專利名稱：水稻抗病相關(guān)基因OsDR8的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一個(gè)水稻抗病相關(guān)基因OsDR8的分離克隆和功能驗(yàn)證。OsDR8基因的功能與水稻抵抗病害的能力顯著相關(guān)。
背景技術(shù)：
植物在生長(zhǎng)的過程中，受到多種病原物的侵害。植物病原物的種類繁多，包括病毒、細(xì)菌、真菌和線蟲等。病原物侵入植物導(dǎo)致兩種結(jié)果(1)病原體成功的在寄主植物內(nèi)繁殖，引起相關(guān)的病癥；(2)寄主植物產(chǎn)生抗病反應(yīng)，殺死病原物或阻止其生長(zhǎng)。利用抗性基因資源改良植物的抗病性，是預(yù)防病害同時(shí)又保護(hù)環(huán)境的根本出路。
植物的抗病反應(yīng)是多基因參于調(diào)控的復(fù)雜過程。參于植物抗病反應(yīng)的基因分為兩類(1)抗病基因，又稱R(resistance)基因和(2)抗病相關(guān)基因。
根據(jù)目前人們對(duì)抗病基因功能的認(rèn)識(shí)，這類基因的產(chǎn)物主要是作為受體，直接或間接與病原蛋白相互作用，啟動(dòng)植物體內(nèi)的抗病信號(hào)傳導(dǎo)路徑(Tang等，1996，Science 2742060-2063；Baker等，1997，Science 276726-733；Jia等，2000，EMBO J.194004-4014；Dangl和Jones，2001，Nature 411826-833；Nimchuk等，2001，Curr.Opin.Plant Biol.4288-294)?？共』蚪閷?dǎo)的抗病反應(yīng)抗性強(qiáng)，是很好的基因資源。但由于下述原因，使利用抗病基因改良植物抗性受到限制(1)抗病基因的資源有限，如目前知道的抵抗水稻重要病害白葉枯病的抗病基因少于30個(gè)，抵抗另一水稻重要病害—稻瘟病的抗病基因也只有大約40個(gè)；(2)抗病基因具有病原種類和病原生理小種特異性，抗病范圍有限；(3)因?yàn)椴≡目焖偻蛔?，一個(gè)抗病基因的作用往往幾年或者十幾年后就喪失了。
抗病相關(guān)基因是指除抗病基因外所有參于抗病反應(yīng)的基因，它們的編碼產(chǎn)物參于合成植物體內(nèi)抗病信號(hào)分子、參于信號(hào)傳導(dǎo)或參于防衛(wèi)反應(yīng)等。這類基因的共同特點(diǎn)是病原誘導(dǎo)后它們的表達(dá)量升高或減少，因此人們可以根據(jù)病原誘導(dǎo)前后基因的表達(dá)量的差異大規(guī)模地鑒定植物抗病相關(guān)基因(Maleck等，2000，Nature Genet.26403-410；Schenk等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9711655-11660；Zhou等，2002，Science in China 45449-467)。目前，人們對(duì)抗病相關(guān)基因的認(rèn)識(shí)有限。根據(jù)已有報(bào)道，絕大多數(shù)抗病相關(guān)基因單獨(dú)作用時(shí)的抗性能力可能比抗病基因小。但根據(jù)下述原因，它們是值得大力開發(fā)的基因資源(1)由于絕大多數(shù)抗病相關(guān)基因的產(chǎn)物不需要直接與病原物相互作用，這類基因是具有持久抗性的基因資源；(2)大多數(shù)抗病相關(guān)基因參于的抗病反應(yīng)沒有病原特異性，因此它們是具有廣譜抗性的基因資源；(3)這類基因的資源豐富。
植物的抗病反應(yīng)可以分為兩大類。長(zhǎng)期以來研究者們對(duì)這兩大類抗病反應(yīng)給予了不同名稱，如垂直抗性和水平抗性(Van Der Plank等，1968，Disease Resistance in Plants，Academic，New Youk)、質(zhì)量抗性和數(shù)量抗性(Ou等，1975，Phytopathology 651315-1316)、完全抗性和部分抗性(Parlevliet，1979，Annu.Rev.Phytopathol.1203-222)。質(zhì)量抗性(或垂直抗性或完全抗性)是抗病基因介導(dǎo)的抗病反應(yīng)。數(shù)量抗性(或水平抗性或部分抗性)是由數(shù)量性狀位點(diǎn)(quantitative trait locus，QTL)調(diào)控的抗病反應(yīng)，它被認(rèn)為無病原特異性，而且抗性持久(Roumen，1994，Rice Blast Disease，Zeigler等編著，CAB International，Cambridge，UK，pp.245-265)。目前，人們對(duì)植物抗病QTL的基因本質(zhì)還不清楚。因此，雖然水稻中已經(jīng)鑒定出了大量抗病QTL，如抗白葉枯病QTL(Li等，1999，Mol.Gen.Genet.26158-63)、抗稻瘟病QTL(Wang等，1994，Genetics 1361421-1434；Chen等，2003，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1002544-2549)、抗紋枯病QTL(Li等，1995，Theor.Appl.Genet.91382-388)和抗病毒病QTL(Albar等，1998，Theor.Appl.Genet.971145-1154)等，但這些抗性QTL沒有被很好地用于水稻品種抗病性的改良。
近年研究發(fā)現(xiàn)很多抗病相關(guān)基因的染色體位置與抗病QTL相對(duì)應(yīng)，提示這些抗病相關(guān)基因可能就是相對(duì)應(yīng)的QTL?？共∠嚓P(guān)基因的染色體位置與抗病QTL相對(duì)應(yīng)這一現(xiàn)象在多種植物中都被觀察到，包括水稻(Xiong等，2002，中國(guó)科學(xué)45518-526；Ramalingam等，2003，Mol.Plant-Microbe Interact.1614-24；Wen等，2003，Mol.Gen.Genomics 269331-339；Chu等，2004，Mol.Gen.Genomics 271111-120)、小麥(Faris等，1999，Theor.Appl.Genet.98219-225)、豆類(Geffroy等，2000，Mol.Plant-Microbe Interact.13287-296)和馬鈴薯(Trognitz等，2002，Mol.Plant-Microbe Interact.15587-597)。這些結(jié)果為采用候選基因策略分離、克隆和利用抗病QTL的基因提供了依據(jù)。
水稻是世界上重要的糧食作物，但病害的影響常常造成其產(chǎn)量和品質(zhì)的下降。因此，了解病害的發(fā)病機(jī)制，有助于利用高效途徑改良水稻品種的抗性，控制病害的發(fā)生，減少或避免植物病害所帶來的損失。
分離克隆抗病相關(guān)基因是對(duì)水稻抗病機(jī)理研究的前提。同時(shí)，與抗病基因的應(yīng)用相比，抗病相關(guān)基因的應(yīng)用能提供植物更為廣譜及長(zhǎng)效的抗性。通過超量表達(dá)抗病相關(guān)基因進(jìn)行水稻品種的改良，將進(jìn)一步增強(qiáng)植物的抗病性，拓寬植物的抗譜。這些方面是采用常規(guī)植物育種和改良技術(shù)所不能達(dá)到的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是分離克隆水稻中攜帶的一個(gè)抗病相關(guān)基因完整DNA片段，并利用RNA干擾技術(shù)(RNA interference，RNAi)通過使目標(biāo)基因沉默鑒定該基因在抗病反應(yīng)過程中所起作用，為利用這個(gè)基因改良水稻品種或其它植物抵御病害的能力奠定基礎(chǔ)。
本發(fā)明涉及分離一種包含OsDR8(Oryza sativa defense responsive 8)基因的DNA片段并鑒定其功能，該片段賦予植物對(duì)由白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)和稻瘟病菌(Pyricularia grisea)所引起的病害產(chǎn)生抗病反應(yīng)。其中，所述片段如序列表SEQ ID NO1所示，或者基本上相當(dāng)于SEQ ID NO1所示的DNA序列，或者其功能相當(dāng)于SEQ ID NO1所示序列的亞片段。對(duì)其序列進(jìn)行分析表明它與玉米的維生素B1的生物合成酶基因thil同源。
可以采用已經(jīng)克隆的OsDR8基因作探針，從cDNA和基因組文庫中篩選到本發(fā)明的基因或同源基因。同樣，采用PCR(polymerase chain reaction)技術(shù)，也可以從基因組、mRNA和cDNA中擴(kuò)增得到本發(fā)明的OsDR8基因以及任何感興趣的一段DNA或與其同源的一段DNA。采用以上技術(shù)，可以分離得到包含OsDR8基因的序列，將這一序列與合適的載體連接，可以轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。
將克隆的抗病相關(guān)基因轉(zhuǎn)入感病的植物，有助于產(chǎn)生新的抗病植物。特別是可以用遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)在植株中累加多個(gè)抗性基因，而不會(huì)產(chǎn)生傳統(tǒng)育種技術(shù)中伴隨出現(xiàn)的連鎖基因組序列?？共∠嚓P(guān)基因的克隆是克服傳統(tǒng)育種不能在植物種間轉(zhuǎn)移抗病相關(guān)基因問題的前提。
在本發(fā)明的實(shí)施例部分，我們闡述了OsDR8基因的分離和功能驗(yàn)證過程以及該基因的特點(diǎn)，分離的OsDR8基因能夠和適當(dāng)?shù)妮d體連接，轉(zhuǎn)入植物體中，為使植物體獲得或增強(qiáng)抗病的能力提供一條可能的途徑。
序列表、附圖及其說明序列表SEQ ID No1.OsDR8基因的序列和它編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列。


圖1.本發(fā)明鑒定和分離克隆水稻抗病相關(guān)基因OsDR8以及驗(yàn)證OsDR8基因功能的流程圖。
圖2.是cDNA芯片中每一個(gè)方格內(nèi)cDNA克隆的排列規(guī)則圖。cDNA芯片的每張尼龍膜上有384個(gè)方格，每個(gè)方格有8個(gè)位點(diǎn)。圖中示方格中cDNA克隆的排列方式，每個(gè)克隆占據(jù)兩個(gè)位點(diǎn)。A、B、C和D分別代表不同cDNA克隆。
圖3.利用cDNA芯片檢測(cè)接種病原菌前后差異表達(dá)的cDNA克隆。a、c、e用接種病原菌5天后的葉片組織制作的探針與芯片雜交；b、d、f用接水(對(duì)照)的葉片組織制作的探針與芯片雜交。方框表示cDNA芯片上一個(gè)方格，每個(gè)方格中有8個(gè)位點(diǎn)(圖2)。箭頭表示在上下對(duì)比的圖像中差異表達(dá)的cDNA克隆。圖a、c和e中所示3個(gè)cDNA克隆在接種病原菌5天后表達(dá)量明顯增加。
圖4.OsDR8基因位于水稻7號(hào)染色體，其染色體位置與已知抗稻瘟病QTL(Wang等，1994，Genetics 1361421-1434)相對(duì)應(yīng)。
圖5.采用RT-PCR技術(shù)分析OsDR8基因在抗稻瘟病水稻材料(C101LAC、C101A51和明恢63(Minghui63))、感稻瘟病水稻材料(CO39和珍汕97(Zhenshan 97))、抗白葉枯病水稻材料(IRBB4、IRBB13和明恢63)、感白葉枯病水稻材料(IR24和珍汕97)接種稻瘟病菌(IK81-3和V86013)、白葉枯病菌(PXO61、PXO99和JL691)或接水(control，對(duì)照)后的表達(dá)特征。1、2、3、4、5、6、7和8分別代表接種或接水后2小時(shí)、4小時(shí)、8小時(shí)、16小時(shí)、1天、3天、5天和7天。用不受病原誘導(dǎo)的水稻肌動(dòng)蛋白(actin)基因的表達(dá)量作為衡量樣品量的標(biāo)準(zhǔn)。
圖6.水稻品種明恢63中覆蓋OsDR8基因區(qū)段的亞克隆的重疊圖。圖中長(zhǎng)線條代表從水稻品種明恢63 BAC克隆5F21中獲得的包含OsDR8基因的DNA片段，以及這條片段中的限制性內(nèi)切酶消化位點(diǎn)的位置。箭頭的位置及長(zhǎng)度表示對(duì)限制性內(nèi)切酶亞克隆測(cè)序的長(zhǎng)度及序列位置，箭頭方向表示對(duì)亞克隆進(jìn)行測(cè)序的方向。將亞克隆測(cè)序序列拼接得到一長(zhǎng)1980bp的序列。
圖7.采用GENSCAN(http//genes.mit.edu/GENSCAN.html)基因結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)軟件、參照擬南芥作為分析模板分析從水稻品種明恢63中獲得的1980bp、包含OsDR8基因的序列。分析結(jié)果顯示該序列包含OsDR8基因完整的編碼序列。圖中Gn代表基因編號(hào)；Ex代表外顯子；Init代表基因起始端外顯子；Term代表基因終止端外顯子；PlyA代表PolyA；S代表DNA鏈，其中“+”表示分析過程中輸入的DNA序列鏈；Begin代表外顯子、啟動(dòng)子或PolyA在輸入DNA序列中的起始位置；End代表外顯子、啟動(dòng)子或PolyA在輸入DNA序列中的終止位置；Len代表外顯子、啟動(dòng)子或PolyA的序列長(zhǎng)度(bp)；Fr代表翻譯閱讀框(每條DNA序列有3個(gè)翻譯閱讀框)；I/Ac代表3’剪切位點(diǎn)分值；Do/T代表5’剪切位點(diǎn)分值；CodRg代表翻譯區(qū)分值；P代表外顯子概率；Tscr代表外顯子分值。
圖8.OsDR8基因的結(jié)構(gòu)及用于超量表達(dá)遺傳轉(zhuǎn)化載體構(gòu)建的DNA片段長(zhǎng)度和結(jié)構(gòu)。線條表示內(nèi)含子；柱條表示外顯子，其中黑色部分代表編碼序列，白色部分代表5’和3’非編碼區(qū)(UTR)；數(shù)字表示各個(gè)結(jié)構(gòu)的堿基數(shù)?！癆TG”和“TGA”分別是翻譯起始密碼和終止密碼；“gt”和“ag”是內(nèi)含子剪切位點(diǎn)。長(zhǎng)箭頭代表遺傳轉(zhuǎn)化片段的長(zhǎng)度和相對(duì)應(yīng)基因結(jié)構(gòu)的位置。短箭頭代表進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析中所用5’RACE和RT-PCR引物位置。
圖9.用定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)OsDR8基因在對(duì)照材料(明恢63)和T0代遺傳轉(zhuǎn)化植株(D16RMH)中的表達(dá)量。D16RMH-24和D16RMH-30是陰性轉(zhuǎn)化植株，其它植株是陽性轉(zhuǎn)化植株?？v坐標(biāo)代表OsDR8基因在每份水稻材料中的相對(duì)表達(dá)量(對(duì)照材料的表達(dá)量定為1)(三次實(shí)驗(yàn)的平均值)。
圖10.點(diǎn)接種的稻瘟病菌V86013在T0代遺傳轉(zhuǎn)化植株(D16RMH)上更容易生長(zhǎng)繁殖，形成明顯大、褐色點(diǎn)。箭頭示部分轉(zhuǎn)化植株的葉片上已形成病斑。明恢63為遺傳轉(zhuǎn)化受體材料(對(duì)照)，牡丹江8是感病品種(對(duì)照)。每一葉片接種四個(gè)點(diǎn)，每一點(diǎn)接種菌液10微升。接種后4天照片。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例中進(jìn)一步定義本發(fā)明，圖1描敘了鑒定和分離克隆OsDR8基因以及驗(yàn)證OsDR8基因功能的流程。根據(jù)以上的描述和這些實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以對(duì)本發(fā)明作出各種改變和修改，以使其適用各種用途和條件。
實(shí)施例一構(gòu)建病原誘導(dǎo)的水稻cDNA文庫，制作水稻cDNA芯片采用抗病水稻品種明恢63(Oryza sativa ssp.indica)構(gòu)建的水稻全生育期平衡化cDNA文庫(儲(chǔ)昭暉等，水稻全生育期均一化cDNA文庫的構(gòu)建和鑒定，2002，科學(xué)通報(bào)471656-1662)制作cDNA芯片。該文庫由水稻不同生長(zhǎng)時(shí)期和不同生理狀態(tài)下的15種組織的cDNA組成，包括白葉枯病菌和稻瘟病菌接種誘導(dǎo)后的組織。該文庫包含大約62,000個(gè)克隆，平均插入片段為1.4kb。隨機(jī)取該文庫中的21504個(gè)cDNA克隆，抽提質(zhì)粒制作cDNA芯片(cDNA array)(Zhou等，The defense-responsive genes showing enhance and repressed expression after pathogeninfection in rice(Oryza sativa L.)，2002，Sci.in China 45449-467)。為了保證雜交結(jié)果的可靠性，在cDNA芯片上每個(gè)cDNA克隆有兩個(gè)位點(diǎn)，它們位于同一方格的對(duì)稱位置(圖2)。
實(shí)施例二利用cDNA芯片技術(shù)鑒定水稻中的抗病相關(guān)基因用攜帶抗白葉枯病基因或抗稻瘟病基因的四個(gè)水稻材料分別接種與它們呈非親和性反應(yīng)的病原菌(表1)，將病原接種前和接種后1天和5天的水稻葉片總RNA分別反轉(zhuǎn)錄成cDNA并標(biāo)記放射性同位素作探針，并分別與cDNA芯片雜交，通過分析不同探針雜交的同一cDNA位點(diǎn)的雜交信號(hào)的變化，鑒定出一批病原接種前后差異表達(dá)的cDNA克隆，它們代表不同的抗病相關(guān)基因(圖3)(參見Zhou等，The defense-responsive genes showing enhance andrepressed expression after pathogen infection in rice(Oryza sativa L.)，2002，Sci.in China45449-467)。
表1.用于cDNA芯片分析的抗病水稻材料和病原菌組合

其中編號(hào)為EI35I3的cDNA克隆在水稻品種明恢63接種稻瘟病菌株V86013后表達(dá)量增加了3.2倍。鑒于EI35I3克隆在病原菌接種前后表達(dá)量有明顯差異，我們認(rèn)為cDNA克隆EI35I3所代表的基因參與了植物的抗病反應(yīng)，是一個(gè)抗病相關(guān)基因，并將其命名為OsDR8。
實(shí)施例三在分子標(biāo)記遺傳連鎖圖上定位OsDR8基因用一個(gè)三交分離群體(Wang等，1998，Theor.Appl.Genet.97407-412)對(duì)鑒定出的抗病相關(guān)的cDNA克隆EI35I3進(jìn)行染色體定位分析。發(fā)現(xiàn)OsDR8基因位于水稻7號(hào)染色體，其染色體位置與已知的抗稻瘟病QTL(Wang等，1994，Genetics 1361421-1434))相對(duì)應(yīng)(圖4)，提示OsDR8可能就是相對(duì)應(yīng)的抗病QTL的基因(Wen等，Three types of defense-responsivegenes are involved in resistance to bacterial blight and fungal blast diseases in rice，2003，Mol.Gen.Genomics 269331-339)。
實(shí)施例四OsDR8基因在不同水稻抗病品種中的表達(dá)模式分析為了進(jìn)一步驗(yàn)證分析OsDR8是一個(gè)經(jīng)病原物誘導(dǎo)表達(dá)量上升的基因，本發(fā)明首先對(duì)cDNA克隆EI35I3進(jìn)行測(cè)序獲得一條長(zhǎng)1159bp的cDNA序列(位于序列表SEQ ID NO1所示序列的581至1817bp處)。然后根據(jù)cDNA序列設(shè)計(jì)PCR引物，采用RT-PCR(reverse transcriptase-PCR)技術(shù)、利用12種水稻材料—病原菌組合分析OsDR8基因的表達(dá)模式(表2)(Wen等，Three typesof defense-responsive genes are involved in resistance to bacterial blight and fungal blast diseasesin rice，2003，Mol.Gen.Genomics 269331-339)。被分析的水稻材料中，C101A51、C101LAC和CO39是抗稻瘟病近等基因系，IRBB4、IRBB13和IR24是抗白葉枯病近等基因系。在RT-PCR分析中，OsDR8基因特異性PCR引物35I3F(5’-TCCAGCCTCCTCAAGACCT-3’)和35I3R(5’-AGTCCTCCTGCTTCGTCGTA-3’)是根據(jù)該基因的cDNA片段克隆EI35I3的序列設(shè)計(jì)的；另外，用水稻肌動(dòng)蛋白(actin)的PCR引物actinF(5’-TATGGTCAAGGCTGGGTTCG-3’)和actinR(5’-CCATGCTCGATGGGGTACTT-3’)的擴(kuò)增產(chǎn)物作為樣品RNA量的標(biāo)準(zhǔn)。RT-PCR以兩步法進(jìn)行(Zhou等，2002，Science in China 45449-467)。首先，將用于反轉(zhuǎn)錄的總RNA用無RNA酶活性的DNA酶I處理，去除總RNA中可能污染的DNA；將總RNA在65℃處理10分鐘，滅活DNA酶I；將RNA在72℃變性5分鐘，然后加入Oligo-dT15、dNTP、反轉(zhuǎn)錄酶等，在42℃反轉(zhuǎn)錄90分鐘。第二步，取1微升反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作PCR擴(kuò)增。
表2.用于RT-PCR分析的水稻材料和病原菌組合


從RT-PCR分析結(jié)果(圖5)可知接種稻瘟病菌或白葉枯病菌后，OsDR8基因在所有抗病水稻材料中的表達(dá)量都增加了，即病原菌可誘導(dǎo)增強(qiáng)OsDR8基因表達(dá)。這一誘導(dǎo)最早發(fā)生在病原侵染后16小時(shí)(圖5)。而OsDR8基因的表達(dá)在感病水稻材料接種病原菌后和所有水稻材料接水(對(duì)照)后無變化。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)OsDR8是一個(gè)抗病相關(guān)基因，它不僅參于水稻抗白葉枯病反應(yīng)的調(diào)控，也參于抗稻瘟病反應(yīng)的調(diào)控。
實(shí)施例五分離克隆OsDR8基因和基因結(jié)構(gòu)分析1.與OsDR8基因同源基因結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)以O(shè)sDR8基因的cDNA片段克隆EI35I3的序列作模板，用BLAST分析方法(Altschul等，1997，Nucleic Acids Res.253389-3402)檢索核苷酸數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫中來自水稻品種日本晴的一條位于水稻7號(hào)染色體、長(zhǎng)144741bp序列(核苷酸數(shù)據(jù)庫GenBank(http//www.ncbi.nlm.nih.gov)注冊(cè)號(hào)AP004674)的一段序列(第23781至25016bp處)與EI35I3的同源性達(dá)到94％(E值＝0)，提示AP004674中包含與OsDR8同源的基因，即OsDR8的等位基因。
利用GENSCAN(http//genes.mit.edu/GENSCAN.html)、GeneFinder(http//genomic.sanger.ac.uk/gf/gf.shtml)、Gene Feature Searches(http//dot.imgen.bem.tmc.edu9331/)、GeneMark(http//genemark.biology.gatech.edu/GeneMark/hmmchoice.html)等多個(gè)基因結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)軟件，分析AP004674序列中與EI35I3 cDNA序列同源的區(qū)段，推測(cè)AP004674序列中與EI35I3 cDNA同源的基因的編碼區(qū)全長(zhǎng)1059bp。
2.基因末端序列分析采用美國(guó)Invitrogen公司的5’RACE試劑盒，通過5’-RACE(rapid amplification of cDNAend)分析方法，確定OsDR8基因的5’末端序列。進(jìn)行5’-RACE分析的反轉(zhuǎn)錄條件與上述實(shí)施例四中的RT-PCR的反轉(zhuǎn)錄條件一致，反轉(zhuǎn)錄引物是OsDR8基因特異引物GSP1(5’-GTAGGTGATCATGTCG-3’)。反轉(zhuǎn)錄完成后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增引物是OsDR8基因特異引物GSP2(5’-GGACTACCGCAACTCCA-3’)與5’RACE試劑盒錨定引物AbridgedAnchor(5’-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG-3’)。然后通過電泳回收擴(kuò)增片段，用pGEM-T Vector System I試劑盒(美國(guó)Promega Corporation)對(duì)回收片段進(jìn)行克隆。最后對(duì)克隆進(jìn)行測(cè)序分析。序列分析發(fā)現(xiàn)OsDR8基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于GENSCAN預(yù)測(cè)的翻譯起始位點(diǎn)上游349bp處，即OsDR8基因的5’末端非翻譯區(qū)(un-translated region，UTR)長(zhǎng)349bp(位于序列表SEQ ID NO1所示序列的268至616bp處)。
參照推測(cè)的核苷酸數(shù)據(jù)庫GenBank的AP004674序列中與cDNA克隆EI35I3的序列同源基因的結(jié)構(gòu)，并與EI35I3序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)EI35I3序列包括OsDR8基因的3’-UTR。3’-UTR長(zhǎng)64bp(位于序列表SEQ ID NO1所示序列的1754至1817bp處)。由此可知OsDR8基因成熟轉(zhuǎn)錄子全長(zhǎng)為1472bp(位于序列表SEQ ID NO1所示序列的268至1817bp處，不包含內(nèi)含子)。
3.從水稻品種明恢63中分離克隆OsDR8基因?qū)嵤├囊炎C明水稻品種明恢63攜帶有功能的OsDR8基因。本發(fā)明利用cDNA克隆EI35I3作探針，篩選明恢63 BAC(bacterial artificial library)文庫(Peng等，1998，植物學(xué)報(bào)401108-1114)，獲得一陽性克隆5F21。分析AP004674序列中與EI35I3 cDNA同源基因的編碼區(qū)兩側(cè)的限制性內(nèi)切酶消化位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)限制性內(nèi)切酶SamI和BamHI的消化位點(diǎn)分別位于與EI35I3序列同源基因編碼區(qū)的兩側(cè)。用SamI和BamHI消化明恢63 BAC克隆5F21，獲得一個(gè)大約1.9kb的DNA片段。將這一DNA片段連接到質(zhì)粒載體pCAMBIA1301(見Sun等，2004，Plant J.37517-527；王石平等，中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)公開說明書，專利申請(qǐng)?zhí)?2139212.9)上，并命名D55S。
分別用限制性內(nèi)切酶PstI、SacI、KpnI和BamHI+SacI消化質(zhì)粒D55S。通過1％瓊脂糖凝膠電泳回收酶切片段，純化后用T4-DNA聚合酶補(bǔ)平末端，與限制性內(nèi)切酶Sma I消化處理的去磷酸化的pUC19載體(美國(guó)Amersham Bioscience公司)平端連接，電轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B(Sun等，2004，Plant J.37517-527)，通過藍(lán)白斑篩選獲得陽性亞克隆。提取陽性亞克隆質(zhì)粒，并與空pUC19質(zhì)粒進(jìn)行電泳比較，剔除假陽性克隆及小片段克隆，檢測(cè)陽性克隆插入片段大小。
采用M13-R和M13-F通用引物、美國(guó)Perkin Elmer公司的測(cè)序試劑盒(Big Dye Kit)、以雙脫氧核苷酸末端終止法(美國(guó)Perkin Elmer公司)分別從每個(gè)亞克隆的一端或兩端測(cè)序。共計(jì)對(duì)6個(gè)亞克隆進(jìn)行了測(cè)序(圖6)。對(duì)6條亞克隆的序列進(jìn)行拼接，得到一長(zhǎng)1980bp的序列。分析這條1980bp長(zhǎng)的序列，證明它包含OsDR8基因的完整的編碼序列。
4.OsDR8基因內(nèi)含子的確定采用基因預(yù)測(cè)軟件GenScan(http//genes.mit.edu/GENSCAN.html)對(duì)包含OsDR8基因的明恢63基因組的1980bp DNA序列的分析顯示其編碼區(qū)段中存在一個(gè)內(nèi)含子(圖7)。本發(fā)明根據(jù)cDNA克隆EI35I3測(cè)序結(jié)果(位于序列表SEQ ID NO1所示序列的581至1817bp處)與克隆D55S測(cè)序結(jié)果比較，確定在序列表SEQ ID NO1所示序列的1502至1579bp序列中確實(shí)存在一個(gè)78bp的內(nèi)含子。這個(gè)內(nèi)含子與預(yù)測(cè)的內(nèi)含子的大小和位置一致(圖7)。
為了確定OsDR8基因是否存在另外的內(nèi)含子，將EI35I3的cDNA序列與進(jìn)行5’RACE分析獲得的cDNA序列(位于序列表SEQ ID NO1所示序列的268至784bp處)進(jìn)行拼接后與克隆D55S序列進(jìn)行對(duì)比分析，確定OsDR8基因只包含一個(gè)78bp的內(nèi)含子，它位于序列表SEQ ID NO1所示序列的1502至1579bp處。根據(jù)這一結(jié)果OsDR8基因編碼區(qū)被內(nèi)含子分為兩段，分別長(zhǎng)885bp(位于序列表SEQ IDNO1所示序列的617至1501bp處)和174bp(位于序列表SEQ ID NO1所示序列的1580至1753bp處)(圖8)。OsDR8基因全長(zhǎng)1550bp(位于序列表SEQ ID NO1所示序列的268至1817bp處)(圖8)。
實(shí)施例六OsDR8基因編碼產(chǎn)物的分析根據(jù)BLAST分析結(jié)果，OsDR8基因編碼的蛋白質(zhì)與植物維生素B1合成酶有較高的同源性。如OsDR8基因的編碼產(chǎn)物與玉米的維生素B1的生物合成酶基因thil-1的編碼產(chǎn)物(National Center for Biotechnology Information(NCBI，http//www.ncbi.nlm.nih.gov)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫注冊(cè)號(hào)S61419)同源，氨基酸一致性為73％(E值＝e-142)，與玉米的維生素B1的生物合成酶基因thil-2的編碼產(chǎn)物(NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫注冊(cè)號(hào)S61420)同源，氨基酸一致性為73％(E值＝e-141)，與甜橙的維生素B1的生物合成酶(NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫注冊(cè)號(hào)T10474)氨基酸一致性為72％(E值＝e-132)。以上證據(jù)說明，OsDR8基因的編碼產(chǎn)物極有可能是一種維生素B1合成酶。
實(shí)施例七OsDR8基因的功能驗(yàn)證本發(fā)明采用RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)、通過抑制抗病水稻品種明恢63中OsDR8基因的表達(dá)，驗(yàn)證該基因的功能。這個(gè)技術(shù)途徑的主要機(jī)理將目標(biāo)基因的部分片段以反向重復(fù)的形式與能夠表達(dá)雙鏈RNA(double strand RNA，dsRNA)的載體連接，通過遺傳轉(zhuǎn)化將該載體導(dǎo)入植物中。獲得的轉(zhuǎn)化植株大量表達(dá)與目標(biāo)基因部分片段同源的dsRNA。這些dsRNA迅速形成短干擾RNA(short interfering RNA，siRNA)。這些siRNA與目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄子(mRNA)互補(bǔ)配對(duì)，在細(xì)胞內(nèi)特殊酶的作用下使目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄子降解，從而在mRNA水平上抑制目標(biāo)基因的功能。研究者可以通過轉(zhuǎn)基因植株表型的改變，驗(yàn)證目標(biāo)基因的功能。RNA干擾技術(shù)已被廣泛用于基因功能的驗(yàn)證(Smith等，2000，Nature 407319-320)本發(fā)明用下列dsF和dsR序列作為PCR引物，含OsDR8基因cDNA片段的cDNA克隆(EI35I3，pSPORT1載體(該載體見儲(chǔ)昭暉等，水稻全生育期均一化cDNA文庫的構(gòu)建和鑒定，2002，科學(xué)通報(bào)471656-1662))為模板，通過PCR擴(kuò)增得到待轉(zhuǎn)化的DNA片段。為了便于PCR產(chǎn)物的克隆，dsF和dsR引物的5’-端標(biāo)有下劃線的部分為限制性酶SpeI和AscI或者SacI和AvrII的消化位點(diǎn)，隨后的3’-端的序列則分別與載體pSPORT1多克隆位點(diǎn)兩側(cè)的序列匹配。
SpeI AscIdsF5’-TAACTAGTGGCGCCTGCAGGTACCGGTCCG-3’SacI AvrIIdsR5’-TAGAGCTCGCCTAGGTGCACGCGTACGTACGTAAGC-3’
構(gòu)建OsDR8基因片段的第一重復(fù)鏈(正向鏈)用AscI和AvrII消化部分PCR產(chǎn)物及載體pMCG161(依據(jù)載體pMCG161的使用說明，http//www.chromdb.org/info/plasmids/pMCG161.html)，消化完全后在75℃水浴10min滅活限制性內(nèi)切酶，置于冰上，用T4DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)。電轉(zhuǎn)后獲得的克隆質(zhì)粒用dsF和dsR引物擴(kuò)增篩選陽性克隆。
構(gòu)建OsDR8基因片段的第二重復(fù)鏈(反向鏈)用SacI和SpeI消化剩余的PCR產(chǎn)物和連接了第一重復(fù)鏈的克隆質(zhì)粒，消化完全后在75℃水浴10min滅活限制性內(nèi)切酶，用T4D16A連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)。電轉(zhuǎn)后獲得的克隆質(zhì)粒用SacI和SpeI雙酶消化反應(yīng)篩選陽性克隆，陽性克隆命名為D16R。
將構(gòu)建好的雙鏈RNA載體D16R電轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞EHA105，保存菌株用作農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化。
采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法(Lin和Zhang，Optimising the tissue culture conditions forhigh efficiency transformation of indica rice，2005，Plant Cell Rep.23540-547)將D16R導(dǎo)入抗病水稻品種明恢63。獲得的遺傳轉(zhuǎn)化植株被命名為D16RMH(其中D16R為遺傳轉(zhuǎn)化載體名稱，MH代表水稻品種明恢63)。本發(fā)明共獲得獨(dú)立轉(zhuǎn)化植株30株。對(duì)全部30株植株在成株期階段接種白葉枯病菌株P(guān)XO61，發(fā)現(xiàn)15株轉(zhuǎn)化植株的抗性不同程度減弱；與轉(zhuǎn)基因的受體水稻品種明恢63、以及陰性轉(zhuǎn)化植株D16RMH-24和D16RMH-30相比，這些抗性減弱的轉(zhuǎn)化植株的病斑面積(病斑長(zhǎng)/病葉長(zhǎng)×％)增加7％-42％(表3)。
表3.部分T0代轉(zhuǎn)化植株(D16RMH)對(duì)白葉枯病菌株P(guān)XO61的反應(yīng)

(1)除特殊標(biāo)注的植株外每株轉(zhuǎn)基因植株接種3-5片葉，兩周后調(diào)查病斑和病葉長(zhǎng)度，每個(gè)數(shù)據(jù)來自于多個(gè)葉片的平均值。
(2)陰性轉(zhuǎn)化植株，其它植株為陽性轉(zhuǎn)化植株。
為進(jìn)一步驗(yàn)證轉(zhuǎn)化植株的抗病能力減弱是否與OsDR8基因表達(dá)量相關(guān)，本發(fā)明對(duì)表3中所列17株轉(zhuǎn)化植株抽提總RNA，利用Rotor-Gene 3000TM定量PCR儀(Rotor-Gene公司)、SYBR Green熒光嵌入染料和Rotor-Gene公司的定量PCR分析方法做定量RT-PCR分析，比較轉(zhuǎn)化植株和對(duì)照材料中OsDR8基因表達(dá)量。PCR反應(yīng)引物是35I3F(5’-TCCAGCCTCCTCAAGACCT-3’)和35I3R(5’-AGTCCTCCTGCTTCGTCGTA-3’)。以水稻肌動(dòng)蛋白的RT-PCR產(chǎn)物作為樣品量一致性對(duì)照。肌動(dòng)蛋白PCR引物序列是actin(5’-TGCTATGTACGTCGCCATCCAG-3’)和actinR(5’-AATGAGTAACCACGCTCCGTCA-3’)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)化植株中OsDR8基因的表達(dá)狀況與植株的表型共分離(圖9)。OsDR8基因表達(dá)量與抗病性減弱的轉(zhuǎn)化植株呈負(fù)相關(guān)；抗病性減弱的轉(zhuǎn)化植株中OsDR8基因的表達(dá)量與對(duì)照材料明恢63相比顯著減少。而抗病表型無明顯變化的轉(zhuǎn)化植株(D16RMH-24和D16RMH-30)中OsDR8基因表達(dá)量與明恢63相比無明顯變化。該結(jié)果說明了OsDR8基因在水稻抗白葉枯病反應(yīng)過程當(dāng)中發(fā)揮相當(dāng)重要的作用。
另外，本發(fā)明也證明轉(zhuǎn)化植株對(duì)稻瘟病菌的抗性也減弱了。取轉(zhuǎn)化植株和對(duì)照材料的葉片，采用點(diǎn)接種(spot inoculation)方法(Jia等，Determination of host responses to Magnaporthegrisea on detached rice leaves using a spot inoculation method，2003，Plant Disease 87129-133)在室內(nèi)接種稻瘟病菌V86013進(jìn)行觀察，OsDR8基因表達(dá)量降低的轉(zhuǎn)化植株葉片上稻瘟病菌的生長(zhǎng)繁殖狀況都明顯好于對(duì)照抗病品種明恢63，而與感病品種牡丹江8號(hào)情況相似；部分轉(zhuǎn)基因植株的葉片上甚至形成了典型的病斑(圖10)。說明OsDR8基因在水稻抗稻瘟病反應(yīng)中也發(fā)揮作用。
OsDR8基因與玉米的維生素B1的生物合成酶基因thil高度同源。thil基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)的定位情況表明它在質(zhì)體膜上，因?yàn)樵摶虻牡鞍踪|(zhì)產(chǎn)物的氨基端有一個(gè)質(zhì)體定位序列，并且有很多的疏水氨基酸，因此推測(cè)該基因產(chǎn)物所在場(chǎng)所質(zhì)體即為維生素B1的合成場(chǎng)所(Belanger等，1995，Plant Mol Biol，29809-821)。維生素B1是生物體內(nèi)許多的代謝有關(guān)酶類的輔助因子，這些代謝途徑包括三羧酸循環(huán)、戊糖磷酸途徑、厭氧呼吸、氨基酸合成分支途徑和色素生物合成等。如β-胡蘿卜素合成所經(jīng)歷的一個(gè)代謝途徑將丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A所需的酶丙酮酸脫氫酶需要維生素B1為輔助因子，而維生素B1活性形式為硫胺素焦磷酸作為輔助因子參與代謝(Schulze-Siebert等，1987，Plant Physiol，841233-1237)。有研究表明維生素B1除了在一些植物的生化代謝途徑中起作用，它同樣也可以作為一個(gè)誘導(dǎo)因子刺激植物體內(nèi)的病程相關(guān)蛋白(PR-1)的積累，增加煙草對(duì)煙草花葉病毒的抗性(Malamy等，1996，Mol Plant-Microbe Interact，9474-482)。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推測(cè)OsDR8基因的功能可能是抗病植物受病原菌侵染后，誘導(dǎo)產(chǎn)生了該基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，從而促進(jìn)了維生素B1的大量合成；而維生素B1可以轉(zhuǎn)化為其活性形式作為輔助因子增強(qiáng)一些代謝有關(guān)酶的活性，使植物產(chǎn)生大量的生理生化變化抵制病害，同時(shí)由于維生素B1的積累可以誘導(dǎo)病程相關(guān)蛋白的產(chǎn)生而控制病害。
序列表SEQ ID NO1<110>華中農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>水稻抗病相關(guān)基因OsDR8<130>
<141>2005-01-30<160>3<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1980<212>DNA<213>Oryza sativa<220>
<221>gene<222>(268)..(1817)<223>
<220>
<221>3’UTR<222>(1754)..(1817)<223>
<220>
<221>CDS<222>(617)..(1501)<223>
<220>
<221>CDS<222>(1580)..(1753)<223>
<220>
<221>Intron<222>(1502)..(1579)<223>
<220>
<221>5’UTR<222>(268)..(616)<223>
<400>1gggctccacc actagtaccc ctcactacag gtagccataa aaaaaatcga tcaccaaaac 60ccattattag gttgtgtact gatacagaaa gttgggaacc aatctcccag cacagaaaac120ggtacggttc attagcgcgt gattaattaa atatttacta ttttttaaaa aaaatagatc180aatatgattt ttaagcaact ttcgtataaa tactttttca aaaaaacaca ccgttttcta240gtttgaaaag cgtacacgcg tgaaatgagg gagaaaggtt ggaaacgtgg gattgcaaac300acagcattag tcgtcacggt acccagcaaa aaatcactga acacagcacc actgttcccg360tgagtccgta acttagcagc acttgtcccg ttctcctgaa gacagtccaa aaaccctcac420taaaccttcc caaaatatct cctccaatca atccgaaacc cagaggccca tactgctgac480acgtggacgg cactcccaga tatttgcgct ctcctcttct tcttataccc ccgccaaccc540acgctctatc cactcacaca cacactcctc atcccagagc aagaagctca gctcctcctc600ctctcgcatg gcagcc atg gcc acc acc gcg tcc agc ctc ctc aag acc tcc652Met Ala Thr Thr Ala Ser Ser Leu Leu Lys Thr Ser1 5 10
ttc gcc ggc gtg cgc ctc ccc gcc gcc gcc cgc aac ccc acc gtc tcc 700Phe Ala Gly Val Arg Leu Pro Ala Ala Ala Arg Asn Pro Thr Val Ser15 20 25gtc gcg ccg cgc acc gga ggc gcc atc tgc aac tcc atc tcg tcg tcg 748Val Ala Pro Arg Thr Gly Gly Ala Ile Cys Asn Ser Ile Ser Ser Ser30 35 40tcg tcc act ccc ccc tac gac ctc aac gcc atc agg ttc agc ccc atc 796Ser Ser Thr Pro Pro Tyr Asp Leu Asn Ala Ile Arg Phe Ser Pro Ile45 50 55 60aag gag tcc atc gtg tcc cgc gag atg acc cgg cgg tac atg acc gac 844Lys Glu Ser Ile Val Ser Arg Glu Met Thr Arg Arg Tyr Met Thr Asp65 70 75atg atc acc tac gcc gac acc gac gtc gtc gtc gtc ggc gcc ggc tcc 892Met Ile Thr Tyr Ala Asp Thr Asp Val Val Val Val Gly Ala Gly Ser80 85 90gcg ggg ctc tcc tgc gcg tac gag ctc tcc aag gac ccc tcc gtc agc 940Ala Gly Leu Ser Cys Ala Tyr Glu Leu Ser Lys Asp Pro Ser Val Ser95 100 105gtc gcc gtc atc gag cag tcg gtg tcc ccc ggc ggc ggc gcg tgg ctc 988Val Ala Val Ile Glu Gln Ser Val Ser Pro Gly Gly Gly Ala Trp Leu110 115 120ggc ggg cag ctg ttc tcc gcc atg gtg gtg cgc aag ccg gcg cac ctg1036Gly Gly Gln Leu Phe Ser Ala Met Val Val Arg Lys Pro Ala His Leu125 130 135 140ttc ctc gac gag ctc ggc gtc gcg tac gac gag cag gag gac tac gtc1084Phe Leu Asp Glu Leu Gly Val Ala Tyr Asp Glu Gln Glu Asp Tyr Val145 150 155gtc atc aag cac gcc gcg ctc ttc acc tcc acc gtc atg agc cgc ctc1132Val Ile Lys His Ala Ala Leu Phe Thr Ser Thr Val Met Ser Arg Leu160 165 170ctg gcg cgc ccc aac gtg aag ctg ttc aac gcc gtc gcc gtc gag gac1180Leu Ala Arg Pro Asn Val Lys Leu Phe Asn Ala Val Ala Val Glu Asp175 180 185ctc atc gtc aag aag ggc cgg gtc ggc cgg gtg gtc acc aac ttg ggc1228Leu Ile Val Lys Lys Gly Arg Val Gly Arg Val Val Thr Asn Leu Gly190 195 200gct tgt gtc aat gac cac gac acg cag ccg ggc atg gac cca aac gtg1276Ala Cys Val Asn Asp His Asp Thr Gln Pro Gly Met Asp Pro Asn Val205 210 215 220
atg gag ttc aag gtg gtg gtg agc tcc tgc ggc cac gac ggg ccg ttc1324Met Glu Phe Lys Val Val Val Ser Ser Cys Gly His Asp Gly Pro Phe225 230 235ggc gcc acg ggc gtc aag cgg ctg cag gac atc ggc atg atc gac gcc1372Gly Ala Thr Gly Val Lys Arg Leu Gln Asp Ile Gly Met Ile Asp Ala240 245 250gtg ccc ggc atg cgc gcc ctc gac atg aac acc gcc gag gac gag atc1420Val Pro Gly Met Arg Ala Leu Asp Met Asn Thr Ala Glu Asp Glu Ile255 260 265gtc cgc ctc acc cgc gag gtc gtc ccc ggc atg atc gtc acc ggc atg1468Val Arg Leu Thr Arg Glu Val Val Pro Gly Met Ile Val Thr Gly Met270 275 280gag gtc gcc gag atc gac ggc gcc ccg aga atg gtacgcacca aaaaaacatc 1521Glu Val Ala Glu Ile Asp Gly Ala Pro Arg Met285 290 295aaactcttca ccataatctc tcccccgttc ttggatttga acaaattcgt tgttgcag1579ggc ccg acg ttc gga gcc atg atg atc tcc ggc cag aag gcg gcg cac1627Gly Pro Thr Phe Gly Ala Met Met Ile Ser Gly Gln Lys Ala Ala His300 305 310ctg gcg ctg aag gcg ctc ggc cgg ccg aac gcc atc gac ggc acg atc1675Leu Ala Leu Lys Ala Leu Gly Arg Pro Asn Ala Ile Asp Gly Thr Ile315 320 325aag aag gcg gcg gcg gcg gcg gcg cac ccg gag ctg atc ctg gcg tcg1723Lys Lys Ala Ala Ala Ala Ala Ala His Pro Glu Leu Ile Leu Ala Ser330 335 340aag gac gac ggc gag atc gtg gac gcc tga gcaaataaaa cagggtaaaa 1773Lys Asp Asp Gly Glu Ile Val Asp Ala345 350aaaaatcccc caaacgtggt ggtgacacgg aggggttggg gaccaaaaaa aaatgtggac 1833tttcccctgt gttttttttt cgggatttgc tttgatcccc ttgtttgttt tagctttgga 1893ggttgataag ggttttgtta aaaacaattc ccctcccacc gggtgtgtgt ggtttgcttg 1953cctaatgagg gcaaaaaaac ttccatg 1980<210>2<211>295<212>PRT<213>Oryza sativa<400>2Met Ala Thr Thr Ala Ser Ser Leu Leu Lys Thr Ser Phe Ala Gly Val1 5 10 15
Arg Leu Pro Ala Ala Ala Arg Asn Pro Thr Val Ser Val Ala Pro Arg20 25 30Thr Gly Gly Ala Ile Cys Asn Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Pro35 40 45Pro Tyr Asp Leu Asn Ala Ile Arg Phe Ser Pro Ile Lys Glu Ser Ile50 55 60Val Ser Arg Glu Met Thr Arg Arg Tyr Met Thr Asp Met Ile Thr Tyr65 70 75 80Ala Asp Thr Asp Val Val Val Val Gly Ala Gly Ser Ala Gly Leu Ser85 90 95Cys Ala Tyr Glu Leu Ser Lys Asp Pro Ser Val Ser Val Ala Val Ile100 105 110Glu Gln Ser Val Ser Pro Gly Gly Gly Ala Trp Leu Gly Gly Gln Leu115 120 125Phe Ser Ala Met Val Val Arg Lys Pro Ala His Leu Phe Leu Asp Glu130 135 140Leu Gly Val Ala Tyr Asp Glu Gln Glu Asp Tyr Val Val Ile Lys His145 150 155 160Ala Ala Leu Phe Thr Ser Thr Val Met Ser Arg Leu Leu Ala Arg Pro165 170 175Asn Val Lys Leu Phe Asn Ala Val Ala Val Glu Asp Leu Ile Val Lys180 185 190Lys Gly Arg Val Gly Arg Val Val Thr Asn Leu Gly Ala Cys Val Asn195 200 205Asp His Asp Thr Gln Pro Gly Met Asp Pro Asn Val Met Glu Phe Lys210 215 220Val Val Val Ser Ser Cys Gly His Asp Gly Pro Phe Gly Ala Thr Gly225 230 235 240Val Lys Arg Leu Gln Asp Ile Gly Met Ile Asp Ala Val Pro Gly Met245 250 255Arg Ala Leu Asp Met Asn Thr Ala Glu Asp Glu Ile Val Arg Leu Thr260 265 270Arg Glu Val Val Pro Gly Met Ile Val Thr Gly Met Glu Val Ala Glu275 280 285
Ile Asp Gly Ala Pro Arg Met290 295<210>3<211>57<212>PRT<213>Oryza sativa<400>3Gly Pro Thr Phe Gly Ala Met Met Ile Ser Gly Gln Lys Ala Ala His1 5 10 15Leu Ala Leu Lys Ala Leu Gly Arg Pro Asn Ala Ile Asp Gly Thr Ile20 25 30Lys Lys Ala Ala Ala Ala Ala Ala His Pro Glu Leu Ile Leu Ala Ser35 40 45Lys Asp Asp Gly Glu Ile Val Asp Ala50 5權(quán)利要求
1.賦予水稻對(duì)白葉枯病和稻瘟病產(chǎn)生抗性的DNA序列，它是SEQ ID NO1中所示的DNA序列，它包括完整的OsDR8基因。
2.OsDR8基因的編碼區(qū)，它是SEQ ID NO1中第617-1501位和第1580-1753位所示的DNA序列或者是編碼與SEQ ID NO1編碼的蛋白質(zhì)相同的蛋白質(zhì)的DNA序列。
3.權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)所述的DNA序列在增加水稻對(duì)白葉枯病和稻瘟病抗性中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及植物生物技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及包含水稻抗病相關(guān)基因OsDR8的DNA片段的分離克隆和功能驗(yàn)證。利用基于RNA干擾(RNA interference，RNAi)原理的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將OsDR8基因的部分DNA片段與能夠表達(dá)雙鏈RNA的載體連接并轉(zhuǎn)入抗病水稻品種，抑制抗病水稻品種中OsDR8基因的表達(dá)。OsDR8基因表達(dá)量顯著降低的遺傳轉(zhuǎn)化水稻對(duì)白葉枯病菌和稻瘟病菌的抗性明顯減弱，證明OsDR8基因在水稻抗白葉枯病和抗稻瘟病中發(fā)揮重要作用。
文檔編號(hào)C07K14/415GK1814760SQ200510018240
公開日2006年8月9日 申請(qǐng)日期2005年2月2日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月2日
發(fā)明者王石平, 王宮南 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)