用于基于控制介質(zhì)流動(dòng)的三維組織測(cè)量的裝置和方法
【專利摘要】本申請(qǐng)公開(kāi)了一種包括多個(gè)井的、用于進(jìn)行三維細(xì)胞試樣(例如組織試樣)分析的裝置以及用于通過(guò)三維試樣來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的方法。與該裝置一起使用的可拆卸插入件使得能夠進(jìn)行由柱塞驅(qū)動(dòng)的、三維試樣的灌注。
【專利說(shuō)明】用于基于控制介質(zhì)流動(dòng)的三維組織測(cè)量的裝置和方法
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 根據(jù)35U.S. C § 119(e)，本申請(qǐng)要求美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)No. 61/725781的優(yōu)先權(quán)， 該美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)No. 61/725781的申請(qǐng)日為2012年11月13日，該文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容結(jié) 合到本申請(qǐng)中，作為參考。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003] 本發(fā)明通常涉及用于進(jìn)行三維細(xì)胞試樣（即組織試樣）的分析的裝置和方法。

【背景技術(shù)】
[0004] 長(zhǎng)期以來(lái)認(rèn)為，癌細(xì)胞的新陳代謝表現(xiàn)型的明顯不同與基礎(chǔ)機(jī)理相關(guān)聯(lián)，該基礎(chǔ) 機(jī)理提供了用于存活和增殖的選擇優(yōu)點(diǎn)。不過(guò)，激發(fā)腫瘤發(fā)生的精確機(jī)理并不很好理解。 已經(jīng)假定糖酵解適應(yīng)是允許腫瘤在特征為低PH和氧張力的微觀環(huán)境中增殖的存活機(jī)理。 "Warburg轉(zhuǎn)換"的這些適應(yīng)通過(guò)增加葡萄糖攝取和ATP合成以便滿足用于生物合成、能量 和減少等效物的要求、而對(duì)于腫瘤提供了選擇優(yōu)點(diǎn)。
[0005] 在測(cè)量關(guān)鍵分析物（該關(guān)鍵分析物指示在微環(huán)境中的有氧代謝（O2)、糖酵解（H +) 和中間代謝（CO2))流量的儀器發(fā)展的最近進(jìn)步可以提供對(duì)惡性轉(zhuǎn)變的基礎(chǔ)原理的理解。不 過(guò)，這些系統(tǒng)設(shè)計(jì)和優(yōu)化成用于基于細(xì)胞的化驗(yàn)，可能缺少環(huán)境控制，并通常并不方便測(cè)量 多細(xì)胞組織試樣（由于腔室尺寸限制、試樣的穩(wěn)定和灌注困難）。
[0006] Seahorse Bioscience，Billerica，Mass.在 2007 年發(fā)布了 XF96"Extracellular Flux Analyzer"。從那時(shí)起，已經(jīng)采用該產(chǎn)品作為用于定量測(cè)量線粒體功能和細(xì)胞生物能 的技術(shù)平臺(tái)。XF測(cè)量在完全集成的儀器中進(jìn)行，該儀器測(cè)量在基于細(xì)胞的化驗(yàn)的細(xì)胞外介 質(zhì)中的多種分析物（0 2、H+、CO2)的濃度。分析物濃度在細(xì)胞周圍的較小容積內(nèi)非侵入地測(cè) 量，從而提供了作為時(shí)間（從該時(shí)間起能夠確定生物能流量（例如：d0 2/dt =氧消耗速率； dpH/dt=細(xì)胞外酸化速率）函數(shù)的分析物濃度變化的定量測(cè)量。XF測(cè)量基于這樣的方法， 其中，在細(xì)胞周圍產(chǎn)生很小的暫時(shí)測(cè)量容積，或者傳感器布置成緊鄰細(xì)胞。在這種情況下的 測(cè)量放大了濃度的變化，從而能夠從一組光學(xué)傳感器中收集高度靈敏的且時(shí)間分辨的測(cè)量 值。一旦進(jìn)行測(cè)量，柱塞（探針）升高，細(xì)胞周圍的介質(zhì)恢復(fù)至它的初始狀態(tài)。這種非破壞 性方法能夠在多種刺激條件下（基本的環(huán)境變化、化合物刺激物）對(duì)于生物試樣連續(xù)地收 集多個(gè)測(cè)量值。
[0007] 通過(guò)測(cè)量關(guān)鍵的代謝參數(shù)例如氧消耗速率（OCR)和細(xì)胞外酸化速率（ECAR)，可以 根據(jù)用于產(chǎn)生能量和生物合成的基質(zhì)和通路（糖酵解或氧化磷酸化）來(lái)發(fā)展生物能表現(xiàn)型 的輪廓。產(chǎn)品能夠定量測(cè)量線粒體功能和細(xì)胞的細(xì)胞生物能。
[0008] 還需要一種系統(tǒng)，它能夠測(cè)量在多細(xì)胞組織中的、例如有氧代謝、糖酵解和中間代 謝的關(guān)鍵分析物的測(cè)量值。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 這里介紹的儀器和方法能夠測(cè)量組織試樣或細(xì)胞群體（例如腫瘤組織試樣）的生 物能參數(shù)，以便產(chǎn)生它的代謝輪廓，從而能夠例如更好地理解惡性發(fā)展的機(jī)理。因此，本發(fā) 明的實(shí)施例能夠測(cè)試生理上相關(guān)的假設(shè)，該假設(shè)直到現(xiàn)在都不能通過(guò)其它方法來(lái)測(cè)試，例 如能夠測(cè)量和定量腫瘤中的表現(xiàn)型轉(zhuǎn)換。
[0010] 本發(fā)明的實(shí)施例包括用于進(jìn)行三維細(xì)胞試樣分析的裝置。該裝置可以包括井板， 這些井裝載組織試樣，該組織試樣通過(guò)將板布置在如這里所述專門用于在板的井中的化驗(yàn) 的機(jī)器中而進(jìn)行測(cè)試。板通常確定多個(gè)井，該井用于保持各試樣和試樣介質(zhì)，其中，至少一 個(gè)井（通常整組井）包括布置于其中的試樣嵌套部位?？撞贾迷谠嚇忧短撞课簧厦?，該孔 的尺寸設(shè)置成與柱塞相互配合，該柱塞在孔內(nèi)和在布置于所述井中的試樣介質(zhì)內(nèi)豎直向下 運(yùn)動(dòng)。實(shí)際上，優(yōu)選是使得井或井板在臺(tái)架或平臺(tái)上保持就位，并自動(dòng)化地運(yùn)動(dòng)柱塞，但是 也可以（但并不優(yōu)選）使得柱塞保持靜止和使得板運(yùn)動(dòng)。結(jié)構(gòu)還確定了介質(zhì)槽道，該介質(zhì) 槽道與所述試樣嵌套部位流體連通。該介質(zhì)槽道允許介質(zhì)由柱塞移動(dòng)而流過(guò)，并允許試樣 在柱塞運(yùn)動(dòng)時(shí)暴露于新鮮介質(zhì)。
[0011] 可以包括一個(gè)或多個(gè)以下特征。柱塞優(yōu)選是相對(duì)于嵌套部位運(yùn)動(dòng)，以便引起在試 樣周圍的介質(zhì)灌注，優(yōu)選是在向下和向上沖程中。也可選擇，柱塞和試樣嵌套部位可以一起 運(yùn)動(dòng)，以便使得試樣暴露于介質(zhì)的不同區(qū)域。介質(zhì)槽道可以包括流體通路，該流體通路使得 在試樣周圍灌注的介質(zhì)返回至布置于井中的介質(zhì)。孔、試樣嵌套部位和/或介質(zhì)槽道可以 由可拆卸的井插入件來(lái)確定。
[0012] 試樣嵌套部位可以包括由可拆卸的井插入件的一部分確定或者作為該插入件一 部分的、介質(zhì)可透過(guò)的平臺(tái)。井可以包括與介質(zhì)槽道流體連通的貯槽。試樣嵌套部位可以 布置在貯槽中，介質(zhì)收集在該貯槽中，并流過(guò)介質(zhì)槽道。
[0013] 介質(zhì)槽道可以包括流體通路，該流體通路確定在井中的介質(zhì)表面下面的閉合環(huán) 路，以便當(dāng)柱塞在所述孔內(nèi)向上和向下運(yùn)動(dòng)時(shí)都允許介質(zhì)在所述試樣周圍灌注流動(dòng)。止回 閥可以包含在介質(zhì)槽道中，以便防止耗盡的介質(zhì)在柱塞的向上運(yùn)動(dòng)過(guò)程中從槽道回流至試 樣。
[0014] 裝置可以包括傳感器，用于檢測(cè)布置在試樣周圍的介質(zhì)中的、由試樣分泌或吸收 的溶質(zhì)的濃度。傳感器可以設(shè)置在至少一個(gè)井的底部。傳感器可以包括對(duì)于在介質(zhì)中的 一種或多種溶質(zhì)的濃度敏感的熒光團(tuán)，該熒光團(tuán)安裝在柱塞上，以便測(cè)量在組織試樣附近 的區(qū)域中的、例如氧、〇) 2或H+的濃度。傳感器可以包括小珠，該小珠涂覆有特定細(xì)胞活素、 趨化素、激素或由組織吸收或分泌的其它生物分子（它們將固定在小珠上）的特殊膠合劑。 小珠可以就地在井中的貯槽內(nèi)用探針探測(cè)，以便能夠檢測(cè)由組織分泌或吸收（take up)的 感興趣分子的濃度。也可選擇，小珠可以與介質(zhì)分離并進(jìn)行分析。在一些實(shí)施例中，標(biāo)出的 (spotted)抗體可以代替小珠布置在井的底部部分中，并與灌注通過(guò)井的介質(zhì)流體連通。標(biāo) 出的抗體可以用于檢測(cè)其它感興趣的分子。
[0015] 裝置可以包括柱塞，該柱塞用于在各井的孔內(nèi)往復(fù)運(yùn)動(dòng)。在優(yōu)選實(shí)施例中，熒光團(tuán) 傳感器可以布置在柱塞上，用于檢測(cè)布置在試樣周圍的介質(zhì)中的溶質(zhì)濃度。傳感器可以測(cè) 量溶解在試樣周圍的介質(zhì)中的氧、二氧化碳和/或氫離子的濃度。
[0016] 多個(gè)井可以確定多井板，例如包括24或96個(gè)井。
[0017] 氧、二氧化碳和/或生物惰性氣體的源可以與井中的介質(zhì)或在井中的介質(zhì)表面上 面的頂部空間流體連通，用于控制在該頂部空間中或介質(zhì)中的氣體的組成。生物活性物質(zhì) 的溶液源與井中的介質(zhì)流體連通，用于使得試樣暴露于所述物質(zhì)。
[0018] 三維細(xì)胞生長(zhǎng)支架（scaffold)可以布置在所述試樣嵌套部位上。
[0019] 在另一方面，本發(fā)明的實(shí)施例可以包括一種用于進(jìn)行三維細(xì)胞試樣的分析的裝 置。該裝置可以包括井，用于保持試樣和試樣介質(zhì)，該井包括試樣嵌套部位?？卓梢圆贾迷?所述嵌套部位上面，該孔的尺寸設(shè)置成與柱塞相互配合，該柱塞在孔內(nèi)和在布置于所述井 中的介質(zhì)內(nèi)豎直向下運(yùn)動(dòng)。裝置還可以包括：介質(zhì)槽道，該介質(zhì)槽道與所述試樣嵌套部位流 體連通，該介質(zhì)槽道允許介質(zhì)灌注至所述試樣周圍；以及柱塞，用于在所述孔中往復(fù)運(yùn)動(dòng)， 以便推動(dòng)介質(zhì)灌注至所述試樣周圍。
[0020] 裝置可以選擇地包括傳感器，用于檢測(cè)在試樣嵌套部位周圍的介質(zhì)中的溶解介質(zhì) 組分的濃度。
[0021] 在還一方面，本發(fā)明實(shí)施例的特征在于一種用于培養(yǎng)板的井的插入件，用于使得 井適合實(shí)施布置于其中的三維細(xì)胞培養(yǎng)試樣的灌注。該插入件包括這樣的結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)確 定了 ：（i)試樣嵌套部位，該試樣嵌套部位包括介質(zhì)可透過(guò)的平臺(tái)；和（ii)布置在其上面的 孔，該孔的尺寸設(shè)置成與柱塞相互配合，該柱塞在孔內(nèi)和在布置于井中的介質(zhì)內(nèi)豎直向下 運(yùn)動(dòng)。插入件還可以確定介質(zhì)槽道，該介質(zhì)槽道與所述試樣嵌套部位流體連通，該介質(zhì)槽道 允許介質(zhì)由柱塞推動(dòng)灌注至所述試樣周圍。
[0022] 在另一方面，本發(fā)明實(shí)施例的特征在于一種對(duì)于三維細(xì)胞培養(yǎng)試樣例如組織試 樣、活檢試樣或保持細(xì)胞的細(xì)胞支架進(jìn)行試驗(yàn)的方法，以便保持試樣的生存力和對(duì)它的微 環(huán)境進(jìn)行控制。該方法包括提供一種結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)限定井，該井包括：試樣嵌套部位；孔，該 孔的尺寸設(shè)置成與布置在試樣嵌套部位上面的柱塞相互配合；介質(zhì)槽道，該介質(zhì)槽道與所 述試樣嵌套部位流體連通；以及柱塞，該柱塞用于在孔中往復(fù)運(yùn)動(dòng)。將試樣布置在井內(nèi)的介 質(zhì)中的試樣嵌套部位上。使得柱塞在孔內(nèi)運(yùn)動(dòng)，以便推動(dòng)介質(zhì)在試樣周圍流動(dòng)和流過(guò)所述 槽道，從而以介質(zhì)灌注試樣。
[0023] 可以包括一個(gè)或多個(gè)以下特征。氣體可以添加給介質(zhì)或在井中在介質(zhì)上面的頂部 空間，以便通過(guò)改變?nèi)芙鈿怏w組分來(lái)改變?cè)嚇又車奈h(huán)境。生物活性物質(zhì)（例如藥物、候 選藥物或毒素）的溶液可以添加給介質(zhì)，以便通過(guò)使得試樣暴露于生物活性物質(zhì)而改變?cè)?樣周圍的微環(huán)境。
[0024] 還可以測(cè)量在所述試樣周圍的介質(zhì)中的一種或多種溶質(zhì)的濃度。還可以進(jìn)行在所 述試樣周圍的介質(zhì)中的一種或多種溶質(zhì)的濃度的多次測(cè)量，這些測(cè)量在時(shí)間上分開(kāi)。
[0025] 可以將計(jì)量量的一種或多種氣體和/或一種或多種溶質(zhì)添加給所述井中的介質(zhì)， 從而將所述試樣周圍的介質(zhì)中的微環(huán)境設(shè)置成預(yù)定點(diǎn)。微環(huán)境可以設(shè)置成缺氧條件。氧清 除劑可以添加給介質(zhì)。
[0026] 可以將人體活檢組織試樣布置在所述嵌套部位上，可以將可能的治療藥物添加給 介質(zhì)，以及可以估計(jì)藥物對(duì)試樣的效果。
[0027] 試樣可以是腫瘤試樣，還可以將計(jì)量量的一種或多種氣體和/或一種或多種溶質(zhì) 添加給所述井中的介質(zhì)，從而將所述試樣周圍的介質(zhì)中的微環(huán)境設(shè)置成預(yù)定點(diǎn)，從而模擬 腫瘤試樣在活體內(nèi)的微環(huán)境。
[0028] 該方法還可以通過(guò)提供多個(gè)井來(lái)進(jìn)行多路復(fù)用，該井包括：試樣嵌套部位；孔，該 孔的尺寸設(shè)置成與布置在相應(yīng)試樣嵌套部位上面的柱塞相互配合；介質(zhì)槽道，該介質(zhì)槽道 與各試樣嵌套部位流體連通；以及柱塞，該柱塞用于在所述孔中往復(fù)運(yùn)動(dòng)?？梢詫⒃嚇硬贾?在多個(gè)井中的每一個(gè)內(nèi)的介質(zhì)中的試樣嵌套部位上?？梢允沟枚鄠€(gè)柱塞在孔內(nèi)運(yùn)動(dòng)，以便 推動(dòng)介質(zhì)在試樣周圍流動(dòng)和流過(guò)所述槽道，從而以介質(zhì)灌注試樣。在多個(gè)所述井中在所述 試樣周圍的介質(zhì)中的一種或多種溶質(zhì)的濃度可以進(jìn)行一次或多次測(cè)量。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0029] 圖Ia和Ib是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的多井板的單個(gè)井的示意剖視圖，其中柱塞處于 向下位置（Ia)和向上位置（Ib)，且插入件布置于其中。圖Ic以剖視圖表示了插入件的底 部。
[0030] 圖Id是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的插入件和插入件的底部部分的示意剖視圖，表示了 某些當(dāng)前優(yōu)選的尺寸。
[0031] 圖Ie和If是多井板的單個(gè)井的下部部分的兩個(gè)實(shí)施例的示意剖視圖，且插入件 布置于其中，表示了在井的底部的貯槽中的試樣嵌套部位（Ie)和布置在插入件底部的篩 網(wǎng)上的試樣嵌套部位（和嵌套支架）（If)。
[0032] 圖Ig是本發(fā)明的井的可選實(shí)施例的結(jié)構(gòu)的示意剖視圖，表示了用作止回閥的環(huán)， 以便阻止消耗的介質(zhì)在柱塞的向上運(yùn)動(dòng)過(guò)程中從介質(zhì)槽道回流至試樣部位。
[0033] 圖2是多井板的單個(gè)井的下部部分的示意剖視圖，且插入件布置于其中，試樣嵌 套在插入件上，表示了用于檢測(cè)存在于介質(zhì)中的生物分子的小珠（bead)，該介質(zhì)從布置于 貯槽中的組織試樣灌注。
[0034] 圖3是多井板的單個(gè)井的下部部分的示意剖視圖，且插入件布置于其中，試樣嵌 套在插入件上（"3D支架"），傳感器在貯槽中布置在井的底部。
[0035] 圖4a和4b分別是多井板和覆蓋盒的豎立和顛倒分解透視圖，該覆蓋盒用于與板 匹配，表示了根據(jù)本發(fā)明的板的多個(gè)特征。
[0036] 圖5是井板的井的示意剖視圖，該井板包括布置在其上的口，用于控制井中的氣 體含量，并將外來(lái)物質(zhì)氣動(dòng)控制添加至溶液中。
[0037] 圖6是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的測(cè)量系統(tǒng)和裝置的示意圖。
[0038] 圖7包括表示比較HCT116細(xì)胞的2D和3D培養(yǎng)的線粒體應(yīng)力測(cè)試結(jié)果的曲線圖 和顯微照片。
[0039] 圖8包括表示在根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的原型灌注板中測(cè)量的、對(duì)于單胰島的葡萄糖 響應(yīng)的曲線圖。
[0040] 圖9包括根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的井的示意剖視圖和俯視圖，細(xì)胞能夠在該井中聚 結(jié)。
[0041] 圖10包括表示支架盤的產(chǎn)生的曲線圖和顯微照片。
[0042] 圖11是表示肝臟微組織的測(cè)量呼吸能力的曲線圖，作為羰氰三氟甲氧苯腙 (FCCP)濃度的函數(shù)。

【具體實(shí)施方式】
[0043] 本發(fā)明的實(shí)施例能夠測(cè)量一個(gè)或多個(gè)三維細(xì)胞試樣（例如組織試樣、活檢試樣或 者保持細(xì)胞的細(xì)胞支架）的一個(gè)或多個(gè)特性，該三維細(xì)胞試樣布置在例如多井板的一個(gè)或 多個(gè)井中。實(shí)施本發(fā)明的多種特殊形狀的板以及使得更普通的板適用于實(shí)施本發(fā)明的結(jié)構(gòu) 的井插入件可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本說(shuō)明書(shū)來(lái)設(shè)計(jì)，并可以使用普通的模制技術(shù)由聚 合物材料來(lái)制造，例如由聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯或聚苯乙烯制造。
[0044] 圖Ia-Ig表示了單獨(dú)（圖Id)或布置在井110(例如多井板的單個(gè)井）中的可拆卸 插入件100。插入件可以確定介質(zhì)灌注槽道120,以方便介質(zhì)灌注130至三維細(xì)胞試樣上， 例如沉積在井中的組織140上。槽道可以包括形成于插入件自身的本體中的多個(gè)通道，或 者更優(yōu)選是，包括確定于井的內(nèi)表面和插入件的外表面之間的通道。灌注槽道可以包括止 回閥，該止回閥用于在柱塞的向上沖程中限制介質(zhì)從槽道回流至試樣。插入件還可以包括 試樣嵌套部位150,以便在插入件插入井中之前接收試樣。在一些實(shí)施例中，試樣嵌套部位 布置在井自身中，例如在獨(dú)立于插入件的凹入部分或貯槽中。插入件或者井本體自身確定 了孔150,該孔150與柱塞160相互配合。柱塞160、井110和孔150優(yōu)選是設(shè)置成或尺寸 設(shè)置成裝配在一起，以使得柱塞插入井中和往復(fù)運(yùn)動(dòng)能夠攪拌和混合介質(zhì)。柱塞和孔裝配 在一起，以便當(dāng)柱塞向下或向上運(yùn)動(dòng)時(shí)引起灌注，且介質(zhì)灌注試樣和經(jīng)過(guò)灌注槽道。在一些 實(shí)施例中，柱塞還可以設(shè)置成引入一個(gè)或多個(gè)傳感器180,用于監(jiān)測(cè)在布置于井中的介質(zhì)中 的一個(gè)或多個(gè)分析物的存在或濃度。來(lái)自傳感器180的信息可以通過(guò)布置在柱塞170中的 光纖探針182來(lái)傳送。在一些實(shí)施例中，復(fù)合傳送結(jié)構(gòu)185可以布置在井上面，從而能夠通 過(guò)例如傳送口引入生物活性物質(zhì)或者氣體的井中至三維試樣周圍的介質(zhì)中。
[0045] 下面更詳細(xì)地介紹本發(fā)明的實(shí)施例的這些元件。井110的底表面可以確定凹入部 分，該凹入部分在使用過(guò)程中用作貯槽。凹入部分可以用于定向和控制試樣在井中的位置， 且它的底表面用作試樣嵌套部位150。井可以是多井板的多個(gè)井中的一個(gè)，它可以設(shè)計(jì)成 標(biāo)準(zhǔn)"生物篩協(xié)會(huì)" SBS基底面（footprint)，具有6mm的井直徑，且在井底部處的凹入部分 具有例如0. 5_的深度和例如3_的直徑。凹入部分的尺寸可以根據(jù)要在井中進(jìn)行的分析 來(lái)選擇。例如，容積應(yīng)當(dāng)足以保持試樣。上面所述的示例尺寸適合保持大約300 μ m厚的試 樣。根據(jù)分析要求，也可以提供其它尺寸。
[0046] 可拆卸插入件100可以為大致圓柱形，且尺寸和結(jié)構(gòu)設(shè)置成滑動(dòng)到井中，且與井 內(nèi)壁稍微過(guò)盈配合。見(jiàn)圖Id。例如，插入件可以有大約0.2英寸的高度hi和大約0.247英 寸的外徑0D。插入件的高度可以選擇為使得由孔（柱塞在該孔中產(chǎn)生流體靜壓力）的長(zhǎng)度 確定的沖程距離（即灌注沖程190)可以增加或減小，以便控制灌注容積。插入件的外徑可 以選擇成使得插入件緊貼地裝配至井中。例如，凸起195可以布置在插入件的外側(cè)壁上，以 便幫助將插入件固定和定心在井中，從而使得在一些點(diǎn)處的外徑0D'為0. 251英寸。插入 件的頂邊緣可以較薄，例如有0. 002英寸的厚度tl，以便幫助將柱塞引導(dǎo)至插入件中。插 入件的內(nèi)表面可以有上部的錐形部分和下部的豎直部分，該豎直部分確定了具有例如0. 15 英寸直徑dl的孔。上部錐形部分可以確定具有例如0. 1英寸直徑d2的開(kāi)口。插入件的孔 的底部可以確定例如〇. 080英寸直徑d3的開(kāi)口。該開(kāi)口可以包括介質(zhì)可透過(guò)的平臺(tái)，例如 篩網(wǎng)，該平臺(tái)的尺寸和位置設(shè)置成支承支架，該支架保持三維細(xì)胞培養(yǎng)物或組織試樣。插入 件確定了多個(gè)灌注槽道120,該灌注槽道120開(kāi)始于插入件的底部，并沿插入件的外徑壁向 上延伸，以便形成槽道，從而在柱塞的向下沖程過(guò)程中，通過(guò)具有直徑d3的開(kāi)口泵送的流 體能夠排出，以便產(chǎn)生橫過(guò)試樣的灌注。各灌注槽道可以有例如〇. 004英寸的高度h2。
[0047] 一組當(dāng)前優(yōu)選的尺寸將確定在3mm孔內(nèi)的3mm的柱塞沖程，因此泵的排出體積 (稍微超過(guò)20mm 3或20 μ 1)是槽道容積的近似4倍。因此，如當(dāng)前所考慮，柱塞和插入件的 尺寸設(shè)置成使得柱塞在插入孔中時(shí)使得至少20 μ 1的介質(zhì)運(yùn)動(dòng)。在孔和柱塞之間的間隙越 小，泵的效率越好，因此，合理的范圍是最小間隙0. 001英寸和最大0. 01英寸。在一些實(shí)施 例中也考慮更大間隙，以便允許新鮮介質(zhì)在活塞的向上沖程中在該活塞周圍向下流動(dòng)，特 別是在包括止回閥功能的實(shí)施例中，如后面所述。
[0048] 參考圖le，插入件100緊貼裝配至井110中使得插入件能夠牢固保持就位，且在使 用中可以使得試樣140固定和定向在試樣嵌套部位150中，該試樣嵌套部位150布置在由 交接面（該交接面由在井底部的凹入部分和插入件的底部部分產(chǎn)生）形成的小的微腔室或 貯槽中。如圖所示，貯槽與灌注槽道120流體連通，即與介質(zhì)槽道流體連通，灌注流130通 過(guò)該灌注槽道120進(jìn)行。在一些實(shí)施例（未示出）中，介質(zhì)槽道可以導(dǎo)向用于收集耗盡的 介質(zhì)的排放部。因此，在一些實(shí)施例中，介質(zhì)可以通過(guò)介質(zhì)槽道而運(yùn)動(dòng)至廢物部位，而不是 返回至井中。
[0049] 如后面更詳細(xì)所述（包括參考圖If)，在其它實(shí)施例中，試樣嵌套部位150布置在 插入件100自身上。例如，插入件可以包括在孔160的底部處的篩網(wǎng)190,具有細(xì)胞的組織 試樣或支架200可以布置在該篩網(wǎng)上。在其它實(shí)施例（未示出）中，試樣嵌套部位可以布 置在柱塞上，例如剛性懸掛在它的底表面上，從而試樣嵌套部位與柱塞一起運(yùn)動(dòng)，以便使得 試樣暴露于介質(zhì)的不同區(qū)域。因此，可能但并不優(yōu)選的結(jié)構(gòu)包括將試樣嵌套部位懸掛在柱 塞上。
[0050] 可以由插入件確定的介質(zhì)槽道允許通過(guò)柱塞而移動(dòng)的介質(zhì)離開(kāi)試樣附近，例如通 過(guò)沿周邊壁向上流過(guò)由插入件的外表面和井的內(nèi)側(cè)壁確定的環(huán)帶。在一些實(shí)施例（未示 出）中，介質(zhì)槽道可以從插入件的底部部分延伸至插入件的較高部分。參考圖1C，在示例實(shí) 施例中，介質(zhì)槽道可以包括確定于插入件100的底部部分中的多個(gè)（例如四個(gè)）灌注槽道 120。灌注槽道可以是確定于插入件的底表面上的凹坑。也可選擇，灌注槽道可以是確定于 插入件的底部部分中的圓柱形開(kāi)口。各介質(zhì)槽道可以確定流動(dòng)通路，該流動(dòng)通路使得灌注 在試樣周圍的介質(zhì)返回至布置于井中的介質(zhì)，或者也可選擇，至廢物儲(chǔ)存器。介質(zhì)槽道與試 樣嵌套部位流體連通，從而允許介質(zhì)流過(guò)該試樣嵌套部位。介質(zhì)流由柱塞170推動(dòng)，從而在 柱塞運(yùn)動(dòng)時(shí)允許試樣暴露于新鮮介質(zhì)。
[0051] 參考圖If，插入件可以包括試樣嵌套部位150。例如，插入件可以包括介質(zhì)可透過(guò) 的平臺(tái)，例如篩網(wǎng)190,該平臺(tái)跨過(guò)在插入件的底表面中的開(kāi)口。篩網(wǎng)可以由任意數(shù)目的材 料來(lái)制造，例如聚合物如聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯（PET)或聚苯乙烯、纖維素、紙張等，并通 過(guò)超聲波焊接、熱融、粘接劑粘接或機(jī)械夾住而附接。在某些實(shí)施例中，試樣粘附在嵌套部 位可以通過(guò)使用附接促進(jìn)劑或組織粘接劑來(lái)加強(qiáng)，例如MatriGelTM或Cell-TakTM。在可選 實(shí)施例中，如上所述，試樣嵌套部位可以在井底部處的凹入部分內(nèi)。
[0052] 各介質(zhì)槽道可以包括流動(dòng)通路，該流動(dòng)通路確定了在井中的介質(zhì)表面下面的閉 環(huán)，從而當(dāng)柱塞在孔內(nèi)向上和向下運(yùn)動(dòng)時(shí)允許介質(zhì)在試樣周圍灌注流動(dòng)。
[0053] 插入件可以通過(guò)注射模制來(lái)制造。表面潤(rùn)濕性可以通過(guò)自身已知的處理來(lái)增加， 例如執(zhí)行插入件的等離子體預(yù)處理，以便通過(guò)產(chǎn)生更親水性的表面來(lái)消除氣泡在灌注槽道 中的夾帶。
[0054] 優(yōu)選是，孔布置在嵌套部位的上面，引導(dǎo)柱塞豎直向下進(jìn)入插入件中至布置于井 中的試樣介質(zhì)內(nèi)，并產(chǎn)生液體靜壓力和介質(zhì)在試樣周圍的運(yùn)動(dòng)。因此，柱塞可以用于在布 置于井中的孔（例如由插入件確定的孔）內(nèi)往復(fù)運(yùn)動(dòng)。圖Ia表示了伸入孔160內(nèi)的柱塞 170,其緊鄰試樣，而圖Ib表示了稍微退回的柱塞170。當(dāng)柱塞沿確定灌注沖程190的距離 上下運(yùn)動(dòng)時(shí)，通過(guò)液體靜壓力而迫使一定體積的介質(zhì)橫過(guò)組織或支架，并沿在插入件和井 的內(nèi)表面之間的周邊壁向上（或向下）。
[0055] 圖Ig表示了一種形式的止回閥210,該止回閥210用于在柱塞的向上沖程中防止 介質(zhì)從灌注槽道回流至試樣?？蛇x的止回閥210采取自由浮動(dòng)的環(huán)形環(huán)的形式，該環(huán)形環(huán) 包括例如彈性體聚合物，它套裝在培養(yǎng)介質(zhì)本體內(nèi)的槽道的環(huán)形開(kāi)口上。在向下沖程中，來(lái) 自槽道的液體靜壓力使得環(huán)移動(dòng)，并允許耗盡的介質(zhì)向上和徑向向內(nèi)流動(dòng)，以便往回混合 至井中的介質(zhì)體積中。在向上的柱塞沖程中，吸力將環(huán)保持成與槽道的開(kāi)口基本密封接合， 從而防止介質(zhì)從槽道回流。因此，介質(zhì)通過(guò)在柱塞和孔之間的環(huán)形間隙空間而環(huán)繞柱塞向 下吸入。其它的止回閥結(jié)構(gòu)也可考慮，且當(dāng)容許一些介質(zhì)回流時(shí)，止回閥功能也可以省略。 用于防止回流的止回閥的還一可選方式是省卻耗盡介質(zhì)的重新循環(huán)，并將灌注槽道設(shè)計(jì)成 用于單向排出至井板（未示出）本體中的儲(chǔ)存器中。
[0056] 在一些實(shí)施例中，試樣嵌套部位可以包括附接在插入件上或貯槽底部的支架200。 支架是三維多孔固體，例如膠原薄膜，它模擬在活體中的組織薄壁組織和它周圍的結(jié)構(gòu)。 這樣的支架在市場(chǎng)上可獲得，并可以由凝膠或纖維/多孔介質(zhì)來(lái)制造，例如Alvetex? Scaffold或3D BioTek支架材料。Alvetex? Scaffold是高孔隙度的交聯(lián)聚苯乙烯支架， 它的截面為200 μπι厚薄膜。形成的材料為惰性，且不會(huì)在正常使用過(guò)程中退化。它已經(jīng)用 于適合多種普通細(xì)胞培養(yǎng)塑料物品的規(guī)格。Alvetex? Scaffold提供了合適的3D結(jié)構(gòu)， 在該3D結(jié)構(gòu)中，細(xì)胞能夠在合適的小環(huán)境中增殖、移動(dòng)、區(qū)分和起作用。細(xì)胞保持與相鄰細(xì) 胞緊密地相互作用的3D形狀和形式。
[0057] 參考圖2,在可選實(shí)施例中，包括對(duì)于感興趣的生物分子的特殊膠合劑的小珠 220 可以布置在井110中并在試樣下面或附近，作為用于幫助試樣分析的裝置。特別是，支架 200或組織可以固定在插入件上，以使得介質(zhì)能夠通過(guò)和環(huán)繞它灌注。在該結(jié)構(gòu)中，介質(zhì)例 如包含關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)、信號(hào)分子、藥物等。小珠例如可由Luminex?獲得，其包含附接分子， 可以布置在井的底部，從而多種信號(hào)分子可以被捕獲，并隨后被檢測(cè)或定量。人們可以利用 與試樣緊密接觸的貯槽和小體積介質(zhì)，以便有效放大信號(hào)分子的濃度和將它們捕獲在小珠 上。小珠優(yōu)選是留在井的底部，因?yàn)樗鼈儾东@在支架和環(huán)繞周邊的小槽道之間。在化驗(yàn)結(jié) 束時(shí)，插入件或一組插入件可以除去，且小珠能夠使用已知技術(shù)來(lái)閱讀，例如在流動(dòng)血細(xì)胞 計(jì)數(shù)器中分析。
[0058] 除了上述可選的小珠之外，裝置優(yōu)選是還包括傳感器180,例如布置在柱塞上，用 于檢測(cè)在布置于試樣周圍的介質(zhì)中的溶質(zhì)濃度。傳感器可以測(cè)量在試樣周圍的介質(zhì)中溶解 的氧、二氧化碳、氫離子的濃度。隨時(shí)間間隔開(kāi)的測(cè)量值能夠評(píng)估試樣在它的微環(huán)境的各種 條件下的健康或代謝效率。
[0059] 參考圖3,傳感器180可以布置在井或貯槽的底部，以便檢測(cè)溶質(zhì)在介質(zhì)中的濃 度。例如，人們可以將O^pH傳感器布置在插入件100的底部和井110的底部之間的空 間中。具有傳感器的板在市場(chǎng)上可獲得，但缺陷是人們必須使得細(xì)胞在傳感器上生長(zhǎng)。具 有可水溶的傳感器的工具包（該工具包將置于介質(zhì)中）也可獲得，但是也有缺點(diǎn)。這里所 述實(shí)施例能夠使得微井板設(shè)有在底部的傳感器和在它上面的插入件，從而使得微井板在標(biāo) 準(zhǔn)板閱讀器中閱讀，例如BioTek Synergy線的板閱讀器。這些類型的傳感器結(jié)構(gòu)可以用于 支架或在隔膜上生長(zhǎng)的二維或三維培養(yǎng)物。
[0060] 根據(jù)要進(jìn)行的分析和它的選擇結(jié)構(gòu)，多種類型的傳感器可以用于該裝置，包括氧 傳感器（例如氧熄滅熒光傳感器）、pH傳感器（包括熒光傳感器、ISFET和阻抗傳感器）、 CO2傳感器（包括連接重碳酸鹽緩沖劑和銨染料的熒光傳感器以及其它CO 2傳感器）、多種 離子和小分子傳感器、大分子傳感器（包括表面等離子體共振傳感器和利用Wood異常原理 的傳感器）、聲音傳感器以及微波傳感器。在某些實(shí)施例中，可以使用普通的板閱讀器。
[0061] 優(yōu)選的傳感器是熒光團(tuán)。很多熒光感測(cè)化合物和制劑在本領(lǐng)域中介紹，很多可由 市場(chǎng)獲得，例如來(lái)自Molecular Probes Inc和Frontier Scientific Inc。當(dāng)前優(yōu)選的氧 傳感器是信號(hào)與氧濃度成反比的熒光團(tuán)，例如卟啉或若丹明化合物，穩(wěn)定為顆?；蚓鶆蚍?布在氧可透過(guò)的聚合物中，例如硅酮橡膠。當(dāng)前優(yōu)選的化合物是卟啉。當(dāng)前優(yōu)選的pH傳感 器是熒光指示器染料、熒光素（它的信號(hào)在染料質(zhì)子化時(shí)減小，且它捕獲在懸浮于載體聚 合物中的顆粒內(nèi)，或者共價(jià)附接在親水性聚合物上。有利的熒光CO 2指示器傳感器通?；?于PH敏感換能器，其中熒光通過(guò)產(chǎn)生碳酸（由于二氧化碳與水反應(yīng)）而間接調(diào)節(jié)。例如見(jiàn) 0. S. Wolfbeis，Anal. Chem. 2002, 74, 2663-2678。檢測(cè)葡萄糖的熒光團(tuán)也能夠使用，例如基 于使用與葡萄糖復(fù)合的硼探針的無(wú)酶轉(zhuǎn)換的熒光團(tuán)，從而導(dǎo)致電荷傳遞，這調(diào)節(jié)探針的熒 光，或者使用酶葡萄糖換能器，它使得葡萄糖氧化酶與熒光氧傳感器連接，具有葡萄糖粘接 和氧化，導(dǎo)致氧傳感器的定量調(diào)節(jié)。在本發(fā)明實(shí)施例的范圍內(nèi)還使用對(duì)于生物分子敏感的 熒光團(tuán)或其它類型傳感器，例如乳酸、氨或尿素。乳酸傳感器能夠基于酶?jìng)鞲衅鹘Y(jié)構(gòu)，具有 與熒光氧傳感器相連的乳酸氧化酶，且乳酸的粘接和氧化導(dǎo)致氧傳感器的定量調(diào)節(jié)。氨或 銨離子傳感器能夠設(shè)置成將質(zhì)子化PH指示器固定在憎水性和氣體可透過(guò)的聚合物中，其 中熒光輸出通過(guò)與瞬變氨反應(yīng)而定量調(diào)節(jié)。尿素傳感器能夠基于酶?jìng)鞲衅鹘Y(jié)構(gòu)，具有與熒 光氨換能器相連的尿素酶，且通過(guò)尿素與氨的粘接和反應(yīng)，從而導(dǎo)致氨傳感器熒光的調(diào)節(jié)。 傳感器的性質(zhì)通常并不形成本發(fā)明實(shí)施例的方面。
[0062] 在使用中，插入件引導(dǎo)柱塞，以便通過(guò)在插入件中和/或在井底部處的凹入部分 中在組織試樣上面的介質(zhì)柱內(nèi)產(chǎn)生液體靜壓力而提供灌注。當(dāng)柱塞豎直地往復(fù)運(yùn)動(dòng)通過(guò)該 柱時(shí)，迫使介質(zhì)橫過(guò)和（有時(shí)）穿過(guò)組織流動(dòng)，并通過(guò)環(huán)繞插入件周邊的一系列槽道以及在 插入件的外表面和井的內(nèi)壁之間向上離開(kāi)腔室。通過(guò)使得柱塞向上和向下運(yùn)動(dòng)，介質(zhì)橫過(guò) 組織運(yùn)動(dòng)，從而補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物、提供氧和沖走廢物。因此，在試樣周圍的微環(huán)境在測(cè)量過(guò)程之 間連續(xù)灌注。當(dāng)柱塞運(yùn)動(dòng)至底部位置時(shí)（擱置在插入件上或恰好在插入件上面），它的運(yùn)動(dòng) 停止，產(chǎn)生較小的瞬時(shí)容積，并進(jìn)行測(cè)量。灌注通過(guò)插入件的效率可以通過(guò)改變沖程高度、 速度以及在柱塞和插入件之間的間隙而提高。
[0063] 參考圖4a和4b，圖中表示了適用于接收上述插入件和實(shí)現(xiàn)本發(fā)明實(shí)施例的井板 結(jié)構(gòu)。它包括井板400,該井板400確定了多個(gè)井110。井板可以與盒410和可拆卸蓋420 組合。在所示實(shí)施例中，多井板400有24個(gè)井。在板中的井110的數(shù)目可以從1至幾百而 變化。在一些實(shí)施例中，可以制造幾乎任意尺寸的單個(gè)井，或者可以制造多個(gè)井，或者多個(gè) 井可以一維或二維布置而制造。在多個(gè)實(shí)施例中，人們可以利用與例如由生物分子篩網(wǎng)協(xié) 會(huì)的、用于微板的標(biāo)準(zhǔn)（"SBS-1基底面"和"SBS-4井位置"，提出的兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)更新至2003 年5月20日）所述的微板的圖形和尺寸相對(duì)應(yīng)的、二維圖形的井。板可以包括12、24、96、 384、1536或者任意其它數(shù)目的各個(gè)井。更大數(shù)目的井有工程難題，因?yàn)閷?shí)現(xiàn)本發(fā)明實(shí)施例 需要的細(xì)小結(jié)構(gòu)。盒410為大致平的元件，包括由例如模制塑料制造的框架430。平的表面 440確定了與在多井板400中確定的多個(gè)井110的多個(gè)相應(yīng)開(kāi)口相對(duì)應(yīng)（即對(duì)齊）的多個(gè) 區(qū)域450。在所示實(shí)施例中，在各區(qū)域450中，平的元件確定了 ：第一、第二、第三和第四口 460,它們用作儲(chǔ)存器，用于傳送氣體或試劑；以及中心孔470,用于柱塞170。各口用于根據(jù) 要求而保持和將測(cè)試流體釋放至它下面的相應(yīng)井110中。口 460的尺寸和位置設(shè)置成使得 多組的四個(gè)口可以定位在井110上面，氣體或測(cè)試流體可以從四個(gè)口中的任意一個(gè)傳送給 相應(yīng)井110。在一些實(shí)施例中，在各區(qū)域中的口的數(shù)目可以小于4或大于4。口 460和柱塞 170可以相對(duì)于微板400順應(yīng)地安裝，以便使它能夠通過(guò)適應(yīng)側(cè)向運(yùn)動(dòng)而嵌套在微板內(nèi)。微 板包括順應(yīng)區(qū)域的結(jié)構(gòu)使得它的制造能夠有較松的公差，并使得盒能夠用于稍微不同尺寸 的微板。順應(yīng)性例如能夠通過(guò)使用彈性體聚合物來(lái)形成平的元件440、以便允許在框架430 以及各區(qū)域中的柱塞和口之間相對(duì)運(yùn)動(dòng)而實(shí)現(xiàn)。
[0064] 各口 460可以有圓柱形、圓錐形或立方體形狀，在頂部穿過(guò)平的元件430開(kāi)口，在 底部除了小孔之外關(guān)閉，即毛細(xì)孔，通常定心在底表面中。毛細(xì)孔用于例如通過(guò)表面張力而 將測(cè)試流體保持在口中，而沒(méi)有外部力，例如正壓差力、負(fù)壓差力或可能的離心力。各口可 以由氣體、測(cè)試化合物不可透過(guò)的聚合物材料來(lái)制造，或者由任意其它固體材料來(lái)制造。當(dāng) 設(shè)置成用于多井微板400時(shí)，由各口容納的液體體積可以在從500 μ 1至（只有）2 μ 1的范 圍內(nèi)，盡管在該范圍外的體積也可考慮。
[0065] 參考圖4b，在盒110的各區(qū)域中，可浸入柱塞170(即傳感器套筒或屏障）布置在 口之間并與一個(gè)或多個(gè)口 460相連，用于布置在相應(yīng)井110中。柱塞170可以有布置在其 下表面上的一個(gè)或多個(gè)傳感器180,用于插入在井110中的介質(zhì)內(nèi)。傳感器能夠用于檢測(cè)在 試樣嵌套部位周圍的介質(zhì)中的溶解介質(zhì)組分的濃度。用于該目的的傳感器的一個(gè)示例是熒 光指示器，例如氧熄滅熒光團(tuán)，嵌入氧可透過(guò)的物質(zhì)中，例如硅橡膠。熒光團(tuán)根據(jù)在井110 中的成分存在和/或濃度而有熒光特性。也可以使用其它類型的已知傳感器，如上所述，例 如電化學(xué)傳感器、Clark電極等。柱塞170可以限定用于接收傳感器的孔和內(nèi)部容積。
[0066] 盒410可以附接在柱塞上，或者可以布置在柱塞附近而并不附接，以便允許獨(dú)立 運(yùn)動(dòng)。盒410可以包括一組化合物儲(chǔ)存和傳送口，這些化合物儲(chǔ)存和傳送口裝配成單個(gè)單 元，并與類似組的柱塞相連。
[0067] 裝置還可以具有的特征為有用于盒110或用于多井板400的可拆卸蓋420。作為 用于多井板400的蓋的盒110的結(jié)構(gòu)可以幫助防止布置在井110中的試樣或介質(zhì)蒸發(fā)或被 污染。蓋420也可以設(shè)置成套裝在盒110上，從而減少可能的污染，并保持井中的氣體含量， 或者減少布置在盒410的口 460中的流體的蒸發(fā)。
[0068] 圖5表示了本發(fā)明實(shí)施例的井110的示意剖視圖，表示了結(jié)構(gòu)185用于將藥物或 氣體添加至井中，以便改變進(jìn)行檢驗(yàn)的試樣的微環(huán)境。現(xiàn)有的傳送系統(tǒng)（市場(chǎng)上可獲得的 Seahorse XF Analyzer)的細(xì)節(jié)在US20080014571中介紹，該文獻(xiàn)的內(nèi)容結(jié)合到本申請(qǐng)中， 作為參考。藥物傳送歧管510可以變化成傳送環(huán)境氣體，例如外部氣體520,即來(lái)自氣缸，或 者內(nèi)部空氣530,至直接在各井上面的頂部空間。內(nèi)部空氣可以是例如來(lái)自儀器內(nèi)部的環(huán)境 空氣，該空氣通過(guò)較小的內(nèi)部壓縮機(jī)來(lái)壓縮，以便增壓藥物口，從而傳送藥物化合物?？諝?向頂部空間的傳送可以允許控制在測(cè)試試樣周圍的環(huán)境，以便產(chǎn)生模擬缺氧（〈5 % O2)或者 氧正常和/或低pH的條件。在一些實(shí)施例中，氧、二氧化碳和/或生物惰性氣體的源可以 注入井中的介質(zhì)中或井中的介質(zhì)表面上面的頂部空間中，用于控制在頂部空間中或在介質(zhì) 中的氣體組分。氣體可以從口 460注入介質(zhì)或頂部空間中。
[0069] 特別是，用于實(shí)現(xiàn)它的一種方式是通過(guò)參考圖2a和2b所述的結(jié)構(gòu)，其中，盒410 包含一組4個(gè)口 460,這4個(gè)口 460可以用于將多種化合物傳送給井板中的試樣。例如，在 XF儀器上進(jìn)行的普通測(cè)試是線粒體應(yīng)力測(cè)試。在這種試驗(yàn)中，一系列的注入通過(guò)盒的藥物 口來(lái)傳送，以便測(cè)量生物試樣對(duì)各種化合物（寡霉素、FCCP、魚(yú)藤酮和抗霉素）的響應(yīng)。這 些化合物在執(zhí)行試驗(yàn)之前預(yù)裝載至XF盒上的藥物儲(chǔ)存器（口）中。當(dāng)盒插入儀器內(nèi)時(shí)，它 與歧管連接，當(dāng)由電磁閥驅(qū)動(dòng)時(shí)，該歧管向儲(chǔ)存器的頂部空間提供氣動(dòng)壓力，從而迫使化合 物通過(guò)小孔進(jìn)入容納生物試樣的井中。氣動(dòng)歧管和閥系統(tǒng)可以變化，以便將這些口中的一 個(gè)重新導(dǎo)向外部氣體供應(yīng)部（氣缸或瓶）。氣體供應(yīng)部可以通過(guò)在后部連接器面板上的口 而與儀器連接。瓶可以布置在儀器附近，并可以包含調(diào)節(jié)器和起泡器，用于使得進(jìn)入的氣體 濕潤(rùn)。當(dāng)驅(qū)動(dòng)時(shí)，電磁閥可以打開(kāi)，從而使得氣體能夠流過(guò)歧管/盒交接面，通過(guò)藥物口孔， 并進(jìn)入生物試樣上面的頂部空間中。通過(guò)使得柱塞（探針）豎直振蕩，氣體將與介質(zhì)混合， 從而能夠使得試樣可控制地獲得氧。例如，通過(guò)將氬氣灌注至頂部空間中，在介質(zhì)中可獲得 的〇 2將被排出，在試樣周圍產(chǎn)生更缺氧的條件。通過(guò)關(guān)閉氣體和混合，可以重新建立環(huán)境 水平的O2。
[0070] 在一些實(shí)施例中，生物活性物質(zhì)的溶液源可以與井中的介質(zhì)流體連通，用于使得 試樣暴露于該物質(zhì)。
[0071] 為了控制電磁閥的操作和正時(shí)，儀器軟件可以變化，以方便控制閥/正時(shí)，并暴露 一些在標(biāo)定過(guò)程中使用的計(jì)算變量。例如，為了計(jì)算在介質(zhì)中的O2的摩爾濃度，在標(biāo)定時(shí) 的濃度優(yōu)選是已知，并輸入計(jì)算表中。在一些條件下，初始標(biāo)定值（F或當(dāng)前環(huán)境濃度）可 能并不知道。在這種情況下，標(biāo)定和方程（1)(見(jiàn)下面的示例2)的解可以通過(guò)將亞硫酸鈉 注入一組控制井中以及根據(jù)已知的值標(biāo)定該系統(tǒng)而獲得。為了計(jì)算這些結(jié)果，在軟件中 可存取某些系數(shù)。單獨(dú)的窗口可以在軟件中產(chǎn)生，以方便存取這些變量、值控制和標(biāo)定系數(shù) 的計(jì)算。
[0072] 儀器可以使用井來(lái)測(cè)試，該井的特征在于細(xì)胞線（鼠標(biāo)C2C12)，以便驗(yàn)證氣體系 統(tǒng)的合適操作和控制。可以進(jìn)行一系列的測(cè)試，以便證明從介質(zhì)中清除〇2和在試樣周圍產(chǎn) 生缺氧微環(huán)境的能力。這些測(cè)試可以包括：
[0073] 1.在已知和未知的環(huán)境O2濃度下標(biāo)定儀器；
[0074] 2.驗(yàn)證氣體傳送系統(tǒng)的性能和將環(huán)境O2水平驅(qū)動(dòng)至所需值（〈5% ΡΡ0)的能力。 這可以在儀器中通過(guò)查看〇2水平數(shù)據(jù)來(lái)驗(yàn)證。儀器的讀數(shù)可以提供呈現(xiàn)該數(shù)據(jù)的視圖。
[0075] 用于控制在試樣環(huán)境中的02和pH的可選方式可以是將整個(gè)儀器封裝在環(huán)境腔室 中，并將腔室抽氣至所需水平。這種可選方法可能并不是希望的，因?yàn)樗赡芊浅０嘿F，占 據(jù)大量的實(shí)驗(yàn)室空間，并需要較長(zhǎng)時(shí)間來(lái)獲得組織周圍的所需水平。在達(dá)到這些〇 2水平時(shí)， 組織可能死去。
[0076] 圖6表示了結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例使用的分析器的示意圖。它包括裝置600,該裝置 600包括布置在殼體615 (以虛線表示）中的化合物儲(chǔ)存和傳送裝置610,它還包括盒410， 該盒410確定了用于接收傳感器結(jié)構(gòu)的多個(gè)孔和柔順安裝的多個(gè)流體口（在圖4a和4b中 詳細(xì)表示），還包括臺(tái)架或基部130,用于接收多井板400,例如細(xì)胞培養(yǎng)板。盒410布置在 多井板400上面，并用于與多井板400配合。盒410選擇地由用于接收該盒410的盒保持 器630來(lái)保持。裝置還包括安裝塊640,該安裝塊640能夠往復(fù)運(yùn)動(dòng)，如由雙頭箭頭所示，優(yōu) 選是由馬達(dá)（未示出）提供動(dòng)力，包括升降機(jī)機(jī)構(gòu)650。升降機(jī)機(jī)構(gòu)650可以用于使得盒 410相對(duì)于臺(tái)架620或井板400運(yùn)動(dòng)。安裝塊包括氣體多路復(fù)用器660,該氣體多路復(fù)用器 660附接在氣體供應(yīng)部或氣體儲(chǔ)存器670上。氣體供應(yīng)部670與盒流體連通，并用于將測(cè) 試流體的傳送從盒中的口推向多井板400中的井，或者使得氣體組分固定在一個(gè)或多個(gè)井 中。具有傳感器的多個(gè)探針或柱塞170用于插入盒410中的多個(gè)孔內(nèi)，并可以用于收集表 示布置在多井板400的井中的細(xì)胞的狀態(tài)的數(shù)據(jù)。
[0077] 化合物儲(chǔ)存和傳送裝置610由控制器680來(lái)控制，該控制器680可以與計(jì)算機(jī)690 成一體，并可以控制升降機(jī)機(jī)構(gòu)、多路復(fù)用器和壓力源。因此，當(dāng)相連傳感器布置在井中時(shí)， 控制器680可以允許測(cè)試流體從口傳送給相應(yīng)的井。
[0078] 這里所述的裝置是在上面參考的US20080014571中公開(kāi)的裝置的變化形式，并能 夠進(jìn)行三維細(xì)胞培養(yǎng)試樣的試驗(yàn)和分析，例如組織試樣、活檢試樣或保持細(xì)胞的細(xì)胞支架。 可以保持試樣的存活力，該存活力可控制它的微環(huán)境。在某些實(shí)施例中，氣體可以添加給介 質(zhì)，或者添加給在井中在介質(zhì)上面的頂部空間，以便通過(guò)改變?nèi)芙獾臍怏w組分來(lái)改變?cè)嚇?周圍的微環(huán)境。在某些其它實(shí)施例中，生物活性物質(zhì)的溶液可以添加給介質(zhì)，以便通過(guò)使得 試樣暴露于生物活性物質(zhì)而改變?cè)嚇又車奈h(huán)境。計(jì)量量的一種或多種氣體和/或一種 或多種藥物或其它溶質(zhì)可以添加給井中的介質(zhì)，以便將試樣周圍的介質(zhì)中的微環(huán)境設(shè)置成 預(yù)定點(diǎn)。在井中的微環(huán)境可以設(shè)置成缺氧條件。在試樣周圍的介質(zhì)中的一種或多種溶質(zhì)的 濃度可以進(jìn)行測(cè)量。可以進(jìn)行在試樣周圍的介質(zhì)中的一種或多種溶質(zhì)的濃度的多次測(cè)量 (在時(shí)間上分開(kāi)）。
[0079] 在某些其它實(shí)施例中，方法包括將氧清除劑（例如亞硫酸鈉）添加給介質(zhì)。
[0080] 人的活檢組織試樣可以布置在嵌套位置上，可能的治療藥物可以添加給介質(zhì)，可 以化驗(yàn)藥物對(duì)試樣的效果。
[0081] 示例
[0082] 下面的示例說(shuō)明了本發(fā)明的特定示例、優(yōu)選實(shí)施例和用途，但是并不將說(shuō)明所有 實(shí)施例和用途。
[0083] 示例1 :設(shè)計(jì)成用于組織灌注和固定的定制注射模制井板和灌注插入件的發(fā)展
[0084] Seahorse XF96流量分析器發(fā)展和優(yōu)化以測(cè)量在基于細(xì)胞的化驗(yàn)中的生物能活 性。XF測(cè)量基于專利方法，其中，在單層細(xì)胞周圍產(chǎn)生較小的暫時(shí)測(cè)量容積，該層細(xì)胞粘 附在井板的底部。當(dāng)柱塞（探針）降低至井的底部（3. 8mm直徑）并與一組架（standoff) (0. 20mm高）接合時(shí)產(chǎn)生較小容積，以便產(chǎn)生大約2. 25微升的容積。井板的該設(shè)計(jì)并沒(méi) 有優(yōu)化成用于組織試樣，因?yàn)椋?)試樣需要固定和定向，以便防止它們?cè)跍y(cè)量過(guò)程中移動(dòng)； (2)三維試樣沒(méi)有一致和均勻的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供給（灌注）；以及（3)需要較大測(cè)量腔室，該測(cè) 量腔室將容納直到200微米厚的試樣。為了使得井的幾何形狀適用于組織試樣，這里公開(kāi) 了一次性的96井板和柱塞（探針）系統(tǒng)，以便在Seahorse XF96儀器內(nèi)工作，該Seahorse XF96儀器固定、調(diào)整方向和提供組織試樣的灌注。
[0085] 上面介紹的定制井板和灌注插入件適合用于組織試樣。如上所述，井板可以設(shè)計(jì) 成標(biāo)準(zhǔn)"生物篩網(wǎng)協(xié)會(huì)" SBS基底面，具有6mm井直徑，有在井的底部處的凹入部分（0. 5mm 深、3mm直徑），用于定向和控制試樣在井的底部處的凹入部分中的定位。灌注插入件設(shè)計(jì) 成滑入井中，且與壁稍微干涉，因此插入件在試樣上面保持就位，并將試樣固定在井底部處 的凹入部分中。
[0086] 示例2 :確定pH和氧傳感器標(biāo)定系數(shù)
[0087] 井板、插入件和柱塞（探針）可以裝配和安裝在專用散熱器中，該專用散熱器提供 了試樣的對(duì)齊和熱控制?？梢园l(fā)展用于傳感器的合適位置偏移和標(biāo)定協(xié)議。標(biāo)定協(xié)議包括 確定合適容積、擴(kuò)散常數(shù)和傳感器放大率，它們對(duì)于該板、插入件和探針的幾何形狀是唯一 的。這些常數(shù)可以使用滴定法測(cè)量成已知濃度的標(biāo)定試劑來(lái)計(jì)算，以便發(fā)展一組系數(shù)，該組 系數(shù)介紹了作為分析物濃度（〇 2或11+)的函數(shù)的信號(hào)輸出。例如，當(dāng)標(biāo)定pH傳感器時(shí)，通過(guò) 確定用于各探針的激勵(lì)強(qiáng)度（該激勵(lì)強(qiáng)度在PH7. 4下提供所需的開(kāi)始信號(hào)），光學(xué)信號(hào)（基 于16位讀數(shù)）標(biāo)準(zhǔn)化為開(kāi)始H+濃度（pH7. 4)。在不同H+濃度下的信號(hào)進(jìn)行記錄，以便發(fā) 展標(biāo)準(zhǔn)曲線。用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的系數(shù)再裝入儀器中，從而各傳感器在要測(cè)量的一定濃度范圍 內(nèi)進(jìn)行標(biāo)定。用于氧傳感器的類似標(biāo)定可以這樣進(jìn)行，即通過(guò)使得在環(huán)境O 2濃度（PPO = 155mmHg)下的輸出標(biāo)準(zhǔn)化，并通過(guò)注射亞硫酸鈉（或氧清除劑）以產(chǎn)生為零的標(biāo)定點(diǎn)（ΡΡ0 = OmmHg)來(lái)確定第二標(biāo)定點(diǎn)。Stern Volmer媳滅常數(shù)可以根據(jù)下面的等式1來(lái)計(jì)算，該關(guān) 系用于在試驗(yàn)過(guò)程中在各時(shí)間點(diǎn)計(jì)算O2水平。
[0088] K = l/02(F〇/F-l) (等式 1)
[0089] 其中：
[0090] K = Stern Volmer 常數(shù)
[0091] Ftl =在零O2下的信號(hào)輸出
[0092] F=在環(huán)境下的信號(hào)輸出
[0093] O2 =在環(huán)境下的0 2濃度
[0094] 示例3 :最佳插入件幾何形狀的確認(rèn)和選擇
[0095] -旦建立標(biāo)定系數(shù)和上傳至儀器，就可以進(jìn)行一系列測(cè)試，以便確定用于灌注插 入件的最佳幾何形狀。這些測(cè)試可以涉及對(duì)標(biāo)準(zhǔn)的、良好特征細(xì)胞線（例如C2C12成纖維 細(xì)胞）進(jìn)行重復(fù)0CR/ECAR測(cè)量。在各測(cè)量之后，柱塞（探針）可以振蕩，以便灌注測(cè)量腔 室和優(yōu)化正時(shí)、Z行程和速度，從而獲得最佳灌注。最佳灌注可以根據(jù)系統(tǒng)使得測(cè)量腔室恢 復(fù)至O 2和pH的開(kāi)始濃度的能力來(lái)確定。
[0096] 示例4-6 :使用本發(fā)明實(shí)施例的試驗(yàn)研宄
[0097] 制造原型裝置，以便評(píng)價(jià)本發(fā)明實(shí)施例的各種幾何特征和用途，如下面在示例4-6 中所述。裝置包括多個(gè)圓柱形容器，該圓柱形容器裝配有聚碳酸酯灌注插入件。插入件裝配 在容器的底部，以便在容器內(nèi)形成一對(duì)腔室，該對(duì)腔室通過(guò)I. 5_的口連接。上部腔室包括 介質(zhì)儲(chǔ)存器，該介質(zhì)儲(chǔ)存器的容積為下部腔室容積的大約30倍。插入件的內(nèi)徑與Seahorse 傳感器盒接合，以便形成活塞狀泵，該泵有大約5mm的沖程長(zhǎng)度和3mm的直徑。當(dāng)穿過(guò)插入 件的內(nèi)徑運(yùn)動(dòng)時(shí)，Seahorse傳感器盒的柱塞迫使介質(zhì)從腔室的上部部分穿過(guò)口進(jìn)入下部腔 室，它通過(guò)在容器的內(nèi)徑和插入件的外徑之間的一系列周邊通氣孔而從該下部腔室離開(kāi)。 對(duì)于盒的各沖程，一定體積的流體灌注通過(guò)下部腔室，從而流體周轉(zhuǎn)最少2倍的靜止體積。 在下部腔室的底部布置了在容器中的凹入部分（lmmXO. 25mm)，其中，在使用過(guò)程中，球形 微組織定位成用于測(cè)量。在測(cè)量過(guò)程中，盒擱置在表面上，傳感器在該表面上定位在口（該 口使得頂部腔室與底部腔室隔開(kāi)）的中心。因此，傳感器定位在微組織上面，使得下部腔室 與上部腔室密封。在這樣減小的流體體積內(nèi)，測(cè)量值由傳感器采集，以便記錄在多個(gè)時(shí)間間 隔中的氧和pH濃度。由這些數(shù)據(jù)確定氧和pH流量（dO/dT)、（dpH/dT)。該方法用于評(píng)價(jià) 插入件的幾何特征，以便優(yōu)化流體周轉(zhuǎn)，同時(shí)保持組織位置和方便組織代謝特征的測(cè)量。
[0098] 示例 4
[0099] 已經(jīng)證明了使用原型插入件和板來(lái)測(cè)量單個(gè)3D球體的可行性。例如，參考圖7,在 2D單層培養(yǎng)物中生長(zhǎng)的結(jié)腸癌細(xì)胞（HTC116)與使用Seahorse生物科學(xué)線粒體應(yīng)力測(cè)試 (MST)在3D球體（使用懸掛下降方法）中形成的細(xì)胞比較。在右側(cè)的球體圖像表示了位于 井的底部的l_X〇. 25_釋放部分中的單個(gè)微組織（尺寸大約200微米）。信號(hào)揭示了在 兩種培養(yǎng)類型（最大呼吸、基礎(chǔ)）之間的備用呼吸能力上的明顯差異。可能的理論解釋是， 在2D中生長(zhǎng)的細(xì)胞具有較高增殖，因此使用更高百分率的基礎(chǔ)OCR來(lái)支承生長(zhǎng)，而在3D (η =3)中的細(xì)胞具有兩倍更高的備用能力。在該示例中，3D培養(yǎng)物在對(duì)于藥物暴露（寡霉素 注入）的動(dòng)態(tài)響應(yīng)中也明顯不同，如由3D培養(yǎng)球體中的更緩慢響應(yīng)所證明。
[0100] 示例 5
[0101] 已經(jīng)證明了使用原型腔室來(lái)灌注、保持和測(cè)量單個(gè)島的代謝輪廓的能力。例如，參 考圖8,單個(gè)胰島（近似100微米直徑）插入板（每個(gè)井1個(gè)）中，并受到15mM葡萄糖的 系列注射，從而引入FCCP和抗霉素 A。這些信號(hào)揭示了測(cè)量響應(yīng)15mM葡萄糖注射的呼吸 的離散變化的能力。而且，通過(guò)測(cè)量單個(gè)島（每個(gè)井1個(gè)），人們能夠直接比較和詢問(wèn)在島 群體之間的代謝信號(hào)中的不同，以便確定功能。例如，在圖表中在上部左側(cè)的島響應(yīng)葡萄 糖，而在上部右側(cè)的島并不響應(yīng)。這些測(cè)量方便根據(jù)響應(yīng)葡萄糖的氧消耗的倍數(shù)增加而分 成（binning)組，從而使得島能夠分級(jí)，用于在移植之前進(jìn)行質(zhì)量控制。在將來(lái)的工作中， 該數(shù)據(jù)可以與共同布置在灌注通路中的一組胰高血糖素和胰島素的生物標(biāo)志物相關(guān)聯(lián)，從 而使用原地ELISA化驗(yàn)來(lái)使得氧消耗與胰島素和胰高血糖素分泌相關(guān)聯(lián)。
[0102] 示例 6
[0103] 已經(jīng)產(chǎn)生了尺寸范圍為從50-600微米的3D微組織。例如，使用懸掛下降 方法，細(xì)胞與40 μ 1介質(zhì)一起種入市場(chǎng)上可獲得的接種蓋中，該接種蓋由Insphero Bioscience (Zurich，Switzerland)提供。參考圖9,細(xì)胞與介質(zhì)能夠結(jié)合在液滴的底部，而 在4天后，它們形成一體的球形，包含細(xì)胞和自己產(chǎn)生的額外細(xì)胞基體（ECM，即當(dāng)它們形成 組織時(shí)包圍/覆蓋細(xì)胞的材料，通常包括蛋白質(zhì)基體，它確定了細(xì)胞周圍的微環(huán)境）。一旦 形成球形，它們與另外100 μ 1的介質(zhì)一起置于儲(chǔ)存板中，它們將保持在該儲(chǔ)存板中直到準(zhǔn) 備使用。利用這種方法，3D球體由H印G2(人的肝癌）和HCT116(人的結(jié)腸直腸癌）產(chǎn)生。 這些細(xì)胞線表示為形成均勻尺寸的球體，作為單培養(yǎng)物和共同培養(yǎng)物。另外，參考圖10,包 含MCF-7(乳腺導(dǎo)管癌）的支架盤已經(jīng)成功產(chǎn)生。這些支架使用2_直徑的纖維素濾紙（沃 特曼114)來(lái)產(chǎn)生，布置在Seahorse灌注微腔室的底部，并使用Seahorse MST協(xié)議來(lái)測(cè)量 生物能函數(shù)。這證明組裝、保持和測(cè)量自組裝球體和支架微盤的生物能函數(shù)是可行的。
[0104] 參考圖11，球體可以用于執(zhí)行用于線粒體毒性的測(cè)試。在該示例中，肝細(xì)胞與無(wú)實(shí) 質(zhì)（Kupffer細(xì)胞等）細(xì)胞共同培養(yǎng)，以便形成具有功能免疫響應(yīng)的肝微組織。系統(tǒng)用于通 過(guò)引入FCCP并測(cè)量呼吸能力（FCCP刺激相對(duì)于基礎(chǔ)OCR)來(lái)遮掩毒性組織。這種測(cè)試證明 化驗(yàn)可以優(yōu)化成用于通過(guò)首先找到FCCP的最佳濃度來(lái)測(cè)量線粒體功能，該FCCP的最佳濃 度給出了在刺激和未刺激OCR之間的最大不同。
[0105] 在不脫離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，本發(fā)明可以以其它特殊形式來(lái)實(shí) 施。因此，前述實(shí)施例將被認(rèn)為在所有方面示例說(shuō)明了這里所述的本發(fā)明。不同實(shí)施例的 多個(gè)特征和元件能夠以不同組合和排列來(lái)使用，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。因此，本發(fā)明的范 圍由附加權(quán)利要求來(lái)表示，而不是前述說(shuō)明，因此，在權(quán)利要求的等效意思和范圍內(nèi)的所有 變化都將包含在本發(fā)明中。
【權(quán)利要求】
1. 一種用于進(jìn)行=維細(xì)胞試樣的分析的裝置，所述裝置包括： 多個(gè)井，用于保持相應(yīng)試樣和試樣介質(zhì)，所述多個(gè)井中的至少一個(gè)井包括： 布置于井中的試樣嵌套部位； 布置在試樣嵌套部位上面的孔，所述孔的尺寸設(shè)置成與柱塞相互配合，所述柱塞在孔 內(nèi)相對(duì)于所述孔和在布置于所述井中的試樣介質(zhì)內(nèi)豎直向下運(yùn)動(dòng)；W及 介質(zhì)槽道，所述介質(zhì)槽道與所述試樣嵌套部位流體連通，所述介質(zhì)槽道允許介質(zhì)由柱 塞推動(dòng)而流動(dòng)通過(guò)，并允許所述試樣在柱塞運(yùn)動(dòng)時(shí)暴露于新鮮介質(zhì)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其中準(zhǔn)塞相對(duì)于試樣嵌套部位運(yùn)動(dòng)，W便引起試樣介 質(zhì)在試樣周圍的灌注。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其中：柱塞和試樣嵌套部位一起運(yùn)動(dòng)，W便使得試樣暴 露于試樣介質(zhì)的不同區(qū)域。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其中；所述介質(zhì)槽道包括流體通路，所述流體通路使得 在試樣周圍灌注的介質(zhì)返回至布置于井中的介質(zhì)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其中；至少所述孔由可拆卸的井插入件來(lái)限定。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其中：至少所述試樣嵌套部位和所述孔由可拆卸的井 插入件來(lái)限定。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其中；所述試樣嵌套部位、所述孔和所述介質(zhì)槽道由可 拆卸的井插入件來(lái)限定。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其中：所述試樣嵌套部位包括由可拆卸的井插入件限 定的、介質(zhì)可透過(guò)的平臺(tái)。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其中：井包括與介質(zhì)槽道流體連通的貶槽。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其中：所述試樣嵌套部位布置在用于收集介質(zhì)并與所 述介質(zhì)槽道流體連通的貶槽中。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其中；所述介質(zhì)槽道包括流體通路，所述流體通路限 定在井中的介質(zhì)表面下面的閉合環(huán)路，W便當(dāng)柱塞在所述孔內(nèi)向上和向下運(yùn)動(dòng)時(shí)都允許介 質(zhì)在所述試樣周圍灌注流動(dòng)。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，還包括；傳感器，用于檢測(cè)布置在所述試樣周圍的介 質(zhì)中的溶質(zhì)濃度。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的裝置，其中：傳感器布置在井的底部。
14. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，還包括；柱塞，所述柱塞用于在相應(yīng)井的孔內(nèi)往復(fù)運(yùn) 動(dòng)。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的裝置，還包括；傳感器，所述傳感器布置在柱塞上，用于檢 測(cè)布置在所述試樣周圍的介質(zhì)中的溶質(zhì)濃度。
16. 根據(jù)權(quán)利要求12或15所述的裝置，其中：所述傳感器測(cè)量在所述試樣周圍的介質(zhì) 中溶解的氧、二氧化碳或氨離子的濃度。
17. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其中：所述多個(gè)井限定了包括24或96個(gè)井的多井板。
18. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，還包括：氧、二氧化碳和/或生物惰性氣體的源，所述 源與井中的介質(zhì)或在井中的介質(zhì)表面上面的頂部空間流體連通，用于控制在所述頂部空間 中或介質(zhì)中的氣體的組成。
19. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，還包括：生物活性物質(zhì)的溶液源，所述溶液源與井中 的介質(zhì)流體連通，用于使得試樣暴露于所述物質(zhì)。
20. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，還包括：布置在所述試樣嵌套部位上的=維細(xì)胞生長(zhǎng) 支架。
21. -種用于進(jìn)行=維細(xì)胞試樣的分析的裝置，所述裝置包括： 井，用于保持試樣和試樣介質(zhì)，所述井包括： 試樣嵌套部位； 布置在所述試樣嵌套部位上面的孔，所述孔的尺寸設(shè)置成與柱塞相互配合，所述柱塞 在孔內(nèi)和在布置于所述井中的介質(zhì)內(nèi)豎直向下運(yùn)動(dòng)；W及 介質(zhì)槽道，所述介質(zhì)槽道與所述試樣嵌套部位流體連通，所述介質(zhì)槽道允許介質(zhì)在所 述試樣周圍灌注；W及 柱塞，用于在所述孔中往復(fù)運(yùn)動(dòng)，W便推動(dòng)介質(zhì)在所述試樣周圍灌注。
22. 根據(jù)權(quán)利要求21所述的裝置，還包括；傳感器，用于檢測(cè)在試樣嵌套部位周圍的介 質(zhì)中的溶解介質(zhì)成分的濃度。
23. -種用于培養(yǎng)板的井的插入件，用于使得井適合對(duì)于布置于其中的=維細(xì)胞培養(yǎng) 試樣進(jìn)行灌注，所述插入件包括該樣的結(jié)構(gòu)，所述結(jié)構(gòu)限定了： 試樣嵌套部位，所述試樣嵌套部位包括介質(zhì)可透過(guò)的平臺(tái)； 布置在試樣嵌套部位上面的孔，所述孔的尺寸設(shè)置成與柱塞相互配合，所述柱塞在孔 內(nèi)和在布置于井中的介質(zhì)內(nèi)豎直向下運(yùn)動(dòng)；W及 介質(zhì)槽道，所述介質(zhì)槽道與所述試樣嵌套部位流體連通，所述介質(zhì)槽道允許介質(zhì)由柱 塞推動(dòng)而在所述試樣周圍灌注。
24. -種對(duì)于=維細(xì)胞培養(yǎng)試樣例如組織試樣、活檢試樣或保持細(xì)胞的細(xì)胞支架進(jìn)行 試驗(yàn)、W便保持試樣的生存力和對(duì)它的微環(huán)境進(jìn)行控制的方法，所述方法包括W下步驟： 提供井，所述井包括：試樣嵌套部位；孔，所述孔的尺寸設(shè)置成與布置在試樣嵌套部位 上面的柱塞相互配合；介質(zhì)槽道，所述介質(zhì)槽道與所述試樣嵌套部位流體連通；W及柱塞， 所述柱塞用于在所述孔中往復(fù)運(yùn)動(dòng)； 將試樣布置在井內(nèi)的介質(zhì)中的試樣嵌套部位上；W及 使得所述柱塞在孔內(nèi)運(yùn)動(dòng)，W便推動(dòng)介質(zhì)在試樣周圍流動(dòng)和通過(guò)所述介質(zhì)槽道，從而 W介質(zhì)灌注試樣。
25. 根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，還包括W下附加步驟；將氣體添加給介質(zhì)或在井中 在介質(zhì)上面的頂部空間，W便通過(guò)改變?nèi)芙鈿怏w組分來(lái)改變?cè)嚇又車奈h(huán)境。
26. 根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，還包括W下附加步驟；將生物活性物質(zhì)的溶液添加 給介質(zhì)，W便通過(guò)使得試樣暴露于生物活性物質(zhì)而改變?cè)嚇又車奈h(huán)境。
27. 根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，還包括W下附加步驟；測(cè)量在所述試樣周圍的介質(zhì) 中的一種或多種溶質(zhì)的濃度。
28. 根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，還包括W下附加步驟；對(duì)在所述試樣周圍的介質(zhì)中 的一種或多種溶質(zhì)的濃度進(jìn)行多次測(cè)量，該些測(cè)量在時(shí)間上分開(kāi)。
29. 根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，還包括W下附加步驟；將計(jì)量量的一種或多種氣體 和/或一種或多種溶質(zhì)添加給所述井中的介質(zhì)，從而將所述試樣周圍的介質(zhì)中的微環(huán)境設(shè) 置成預(yù)定點(diǎn)。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，還包括；將微環(huán)境設(shè)置成缺氧條件。
31.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，還包括；將氧清除劑添加給介質(zhì)。
32.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，還包括；將人體活檢組織試樣布置在所述嵌套部位 上；將可能的治療藥物添加給介質(zhì)；W及估計(jì)藥物對(duì)試樣的效果。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，還包括W下附加步驟；將計(jì)量量的一種或多種氣體 和/或一種或多種溶質(zhì)添加給所述井中的介質(zhì)，從而將所述試樣周圍的介質(zhì)中的微環(huán)境設(shè) 置成預(yù)定點(diǎn)。
34.根據(jù)權(quán)利要求24或32所述的方法，其中：試樣是腫瘤試樣，所述方法還包括W下 附加步驟：將計(jì)量量的一種或多種氣體和/或一種或多種溶質(zhì)添加給所述井中的介質(zhì)，W 將所述試樣周圍的介質(zhì)中的微環(huán)境設(shè)置成預(yù)定點(diǎn)，從而模擬腫瘤試樣在活體內(nèi)的微環(huán)境。
35.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，還包括，使得所述方法通過(guò)W下步驟來(lái)多路復(fù)用： 提供多個(gè)所述井，所述井包括：試樣嵌套部位；孔，所述孔的尺寸設(shè)置成與布置在試樣 嵌套部位上面的柱塞相互配合；介質(zhì)槽道，所述介質(zhì)槽道與所述試樣嵌套部位流體連通； W及柱塞，所述柱塞用于在所述孔中往復(fù)運(yùn)動(dòng)； 將試樣布置在多個(gè)井內(nèi)的介質(zhì)中的試樣嵌套部位上； 使得多個(gè)所述柱塞在孔內(nèi)運(yùn)動(dòng)，W便推動(dòng)介質(zhì)在試樣周圍流動(dòng)和通過(guò)所述介質(zhì)槽道， 從而W介質(zhì)灌注試樣；W及 一次或多次測(cè)量在多個(gè)所述井中在所述試樣周圍的介質(zhì)中的一種或多種溶質(zhì)的濃度。
36.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，還包括W下附加步驟；將一個(gè)或多個(gè)載有固定不動(dòng) 的膠合劑的小珠布置在介質(zhì)中，所述膠合劑用于由試樣分泌或吸收的感興趣生物分子；W 及使用所述小珠來(lái)檢測(cè)所述生物分子在試樣的微環(huán)境中的存在性或濃度。
37.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，還包括；止回閥，所述止回閥布置在所述介質(zhì)槽道中， W便防止介質(zhì)相對(duì)于試樣從介質(zhì)槽道往回灌注。
【文檔編號(hào)】B01L3/00GK104471052SQ201380003973
【公開(kāi)日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2013年11月13日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月13日
【發(fā)明者】P·麥克戈?duì)? A·C·尼爾森, J·S·泰希 申請(qǐng)人:海馬生物科學(xué)公司