At4gl4365、Atlgl4880、JCZ^、戶i-7、戶A-2和尸W-"通過在^zw^-/和^zw《-2兩種突變體中進行定量PCR證實其轉(zhuǎn)錄物水平(圖10)。我們只測試cto/7f-7突變體中/M^轉(zhuǎn)錄物水平(圖10a)，因為^77^-2突變體(圖10b)當中的T-DNA插入片段破壞了ZW^f轉(zhuǎn)錄物。與Ler(5&/-2相比，在dmr6-1中通過Q-PCR證實了在樣t陣列分析中觀察到的、對/Wi6的誘導(dǎo)(圖10a)。圖10a和b顯示所有六個所選基因相比于親本品系，在兩種dmr6突變體中都提高。所選防御相關(guān)基因在6突變體中觀察到的表達提高表明ZWj^的缺失激活了植物防御應(yīng)答。這組防御相關(guān)轉(zhuǎn)錄物的激活可能是rffflLnf突變體中對寄生霜霉抗性的主要原因。實施例2在作物中鑒定DMR6直向同源物1.根據(jù)序列同源性篩選文庫圖2顯示了擬南芥的DMR6編碼序列和蛋白質(zhì)的核苷酸及氨基酸序列。將公共文庫的核苷酸及氨基酸序列與圖2的序列相比較。該比較結(jié)果鑒定了耬斗菜屬物種、甜橙、中果咖啡、黃瓜、陸地棉、萵苣、蒺藜苜蓿、稻(3)、毛果楊(2)、番茄(2)、高梁、菠菜、葡萄、玉米及姜中的完整DMR6編碼序列及預(yù)測的氨基酸序列。如此鑒定的直向同源蛋白質(zhì)的序列信息列于表1，且在圖1中以多重比對顯示。至于許多其它植物物種，直向同源DNA片段可以以與擬南芥屬或其它植物DMR6蛋白質(zhì)序列的交互最佳命中通過BlastX鑒定。2.通過異源雜交鑒定直向同源物使用標準的分子生物學(xué)方法，通過與任何植物物種的DM雜交，用如圖2所示的擬南芥DMR6DM序列作為探針查找同源序列。使用該方法，通過對限制酶消化的DNA進行southern雜交或通過與基因組或cDNA文庫雜交，檢測直向同源基因。這些技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知。作為替代探針，任何其它更密切相關(guān)的植物物種的DMR6DNA序列可用作探針。3.通過PCR的方法鑒定直向同源物對于許多作物物種，可獲得用于設(shè)計引物的部分DMR6mRNA或基因序列用于隨后PCR擴增完整的cDNA或基因組序列。當可得到5'及3，序列時，通過DMR6特異性5，正向引物及3，反向引物PCR擴增缺失的內(nèi)部序列。如果只有5，、內(nèi)部或3，序列可用時，設(shè)計正向和反向兩種引物。與可得到的質(zhì)粒多接頭引物聯(lián)合，從目的植物物種的基因組及cDNA文庫中擴增插入片段。以類似的方式，通過高級PCR才支術(shù)5，RACE、3，MCE、TAIL-PCR、RLM-RACE或小載體PCR，擴增缺失的5，或3，序列。例如，提供了萵苣DMR6cDNA的測序。使用tblastn工具，從擬南芥屬DMR6氨基酸序列開始，從NCBI的GenbankEST數(shù)據(jù)庫中鑒定了幾個萵苣屬DMR6EST。EST的聚類及比對得到了一個5，DMR6片段的共有序列。為獲得完整的萵苣DMR6cDM，對萵苣苗的mRNA使用RLM-RACE試劑盒(Arabion)。使用在來源于EST的5，DMR6共有序列中設(shè)計的2個引物(Lsat-dmr6-fwl:CGATCAAGGTCAACACATGG，及Lsat-dmr6—fw2:TCAACCATTACCCAGTGTGC)及來自該試劑盒的3，RACE引物獲得3，mRNA序列。根據(jù)該裝配順序，設(shè)計新引物以擴增來自cDM的完整DMR6編碼序列，從而提供如圖3所示的核苷酸序列及衍生的蛋白序列。的完整DMR6編碼序列。從DNA序列的比對中，選擇了編碼序列中的保守區(qū)域用于設(shè)計簡并寡核苷酸引物(對于簡并核苷酸，縮寫是根據(jù)作為所有合成寡核苷酸的公司所用的標準代碼的IUB核苷酸符號G=鳥嘌呤，A=腺嘌呤，T=胸腺嘧咬，C=胞嘧咬，R-A或G，Y=C或T，M-A或C，K-G或T,S-C或G，W-A或T，B-C或G或T，D-G或A或T，H-A或C或T，V-A或C或G，N-A或C或G或T)。用于獲得指定植物物種的內(nèi)部DMR6cDNA序列的方法如下1.使用標準方法分離mRNA,2.使用寡dT引物及標準方法合成cDNA，3，使用筒并正向和反向寡核普酸進行PCR反應(yīng)，4.通過標準的瓊脂糖凝膠電泳分離PCR片段，從該凝膠分離預(yù)期大小的片段，5.使用標準方法將分離的PCR片段克隆到質(zhì)粒載體中，6.通過PCR確定具有正確插入片段大小的質(zhì)粒，再通過DNA測序分析，7.使用blastX進行的序列分析顯示哪些片段含有正確的內(nèi)部DMR6序列，8.然后所述內(nèi)部DNA序列可用于設(shè)計基因-及物種-特異性的引物進行5，及3，RACE，從而通過RLM-RACE獲得完整的DMR6編碼序列27例如，提供了黃瓜DMR6cDNA的測序。對于黃瓜而言，以下引物的幾種引物組合成功地從cDM擴增內(nèi)部編碼序列的節(jié)段正向引物dmr6-deg一fwlB(TTCCAGGTDATTAAYCAYGG)，dmr6-deg-fw2B(CATAAYTGGAGRGAYTAYCT)，dmr6-deg—fw3B(GARCAAGGRCARCAYATGGC)和dmr6-deg-fw4(AATCCTCCTTCHTTCAAGGA)以及反向引物dmr6-deg-rv3B(AGTGCATTKGGGTCHGTRTG)，dmr6_deg_rv4(AATGTTRATGACAAARGCAT)，和dmr6—deg-rv5(GCCATRTGYTGYCCTTGYTC)?？寺〖皽y序擴增的片段后，設(shè)計黃瓜DMR6-特異性引物用于5，RACE((Cuc-dmr6-rvl:TCCGGACATTGAAACTTGTG和Cuc-drar6-rv2:TCAAAGAACTGCTTGCCAAC)及3，MCE(Cue—dmr6—fwl:CGCACTCACCATTCTCCTTC和Cuc—dmr6-fw2:GGCCTCCAAGTCCTCAAAG)。最終擴增并測序了完整的黃瓜DMR6cDNA序列(圖5)。類似方法被用于菠菜(圖4)、番茄(圖12)和本生煙(圖13)。飾，以誘導(dǎo)降低DMR6表達或活性的突變，而獲得對真菌及卵菌具有抗性的非遺傳改造的植物。備選地，該直向同源物的遺傳信息可用于設(shè)計載體進行基因沉默。然后轉(zhuǎn)化相應(yīng)的農(nóng)作物以獲得抗卵菌的植物。實施例3種子的突變用誘變劑處理目的植物物種的種子以便在基因組中引入隨機點突變。突變的植物生長結(jié)籽，就DMR6轉(zhuǎn)錄物水平或活性的減少或缺失篩選下一代。這可通過監(jiān)測DMR6基因表達的水平，或用TILLING方法通過搜索核苷酸改變(突變)，通過DNA測序，或通過任何其它用于鑒定核苷酸變化的方法而實現(xiàn)。選擇的植物為實施例4將突變的等位基因轉(zhuǎn)移到所需作物的背景中通過雜交和基因型篩選突變的等位基因而獲得所需突變等位基因向作物中的漸滲雜交。這是目前作物的標記輔助育種的標準方法。實施例5啟動子用于可被病原體誘導(dǎo)的基因表達及產(chǎn)生疾病抗性植物的用途精確控制轉(zhuǎn)基因的表達是工程改造植物提高疾病抗性的關(guān)鍵。過去，轉(zhuǎn)基因的組成型過表達常常導(dǎo)致質(zhì)量低劣的植物。因此建議使用可被病原體誘導(dǎo)的啟動子，通過該啟動子轉(zhuǎn)基因僅在需要其的時間和地點(在感染位點)表達。工程基因的局部及可誘導(dǎo)表達，例如控制開關(guān)基因、誘導(dǎo)子或Avr基因、抗微生物基因或毒素基因，導(dǎo)致了防御或細胞死亡的活化，而這些會產(chǎn)生病原體抗性，如Gurr和Rushton(TrendsinBiotechnology23:275-282，2005)所述。Dewit(Annu.Rev.Phytopathol.30:391-418，1992)提供了一個好的實例，他提出使用Avr9-Cf9組合來實現(xiàn)誘導(dǎo)的細胞死亡以產(chǎn)生疾病抗性。表達的組織特異性及可i秀導(dǎo)性對這些方法是至關(guān)重要的，如Gurr和Rushton(TrendsinBiotechnology23:283-290，2005)所描述的。根據(jù)本發(fā)明，基于啟動子-GUS分析，證實DMR6啟動子顯示出強烈的、可誘導(dǎo)的、局部的表達。因此DMR6啟動子非常適合在轉(zhuǎn)基因植物中工程改造疾病抗性。DMR6啟動子由擬南芥屬DMR6編碼序列(ATG起始密碼子)上游的2.5kb區(qū)域組成，還包括5，UTR(如圖11中所描述的)。隨后使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標準技術(shù)，將該可被病原體誘導(dǎo)啟動子用于工程改造合適的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體。使用來自給定植物物種的直向同源DNA序列為PCR設(shè)計引物。然后這些用于篩選目的植物物種基因組庫，以鑒定含有DMR6直向同源物及其啟動子和調(diào)控序列的基因組克隆。備選地，通過篩選有對應(yīng)于DMR6直向同源基因的、標記的PCR片段的文庫來分離基因組克隆。測序揭示了啟動子的核苷酸序列。然后通過PCR擴增DMR6直向同源編碼序列(ATG起始密碼子)上游的2-5kb區(qū)域(因此包括5，UTR)以工程改造構(gòu)建體以進行植物轉(zhuǎn)化。實施例6這個實例證明擬南芥^z/i^-7突變體可由來自4種不同作物物種的/WWf直向同源物來互補。為此，將黃瓜(Cs)、菠菜(So)、萵苣(Ls)及番癡(S1)的//漢^直向同源物克隆進受35S啟動子控制的植物表達載體，接著將這個載體轉(zhuǎn)化進擬南芥一個突變體^m^-7。簡言之，通過標準方法分離mRNA，使用oligodT引物及標準方法合成cDNA。接著，使用下面表3描述的各作物的引物對來產(chǎn)生PCR片段。使用Invitrogen公司pENTR/D-TOPO克隆試劑盒，將產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物克隆進pENTR/D-TOPO載體，得到的具有正確插入片段大小(通過PCR確認)的質(zhì)粒通過DNA測序進行分析。用來自Invitrogen公司的LR克隆酶II完成向pB7WG2，G栽體的重組，所得的質(zhì)粒用PCR和限制性酶消化進行分析。將合適的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入根癌農(nóng)桿菌C58C1PGV2260，且來自土壤桿菌屬的質(zhì)粒用PCR和限制性酶消化進行分析。用上述構(gòu)建體，通過浸入土i裏桿菌屬溶液轉(zhuǎn)化擬南芥dmr6-l植物，并使用農(nóng)作物DMR6克隆引物通過RT-PCR確認擬南芥T1植物中作物DMR6的過表達(表3)。最后用寄生霜霉Cala2感染擬南芥T2和T3才直物以驗i正互補。結(jié)果顯示于圖14中。如圖14中所示，所有測試的/WA(5"直向同源物都能與擬南芥突變體ofe/^"/互補，這表明鑒定的DMR6直向同源物編碼與擬南芥DMR6具有類似功能的DMR6蛋白質(zhì)。表1列出了擬南芥屬DMR6mRNA的表達序列標簽(EST)和mRNA或蛋白質(zhì)序列及來自其它植物物種的直向同源序列的GI編號(Genlnfo標識符)和Genbank登錄號。GI編號(Genlnfo標識符，有時小寫為"gi，，)是一個識別特定序列的獨特整數(shù)。GI編號是一系列數(shù)字，連續(xù)地分配給由NCBI處理的每個序列記錄。因而每當序列變化時，GI編號也隨之變化。NCBI會給進入Entrez處理的所有序列分配GI編號，包括來自DDBJ/EMBL/GenBank的核苷酸序列，來自SWISS-PROT、PIR和許多其它的蛋白質(zhì)序列。因而GI編號提供獨特的序列標識符，其與詳細說明確切序列的數(shù)據(jù)庫來源無關(guān)。如果GenBank中的一個序列被修改，甚至僅修改單個堿基對，也會給該更新的序列分配一個新的GI編號。登錄號保持相同。GI編號始終穩(wěn)定并且可檢索。因此，參考該表中的GI編號可以清楚并明確地鑒定相應(yīng)序列。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>表2<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>表3用于在合適才直物表達載體中克隆dinr6直向同源物的引物對<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>權(quán)利要求1.植物，其能抵抗病毒、細菌、真菌或卵菌來源的病原體，特征在于與不能抵抗所述病原體的植物相比，該植物具有DMR6蛋白質(zhì)的水平降低、活性降低或完全缺失。2.權(quán)利要求l的植物，其中該病原體為真菌或卵菌門的生物體。3.權(quán)利要求2的植物，其中該病原體為白銹菌屬、絲嚢霉屬、圓梗霉屬、盤梗霉屬、^a/。/7ero/7c^(rs、戶ac力y邁e、類霜霉屬、戶ero/a"/a、霜疫霉屬、霜霉屬、霜指霉屬、戶力y〃wz7、疫霉屬、單軸霉屬、/Vc^o^re范/'a、假霜霉屬、指梗霉屬、We/7/zo〃a物種。4.權(quán)利要求2或3的植物，其中該植物及病原體選自萵苣的萵苣盤梗霉、菠菜的粉霜霉、葫,科成員例如黃瓜和甜瓜的古巴假霜霉、洋蔥的毀壞霜霉、十字花科成員例如巻心菜的寄生霜霉、葡萄的葡萄生單軸霉、番茄和馬鈴薯的致病疫霉和大豆的大豆疫霉。5.權(quán)利要求l-4任一項的植物，在其/W^f基因中具有突變，該突變導(dǎo)致此DMR6蛋白質(zhì)與沒有此突變的野生型ZW^"基因編碼的DMR6蛋白質(zhì)相比，其酶活性降低。6.權(quán)利要求5的植物，其中在/Wi^基因中的突變導(dǎo)致在編碼的蛋白質(zhì)中的氨基酸替換。7.權(quán)利要求1-6中任一項的植物，在其/Wi^基因中具有突變，該突變導(dǎo)致與沒有此突變的野生型DMR6基因相比，其DMR6蛋白質(zhì)表達降低。8.權(quán)利要求1-4中任一項的植物，在其DMR6基因調(diào)節(jié)序列中有突變，該突變影響了編碼的DMR6蛋白質(zhì)表達。9.權(quán)利要求5-8中任一項的植物，其中該基因是如圖2所示的擬南芥屬DMR6基因(At5g24530)的直向同源基因。10.權(quán)利要求1-8中任一項的植物，其中該基因是如表1列表中鑒定的DMR6直向同源基因。11.權(quán)利要求1-8中任一項的植物，其中該基因是具有如圖3所示核苷酸序列及氨基酸序列的萵苣DMR6直向同源基因。12.權(quán)利要求1-8中任一項的植物，其中該基因是具有如圖4所示核苷酸序列及氨基酸序列的菠菜DMR6直向同源基因。13.權(quán)利要求l-8中任一項的植物，其中該基因是具有如圖5所示核苷酸序列及氨基酸序列的黃瓜或其他甜瓜屬物種如甜瓜DMR6直向同源基因。14.用于獲得植物的方法，該植物能抵抗病毒、細菌、真菌或卵菌來源的病原體，該方法包括減少該植物中DMR6蛋白質(zhì)的內(nèi)源水平。15.權(quán)利要求14的方法，其中通過該植物的DMR6基因的突變實現(xiàn)DMR6蛋白質(zhì)水平的降低。16.權(quán)利要求15的方法，其中通過/M^基因的突變而誘導(dǎo)一個或多個導(dǎo)致DMR6蛋白質(zhì)酶活性降低的氨基酸改變實現(xiàn)DMR6蛋白質(zhì)水平降低。17.權(quán)利要求15或16的方法，其中該突變是通過對植物的誘變處理而實現(xiàn)的，特別是用誘變劑或輻射處理。18.權(quán)利要求14的方法，其中通過降低該植物/Wv^基因的表達實現(xiàn)在植物中內(nèi)源水平的降低。19.權(quán)利要求18的方法，其中通過基因沉默或RMi實現(xiàn)植物iW^f基因的表達降低。20.權(quán)利要求18的方法，其中通過在啟動子區(qū)域、終止子區(qū)域或內(nèi)含子中調(diào)控元件的誘變實現(xiàn)該植物/Wi^基因的表達降低。21.權(quán)利要求18的方法，其中通過/JM^基因阻遏蛋白的過表達實現(xiàn)植物"v^6基因的表達降低。22.權(quán)利要求18的方法，其中通過編碼活化或調(diào)控蛋白的植物基因的沉默或突變實現(xiàn)植物/^i^"基因的表達降低。23.權(quán)利要求14-22中任一項的方法，其中待突變的ZW)^基因是如圖2所示的擬南芥屬"#)^基因(At5g24530)的直向同源物。24.權(quán)利要求23的方法，其中該基因是如表1列表中所鑒定的DMR6直向同源基因。25.權(quán)利要求23的方法，其中該基因是具有如圖3所示核苷酸序列及氨基酸序列的萵苣DMR6直向同源基因。26.權(quán)利要求23的方法，其中該基因是具有如圖4所示核苷酸序列及氨基酸序列的菠菜DMR6直向同源基因。27.權(quán)利要求23的方法，其中該基因是具有如圖5所示核苷酸序列及氨基酸序列的黃瓜DMR6直向同源基因。28.突變的植物/Wi^基因，其編碼酶活性降低的DMR6蛋白質(zhì)。29.權(quán)利要求28的突變的植物/Wi^基因，其包括具有成熟前終止密碼子的^z/z^等位基因。30.權(quán)利要求29中的突變的植物基因，其包括cfei^-7等位基因。31.DMR6啟動子為植物提供疾病抗性的用途。32.為植物提供疾病抗性的方法，其包括用含有至少一種可表達核酸的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化入植物細胞，所述可表達核酸可操作地連接于在植物細胞中可操作的、可被病原體誘導(dǎo)的啟動子，以及從所述植物細胞再生出轉(zhuǎn)化的植物，其中可^t病原體誘導(dǎo)啟動子為DMR6啟動子，且其中所述可表達核酸的表達賦予轉(zhuǎn)基因植物以疾病抗性。33.權(quán)利要求32的方法，其中所述可表達核酸是參與植物防御應(yīng)答的基因。34.權(quán)利要求32或33的方法，其中所述可表達核酸編碼能賦予所述植物以疾病抗性的自體或異源多肽。35.權(quán)利要求32、33或34的方法，其中所述DMR6啟動子是擬南芥屬DMR6啟動子。36.權(quán)利要求35的方法，其中所述DMR6啟動子包括圖11中定義的核苷酸序列，和/或其功能性片段和/或天然變體。37，權(quán)利要求32、33或34的方法，其中所述DMR6啟動子是直向同源DMR6啟動子。38.DNA構(gòu)建體，其包括至少一種可表達核酸，該可表達核酸可操作地連接于可被病原體誘導(dǎo)的啟動子，其中該啟動子為DMR6啟動子。39.權(quán)利要求38的DNA構(gòu)建體，其中所述可表達核酸是參與植物防御應(yīng)答的基因。40.權(quán)利要求38或39的DM構(gòu)建體，其中所述可表達核酸編碼能賦予所述植物以疾病抗性的自體或異源多肽。41.權(quán)利要求38、39或40的DM構(gòu)建體，其中所述DMR6啟動子是擬南芥屬DMR6啟動子。42.權(quán)利要求41中的方法，其中所述DMR6啟動子包括圖11中定義的核普酸序列，和/或其功能性片段和/或天然變體。43.權(quán)利要求38、39或40的方法，其中所述DMR6啟動子是直向同源DMR6啟動子。全文摘要本發(fā)明涉及一種植物，其能抵抗病毒、細菌、真菌或卵菌來源的病原體，其中與不能抗所述病原體特別是真菌或卵菌門生物體的植物相比，該植物具有降低水平的、降低活性的或者完全缺乏DMR6蛋白。本發(fā)明進一步涉及用于獲得植物的方法，該植物能抵抗病毒、細菌、真菌或卵菌來源的病原體，包括降低該植物中的DMR6蛋白的內(nèi)源水平或活性。另外，本發(fā)明涉及DMR6啟動子用于提供疾病抗性植物的用途。文檔編號C12N15/82GK101617049SQ200880003720公開日2009年12月30日申請日期2008年1月30日優(yōu)先權(quán)日2007年2月1日發(fā)明者A·F·J·M·范丹阿克維肯,M·M·A·范達默申請人:安莎種子公司