一種Leber遺傳性視神經(jīng)病變基因檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本實用新型屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種基因多態(tài)性檢測試劑盒，具體涉及一種 Leber遺傳性視神經(jīng)病變基因檢測試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] Leber遺傳性視神經(jīng)病變(LH0N)是一種由線粒體DNA突變引起的母系遺傳的線粒 體疾病，主要累及視盤黃斑束纖維，導(dǎo)致視神經(jīng)退行性變，青春期發(fā)病，雙眼急性或亞急性 中心視力下降。因為視力損害嚴(yán)重，不僅給患者心理上造成極大的痛苦和障礙，也給家庭和 社會帶來沉重的負擔(dān)。
[0003] 隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，目前已發(fā)現(xiàn)近40種不同的mtDNA點突變與LH0N密切 相關(guān)，但只有6346(^、6117784、!14484(：三個位點的突變被稱為1^(^的"原發(fā)性點突變"，超 過95 %的LH0N家系為此三個原發(fā)突變。因此，研發(fā)一種快速簡單有效的檢測G3460A、 G11778A、T14484C三個突變位點基因型的試劑盒顯得尤為重要(Mackey DA，0ostra RJ， Rosenberg T,Primary pathogenic mtDNA mutations in multigeneration pedigrees with Leber hereditary optic neuropathy[J].Am J Hum Genet，1996;59:481-5.)〇 【實用新型內(nèi)容】
[0004] 本實用新型要解決的技術(shù)問題為目前市場上針對Leber遺傳性視神經(jīng)病變基因檢 測特異性不強，成本高且操作復(fù)雜的問題，本實用新型能較好的應(yīng)用于Leber遺傳性視神經(jīng) 病變基因 G3460A、G11778A、T14484C三個位點單核苷酸多態(tài)性檢測，體積小，操作簡單，便于 運輸攜帶和使用。
[0005] 為實現(xiàn)上述目的，本實用新型采用以下技術(shù)方案：
[0006] -種Leber遺傳性視神經(jīng)病變基因檢測試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒包括盒 體（1)、海綿襯墊(2)，所述的海綿襯墊(2)置于盒體（1)內(nèi)，海綿襯墊(2)上設(shè)有多個容器孔 并裝有多個裝有檢測試劑的試劑管，分別為裝有G3460A位點基因多態(tài)性檢測反應(yīng)液的試劑 管(3)、裝有G11778A位點基因多態(tài)性檢測反應(yīng)液的試劑管(4)、裝有T14484C位點基因多態(tài) 性檢測反應(yīng)液的試劑管(5)、裝有野生型陽性對照的試劑管(6)、裝有突變型陽性對照的試 劑管⑴、裝有雜合子陽性對照的試劑管⑶、裝有陰性對照的試劑管(9)。
[0007] 所述的容器孔較佳的為7個，容器孔在所述的海綿襯墊上分2排排列，上述的裝有 G3460A、G11778A、T14484C三個位點基因多態(tài)性檢測反應(yīng)液的試劑管3、4、5均為2ml試劑管， 裝有野生型陽性對照、突變型陽性對照、雜合子陽性對照、陰性對照的試劑管均為0.5ml試 劑管。
[0008] 上述的裝有G3460A位點基因多態(tài)性檢測反應(yīng)液的試劑管(3)、裝有G11778A位點基 因多態(tài)性檢測反應(yīng)液的試劑管(4)、裝有T14484C位點基因多態(tài)性檢測反應(yīng)液的試劑管(5) 均包括DNA聚合酶、尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG酶）、特異性引物和探針及Mg2+。
[0009] 所述的陽性對照包括野生型陽性對照、突變型陽性對照、雜合子陽性對照，所述的 野生型陽性對照為分別含有6346(^、611778六、114484(：三個位點的野生型純合子基因序列 及其多態(tài)性檢測上游和下游引物及引物之間的線粒體DNA序列的質(zhì)粒，突變型陽性對照為 分別含有G3460A、G11778A、T14484C三個位點的突變型純合子基因及其多態(tài)性檢測上游和 下游引物及引物之間的線粒體DNA序列的質(zhì)粒，雜合子陽性對照為等比例混合的野生型陽 性對照質(zhì)粒和突變型陽性對照質(zhì)粒。
[0010]所述的G3460A位點基因多態(tài)性檢測引物包括：
[0011 ]上游引物，其序列為:5 '-GCTTACCGAACGAAAAATTCTAGG-3 '。
[0012]
[0013] 所述的G11778A位點基因多態(tài)性檢測引物包括：
[0014] 上游引物，其序列為:5'-〇6〇厶6!1^1'1'(：11^丁厶厶111；0：-3'。
[0015] 下游引物，其序列為:5 '-GGGGGGTAAGGCGAGGTT-3 '。
[0016]所述的T14484C位點基因多態(tài)性檢測引物包括：
[0017] 上游引物，其序列為:5'-0六606六了66〇^!1^^66六6了六-3'。
[0018] 下游引物，其序列為:5'-〇6厶厶!1^厶〇0^6厶0：0：1'(：1'-3'。
[0019]所述的G3460A位點基因多態(tài)性檢測探針包括：
[0020] 野生型檢測探針，其序列為:5 '-ACCCTTCGCTGACGCCATAAAACT-3 '，其5 '端標(biāo)記物為 J0E，3'標(biāo)記物為BHQ1。
[0021 ] 突變型檢測探針，其序列為:5 '-ACCCTTCGCTGACACCATAAAACT-3 '，其5 '端標(biāo)記物為 CY5,3'標(biāo)記物為BHQ2。
[0022]所述的G11778A位點基因多態(tài)性檢測探針包括：
[0023] 野生型檢測探針，其序列為：5 '-ACGAACGCACTCACAGTCGCATCAT-3 '，其5 '端標(biāo)記物 為R0X，3'標(biāo)記物為BHQ1。
[0024] 突變型檢測探針，其序列為:5 '-ACGAACGCACTCACAGTCACATCAT-3 '，其5 '端標(biāo)記物 為TAMRA，3 '標(biāo)記物為BHQ2。
[0025]所述的T14484C位點基因多態(tài)性檢測探針包括：
[0026] 野生型檢測探針，其序列為:5 '-AGAGTATGATGGGGTGGTGGTTGT-3 '，其5 '端標(biāo)記物為 FAM，3'標(biāo)記物為MGB。
[0027] 突變型檢測探針，其序列為:5 '-AGAGTATGATGGGGCGGTGGTTGT-3 '，其5 '端標(biāo)記物為 VIC，3'標(biāo)記物為MGB。
[0028]本實用新型較佳的實施方法為：
[0029] 1.試劑準(zhǔn)備:將試劑盒中3管檢測反應(yīng)液分別取30此與陽性對照、陰性對照及待檢 樣本的基因組DNA 10yL混勻待擴增。
[0030] 2.擴增檢測:進行PCR擴增檢測。
[0031] 3 ?檢測結(jié)果分析。
[0032]優(yōu)選地，所述的PCR擴增檢測步驟包括：
[0033] 1.熒光通道選擇:G3460A位點基因多態(tài)性檢測反應(yīng)液對應(yīng)選擇J0E和CY5 2個檢測 通道，G11778A位點基因多態(tài)性檢測反應(yīng)液對應(yīng)選擇R0X和TAMRA 2個檢測通道，T14484C位 點基因多態(tài)性檢測反應(yīng)液對應(yīng)選擇FAM和VIC 2個檢測通道，參比熒光設(shè)置為none。
[0034] 2.反應(yīng)條件設(shè)定:反應(yīng)體積設(shè)定為40yL，UNG酶反應(yīng)條件為37 °C加熱5分鐘，預(yù)變性 條件為95°C加熱5分鐘，變性條件為95°C，15秒，以及退火、延伸及檢測熒光條件為60°C，1分 鐘，共40個循環(huán)。
[0035]應(yīng)用本實用新型的有益效果為:本實用新型提供的Leber遺傳性視神經(jīng)病變基因 6346(^、6117784、!14484(：三個位點多態(tài)性擴增檢測試劑盒，通過使用優(yōu)化設(shè)計的特異性檢 測引物和探針及PCR擴增反應(yīng)條件，有效克服了傳統(tǒng)檢測方法步驟繁瑣，耗時，假陽性和假 陰性易出現(xiàn)的缺點，大大提高Leber遺傳性視神經(jīng)病變基因 G3460A、G11778A、T14484CSf 位點多態(tài)性檢測的特異性。
[0036] 本實用新型提供的Leber遺傳性視神經(jīng)病變基因6346(^、6117784、!14484(：三個位 點多態(tài)性擴增檢測試劑盒設(shè)計合理，內(nèi)部結(jié)構(gòu)及各離心管排列有序，大小適宜，便于運輸和 使用。
【附圖說明】
[0037]圖1為本實用新型的Leber遺傳性視神經(jīng)病變基因檢測試劑盒結(jié)構(gòu)示意圖。
[0038]圖2為本實用新型的G3460A位點基因多態(tài)性檢測反應(yīng)液對野生型、突變型及雜合 子樣本檢測結(jié)果圖，其中al標(biāo)示野生型樣本J0E通道檢測曲線，bl標(biāo)示突變型樣本CY5通道 檢測曲線，cl和dl分別標(biāo)示雜合子樣本J0E和CY5通道檢測曲線。
[0039] 圖3為本實用新型的G11778A位點基因多態(tài)性檢測反應(yīng)液對野生型、突變型及雜合 子樣本檢測結(jié)果圖，其中a2標(biāo)示野生型樣本R0X通道檢測曲線，b2標(biāo)示突變型樣本TAMRA通 道檢測曲線，c2和d2分別標(biāo)示雜合子樣本R0X和TAMRA通道檢測曲線。
[0040] 圖4為本實用新型的T14484C位點基因多態(tài)性檢測反應(yīng)液對野生型、突變型及雜合 子樣本檢測結(jié)果圖，其中a3標(biāo)示野生型樣本FAM通道檢測曲線，b3標(biāo)示突變型樣本VIC通道 檢測曲線，c3和d3分別標(biāo)示雜合子樣本FAM和VIC通道檢測曲線。
【具體實施方式】
[0041] 為了能夠更清楚地描述本實用新型的技術(shù)內(nèi)容，下面結(jié)合具體實施例來進行進一 步的描述。
[0042] 本實用新型所述的Leber遺傳性視神經(jīng)病變基因檢測試劑盒包括盒體(1)、海綿襯 墊(2)，所述的海綿襯墊(2)置于盒體（1)內(nèi)，海綿襯墊(2)上設(shè)有多個容器孔并裝有多個裝 有檢測試劑的試劑管，分別為裝有G3460A位點基因多態(tài)性檢測反應(yīng)液的試劑管（3 )、裝有 G11778A位點基因多態(tài)性檢測反應(yīng)液的試劑管(4)、裝有T14484C位點基因多態(tài)性檢測反應(yīng) 液的試劑管(5)、裝有野生型陽性對照的試劑管(6)、裝有突變型陽性對照的試劑管(7)、裝 有雜合子陽性對照的試劑管(8)、裝有陰性對照的試劑管(9)。
[0043] 所述的G3460A、G11778A、T14484C三個位點基因多態(tài)性檢測反應(yīng)液的試劑管3、4、5 中反應(yīng)液體積均為1.7ml，試劑管規(guī)格為2ml。
[0044] 所述的陽性對照包括野生型陽性對照、突變型陽性對照、雜合子陽性對照，所述的 野生型陽性對照為分別含有6346(^、611778六、114484(：三個位點的野生型純合子基