專利名稱：一種檢測(cè)Leber病調(diào)控子的試劑盒及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種與Leber病調(diào)控子相關(guān)的線粒體基因突變的檢測(cè)方法，特別涉及檢測(cè)線粒體tRNAMet A4435G突變的方法，還涉及用于檢測(cè)與Leber病調(diào)控子相關(guān)的線粒體DNA A4435G突變的試劑盒，以及上述方法或上述的試劑盒在檢測(cè)與Leber病調(diào)控子相關(guān)的線粒體DNA A4435G突變中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
Leber 遺傳性視神經(jīng)病變(Leber，s Hereditary Optic Neuropathy, LH0N,簡(jiǎn)稱Leber病)是視神經(jīng)病變的一種類型，主要累及視網(wǎng)膜、鞏膜篩板前部視乳頭黃斑束纖維，導(dǎo)致視神經(jīng)退行性變的母系遺傳病，嚴(yán)重的影響著人們正常的生產(chǎn)、生活。根據(jù)國(guó)家衛(wèi)生部(http://www. moh. gov. cn/)最新數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)我國(guó)現(xiàn)有的低視力人口約有710萬,盲人約有500萬，占總?cè)藬?shù)的0. 4%，成為世界上視力損傷最嚴(yán)重的國(guó)家之一。其中，由視神經(jīng)病變引起的約為55萬。1871年德國(guó)眼科醫(yī)生Theodor Leber首次報(bào)道該病的臨床癥狀、體征和遺傳特性。1972年Erickson等發(fā)現(xiàn)LHON的遺傳方式呈典型的母系遺傳特征。1988年WallaceDC等發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)與LHON相關(guān)的線粒體基因組DNA (mitochondria DNA, mtDNA)突變位為、ND4 G11778A。目前已報(bào)道50多種線粒體DNA突變位點(diǎn)與LHON致病相關(guān)(http://WWW.mitomap. org/)，其中 tRNAMet A4435G 和 tRNAThr A15951G 等被稱為 “Leber 病調(diào)控子”。與線粒體DNA突變相關(guān)的Leber遺傳性視神經(jīng)病變?cè)谠缙谂R床癥狀不明顯，早期的檢查常常會(huì)因此被耽誤，尤其在我國(guó)偏遠(yuǎn)農(nóng)村地區(qū)，這種情況普遍存在。因此，在高危人群和易感人群中開展mtDNA突變篩查，對(duì)于預(yù)防和控制與線粒體相關(guān)的LHON的發(fā)生有著極其重要的作用。自發(fā)現(xiàn)與mtDNA突變相關(guān)的疾病以來，檢測(cè)線粒體突變位點(diǎn)的檢測(cè)方法主要還是序列測(cè)定。直接測(cè)序法是鑒定突變的黃金標(biāo)準(zhǔn)，但該操作繁瑣，費(fèi)用昂貴限制了它的廣泛應(yīng)用。近年來，國(guó)內(nèi)相繼報(bào)道了 Leber遺傳性視神經(jīng)病變的基因診斷試劑盒及其檢測(cè)方法，以滿足對(duì)線粒體突變突變進(jìn)行廣泛篩查的需要，如福建醫(yī)科大學(xué)于2005年申請(qǐng)了的基因診斷試劑盒及其檢測(cè)方法專利(專利號(hào)200510006097. 8)，該發(fā)明是根據(jù)90 %以上的Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變患者的線粒體DNA突變屬于3個(gè)原發(fā)性致病位點(diǎn)突變(G11778A、G3460A和T14484C)，設(shè)計(jì)和合成位點(diǎn)特異性PCR引物，直接以全血樣作PCR的DNA模板，利用等位基因特異性多重PCR技術(shù)，單管一次性PCR反應(yīng)，同時(shí)檢測(cè)LHON患者的線粒體DNA的3個(gè)原發(fā)性致病突變位點(diǎn)，具有簡(jiǎn)便快速、高效、費(fèi)用低、特異性好、只需微量血液樣本等優(yōu)點(diǎn)，為L(zhǎng)HON患者的快速臨床基因診斷提供一種簡(jiǎn)易、可靠的方法和試劑盒，具有巨大的普及推廣應(yīng)用價(jià)值。但是該方法存在血液中直接PCR擴(kuò)增的難度加大，實(shí)驗(yàn)中采取的多重PCR的條件要求將會(huì)增加，檢測(cè)方法跟普通的方法沒有本質(zhì)的區(qū)別。2006年杭州優(yōu)思達(dá)生物科技有限公司建立一種以單核苷酸多態(tài)性核酸試紙快速檢測(cè)LHON線粒體DNA中G11778A位點(diǎn)突變的新方法(專利號(hào)200610003429. I)。在應(yīng)用單核苷酸多態(tài)性核酸檢測(cè)試紙條進(jìn)行多態(tài)位點(diǎn)或突變位點(diǎn)的檢測(cè)時(shí)，需要設(shè)計(jì)一條特異性延伸引物，這條引物的3’端堿基緊臨多態(tài)性堿基或突變堿基，其在DNA聚合酶的作用下開始延伸，帶有抗原標(biāo)記與模板對(duì)應(yīng)的雙脫氧單核苷酸(ddNTP)被連接到延伸引物上。雖然該方法能夠?qū)崿F(xiàn)短時(shí)間內(nèi)的檢測(cè)陽性位點(diǎn)，但PCR 擴(kuò)增條件嚴(yán)格，存在假陰性的幾率大大增加。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)Leber病調(diào)控子相關(guān)的線粒體DNA突變的試劑盒，由引物序列、提取樣本基因組DNA的試劑、PCR擴(kuò)增反應(yīng)試劑、陽性標(biāo)本對(duì)照、陰性標(biāo)本對(duì)照以及使用說明書構(gòu)成，其中，提取樣本基因組DNA的試劑主要由細(xì)胞裂解液和溶液I (主要成分是蛋白酶K)組成；PCR擴(kuò)增反應(yīng)試劑包括dNTP、10XPCR緩沖液、MgCl2、三蒸水和Taq酶，所述的引物序列外前向引物F: TGG CTC CTT TAA CCT CTC CA，外反向引物R: AAG GATTAT GGA TGC GGT TG;內(nèi)前向引物 F: CCT ACC ACT CAC CCT AGC AT，內(nèi)反向引物 R: AATCAG TGC GAG CTT AGC GC ;限制性內(nèi)切酶包括限制性內(nèi)切酶III ;陽性標(biāo)本對(duì)照是含有線粒體序列第4435位點(diǎn)發(fā)生A>G突變的酶切樣本、陰性標(biāo)本對(duì)照是不含有線粒體序列第4435位點(diǎn)發(fā)生A>G突變的酶切樣本。在上述試劑盒中，在PCR擴(kuò)增反應(yīng)試劑中添加用于提高延伸反應(yīng)特異性的少許二甲基亞砜(0. 1-0. 2 y I為宜)。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供所述試劑盒在檢測(cè)與Leber病調(diào)控子相關(guān)的線粒體基因mtDNA A4435G突變中的應(yīng)用。通過以下步驟實(shí)現(xiàn)
(1)基因組DNA的提取運(yùn)用蛋白酶K消化裂解法，從少量的血液標(biāo)本、帶毛囊的毛發(fā)、口腔粘膜刮片、血濾紙片或唾液的樣本中提取基因組DNA ;
(2)特異性PCR擴(kuò)增使用Primer5. 0軟件和01igo7. 0軟件根據(jù)SEQ ID N0:5所示的人類線粒體基因序列設(shè)計(jì)引物包含突變位點(diǎn)的基因片段3777-4679，外前向引物F: TGGCTC CTT TAA CCT CTC CA (SEQ ID NO: 1)，外反向引物 R: AAG GAT TAT GGA TGC GGT TG(SEQ ID NO: 2);內(nèi)前向引物 F: CCT ACC ACT CAC CCT AGC AT (SEQ ID NO: 3)，內(nèi)反向引物 R: AAT CAG TGC GAG CTT AGC GC (SEQ ID N0:4)；
(3)酶切鑒定將上述PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶A^aIII對(duì)A4435G突變位點(diǎn)處進(jìn)行酶切；
(4)突變檢測(cè)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，直接根據(jù)酶切PCR產(chǎn)物產(chǎn)生的DNA片段數(shù)量及DNA片段大小，檢測(cè)mtDNA是否發(fā)生A4435G突變。在上述檢測(cè)A4435G突變的方法的步驟(I)中，樣本來源于從毛細(xì)血管靜脈血標(biāo)本、帶毛囊的毛發(fā)、口腔粘膜刮片、血濾紙片或唾液，根據(jù)取樣方式或被測(cè)樣本形式不同，對(duì)不同樣本進(jìn)行相應(yīng)的預(yù)處理，樣本預(yù)處理方法如下
(1)血標(biāo)本或血濾紙片取20 200ill少量血標(biāo)本(如一滴血)或Icm2的血濾紙片放A I. 5ml EP 管(Eppendorf 管)，加入 900 U I 紅細(xì)胞裂解緩沖液(20mmol/L Tris-HCl，pH
7.6)室溫靜置lOmin，充分裂解紅細(xì)胞，12000rpm離心lmin，收集白細(xì)胞沉淀；
(2)帶毛囊的毛發(fā)用70%乙醇洗帶毛囊的毛發(fā)I次，后再用蒸餾水沖洗毛發(fā)2次。在1.5ml EP管中分別放入2 4根毛發(fā)，毛囊置于EP管底部，用干凈的剪刀剪去毛發(fā)高于EP管的部分；
(3)口腔粘膜刮片或唾液收集唾液前，必須讓被收集者漱口。以除去口腔中過多的老化細(xì)胞、食物殘?jiān)⒀栏?、咖啡、煙等物質(zhì)。半小時(shí)內(nèi)不要喝水、進(jìn)食、吸煙，然后開始收集口腔粘膜刮片或唾液，可視條件選擇如下方法收集唾液樣本①舌頭圍繞口腔刮取粘膜細(xì)胞，將約0. Iml唾液直接吐進(jìn)EP管內(nèi)生理鹽水漱口，吐進(jìn)EP管內(nèi)，吸取PBS溶液至裝有通過上述任一種方法收集的唾液樣本的EP管中，反復(fù)吹打后，12000rpm離心5min，除去上清，重復(fù)該過程一次用棉拭子反復(fù)刮拭面頰內(nèi)壁6次，空氣中干燥，然后用滅菌過的鑷子小心撕去其外表面，放入EP管中將唾液吐在濾紙上，空氣中干燥后形成唾液斑，再用干凈的剪刀剪成大小約Icm2碎紙片置于EP管中。
在步驟(I)中經(jīng)過上述預(yù)處理后，用細(xì)胞裂解液和蛋白酶K對(duì)上述樣本進(jìn)行消化裂解，再鹽析法去除蛋白等雜質(zhì)，異丙醇沉淀DNA，最后用高壓滅菌水或TE緩沖液溶解后于-20°C保存?zhèn)溆?。在上述檢測(cè)方法的步驟(2)中，引物設(shè)計(jì)的指導(dǎo)思想是，針對(duì)A4435G位點(diǎn)存在的位置，利用巢式PCR擴(kuò)增基因片段；針對(duì)4435位點(diǎn)設(shè)計(jì)內(nèi)外巢式引物(參照?qǐng)DI)。在上述檢測(cè)方法的步驟(3)中，針對(duì)特異性PCR擴(kuò)增后，A4435G位點(diǎn)形成了新的酶切位點(diǎn)。其酶切位點(diǎn)是由mtDNA A4435G突變形成的，其中的限制性內(nèi)切酶為犯a III ；
用以上設(shè)計(jì)的引物，以相應(yīng)的被檢測(cè)樣本的DNA為模板，通過PCR外引物擴(kuò)增后分別獲得明亮清晰的大小約903bp的恒定擴(kuò)增帶，在使用內(nèi)引物擴(kuò)增出365bp擴(kuò)增帶4435突變位點(diǎn)在擴(kuò)增片段上。在上述檢測(cè)Leber病調(diào)控子突變的方法中，結(jié)合特異性PCR技術(shù)和酶切技術(shù)，每份DNA樣本分別用特異性引物即外/內(nèi)引物于PCR反應(yīng)管中進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，然后進(jìn)行突變位點(diǎn)處的酶切，通過PCR酶切后便可在幾小時(shí)內(nèi)檢出Leber病調(diào)控子相關(guān)的mtDNA A4435G突變。理論上，基因組DNA樣本經(jīng)PCR反應(yīng)，即體系中僅加入針對(duì)突變型位點(diǎn)A4435G引物F#/R#后，擴(kuò)增后以此產(chǎn)物為模板再在引物F@/R#下進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，然后用限制性內(nèi)切酶III進(jìn)行酶切，就可進(jìn)行檢測(cè)。也就是說，同DNA樣本經(jīng)巢式PCR-酶切，從而使檢測(cè)結(jié)果更為準(zhǔn)確、可信。用本發(fā)明的方法及其制備的體外檢測(cè)Leber病調(diào)控子相關(guān)的線粒體基因mtDNAA4435G突變?cè)噭┖芯哂幸韵绿攸c(diǎn)
I.傳統(tǒng)上獲得Leber遺傳性視神經(jīng)病變患者基因組DNA的方法是從血液中提取，每人大約需要3 5ml。這種采血方法給很多被檢者尤其是嬰幼兒帶來了一些痛苦和傷害，而且在跨地區(qū)傳遞樣本時(shí)存在一定的風(fēng)險(xiǎn)和麻煩。本發(fā)明運(yùn)用蛋白酶K消化裂解法，從少量的血液標(biāo)本(如一滴血)、帶毛囊的毛發(fā)、口腔粘膜刮片血濾紙片或唾液等樣本中快速提取基因組DNA。該方法解決了傳統(tǒng)上從Leber遺傳性視神經(jīng)病變患者血液中提取DNA的問題，減輕被檢者的痛苦；而且還解決了跨地區(qū)傳遞樣本的問題，血濾紙片、毛發(fā)以及口腔粘膜刮片(棉拭子)或唾液斑濾紙片等可以很容易的放在信封內(nèi)，并可通過郵寄的方式跨地區(qū)傳遞。2.目前國(guó)內(nèi)外有幾種線粒體相關(guān)的母系遺傳性疾病基因診斷方法，如直接測(cè)序法熒光定量PCR檢測(cè)方法、基因芯片檢測(cè)方法等，由于其自身的缺陷，如費(fèi)時(shí)費(fèi)力、操作繁瑣以及檢測(cè)費(fèi)用偏高而不易在臨床進(jìn)行推廣。與這些方法相比較，PCR-酶切技術(shù)則結(jié)合了特異性PCR技術(shù)及酶切技術(shù)兩者的優(yōu)點(diǎn)，每份DNA樣本用特異性引物即引物F/R于PCR反應(yīng)管中進(jìn)行特異性巢式PCR擴(kuò)增，通過巢式PCR-酶切便可在幾小時(shí)內(nèi)同時(shí)檢出mtDNA A4435G突變。另外值得一提的是，本方法所用的引物均經(jīng)過仔細(xì)設(shè)計(jì)。首先，正常和突變等位基因間不同的堿基在酶切過程中對(duì)特異性限制性內(nèi)切酶形成的位點(diǎn)不同，因而大大提高了酶切的特異性；另外由正常對(duì)照和空白對(duì)照的產(chǎn)物可作為整個(gè)PCR反應(yīng)的分子內(nèi)控指標(biāo)，從而避免假陰性結(jié)果的出現(xiàn)，提高檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性。通過調(diào)整不同引物的濃度和比例以及對(duì)PCR反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，以確保結(jié)果的特異性和穩(wěn)定性。3.應(yīng)用本發(fā)明提供的試劑盒進(jìn)行mtDNA A4435G突變檢測(cè)，成本較其他檢測(cè)方法更低；檢測(cè)流程簡(jiǎn)便、快速，結(jié)果判讀直觀；對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備及操作人員無特殊要求，適合在一般醫(yī)院、分子生物實(shí)驗(yàn)室開展，便于在全國(guó)范圍內(nèi)特別是欠發(fā)達(dá)地區(qū)實(shí)行Leber病調(diào)控子相關(guān)的mtDNA A4435G突變的大規(guī)模篩查和預(yù)防性檢查。4.本發(fā)明是針對(duì)目前檢測(cè)tRNAMet A4435G突變的方法所存在的缺點(diǎn)提出的一種快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)的LHON相關(guān)基因突變檢測(cè)方法。


圖I是本發(fā)明的基因特異性巢式PCR擴(kuò)增方案示意圖。圖2是攜帶A4435G突變(WZL4家系)Leber遺傳性視神經(jīng)病變家系系譜圖。圖3是本發(fā)明的基因特異性巢式PCR引物示意圖。圖4是基因特異性巢式PCR擴(kuò)增酶切鑒定mtDNA A4435G突變的7%聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。
圖I和2中F#為特異性巢式PCR第一次擴(kuò)增的正向引物；R#為特異性巢式PCR第一次擴(kuò)增的反向引物，與F#配對(duì)使用；F#為特異性巢式PCR第二次擴(kuò)增的正向引物，R內(nèi)為特異性巢式PCR第二次擴(kuò)增的反向引物，與F肖配對(duì)使用；A4435G表示為線粒體DNA第4435位，野生型為A，發(fā)生基因突變后為G。圖3中□為正常男性個(gè)體；〇為正常女性個(gè)體；■為發(fā)病男性個(gè)體；籲為發(fā)病女性個(gè)體；，為先證者；/為已死亡的個(gè)體；I為該家系的第一代成員；II為該家系的第二代成員；111為該家系的第三代成員。圖4中Rl表示野生型位點(diǎn)檢測(cè)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖(正常對(duì)照者);R2表示先證者(WZL4- III -2)攜帶A4435G突變位點(diǎn)檢測(cè)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(未酶切)的電泳圖；R3為攜帶A4435G突變的先證者父親(WZL4- II -I) ;R4表示先證者攜帶A4435G突變位點(diǎn)檢測(cè)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物酶切鑒定的電泳圖；R5為攜帶A4435G突變的先證者母親(WZL4- II -2)；R6-R12分別為母系成員攜帶A4435G突變并且LHON患者。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，以使本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以更好的理解本發(fā)明并能予以實(shí)施，但所舉實(shí)施例不作為對(duì)本發(fā)明的限定。實(shí)施例I攜帶線粒體基因A4435G突變和原發(fā)性G11778A突變的Leber遺傳性視神經(jīng)病變家系的檢測(cè)，見圖I。I.檢測(cè)樣本
選擇I個(gè)攜帶A4435G突變的Leber遺傳性視神經(jīng)病變家系(WZL4家系)。其家系圖見圖2。這個(gè)家系呈現(xiàn)典型的母系遺傳，發(fā)病者均以視力下降不能矯正為唯一的臨床癥狀，但是家系中每個(gè)成員的視力損傷程度從輕度到極重度不等。這個(gè)家系總?cè)藬?shù)為25人，其中母系成員數(shù)為14人，視力下降患者有8人。2.基因組DNA的提取
分別獲取這8名受檢者的血濾紙片(一滴血)，將血濾紙片用干凈的剪刀剪成大小約Icm2的碎紙片放入I. 5ml EP管(Eppendorf管),加入900 y I紅細(xì)胞裂解緩沖液(20mmol/L Tris-HCl，pH 7. 6)室溫靜置lOmin，充分裂解紅細(xì)胞，12000rpm離心lmin，收集白細(xì)胞沉淀；然后加入600 u I細(xì)胞裂解液，混勻后再加入溶液I，使得蛋白酶K的工作濃度為20 V- g/mlo充分混勻后55°C消化裂解,接著以鹽析法去除蛋白等雜質(zhì),異丙醇沉淀DNA,最后用高壓滅菌水或TE緩沖液溶解后于_20°C保存?zhèn)溆谩?.引物設(shè)計(jì)
使用Primer 5. 0軟件和01igo7. 0軟件協(xié)助設(shè)計(jì)改良引物,根據(jù)已公開的人類線粒體基因劍橋參考序列(SEQ ID N0:5)進(jìn)行設(shè)計(jì)，引物的設(shè)計(jì)方案(見圖3)如下
針對(duì)mtDNA 4435位點(diǎn)，保證引物設(shè)計(jì)的特異性，我們?cè)O(shè)計(jì)巢式PCR兩對(duì)引物F#/R外，F(xiàn);它們長(zhǎng)度、退火溫度相近便于實(shí)驗(yàn)條件穩(wěn)定，以增強(qiáng)特異性。由此設(shè)計(jì)出的4435位點(diǎn)的巢式PCR引物為外前向引物F外TGG CTC CTT TAA CCT CTC CA，外反向引物R外AAGGAT TAT GGA TGC GGT TG;內(nèi)前向引物 F 內(nèi)CCT ACC ACT CAC CCT AGC AT，內(nèi)反向引物 R: AAT CAG TGC GAG CTT AGC GC。4.基因特異性巢式PCR擴(kuò)增
根據(jù)上述設(shè)計(jì)的4條引物序列，通過人工合成(委托生物公司)獲得2對(duì)引物，以上述提取的被檢樣本基因組DNA為模板，進(jìn)行基因特異性巢式PCR擴(kuò)增和7%的聚丙烯酰胺凝膠電泳酶切鑒定。表I基因特異性巢式PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(TAKARA公司產(chǎn)品)
PCR擴(kuò)増反應(yīng)試劑所需量
10 X PCR緩沖液1^1
dHTP (200 nmol/L)0.8M-1
MgCl； (25 umol/L)0.8 M-1
Fj-! F *0.4 M-I
引物--
R R *o.4Hi
Taq 聚合酶(5 U/M-l)0.2M-1
模板MA20ng
二塞水 UP t0 一__10 M-1
巢式PCR循環(huán)參數(shù)使用外引物為94°C預(yù)變性5min，接著94°C變性30s，58°C退火30s，72 °C延伸30s，重復(fù)循環(huán)30次后，然后使用內(nèi)引物94°C變性30s，55°C退火30s，72 °〇延伸30s，重復(fù)循環(huán)30次后，最后于72 °C再延伸5 min。PCR產(chǎn)物5 10 yl在7%的聚丙烯酰胺凝膠中電泳，經(jīng)EB染色后在凝膠成像儀上觀察并照相記錄結(jié)果。5.結(jié)果
根據(jù)圖4可知，當(dāng)先證者和正常對(duì)照樣本的基因組DNA分別經(jīng)2對(duì)引物F#/R#，F(xiàn)內(nèi)/R@巢式PCR酶切鑒定后，只產(chǎn)生一條365bp恒定擴(kuò)增帶，經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切鑒定后，產(chǎn)生的恒定擴(kuò)增帶被限制性內(nèi)切酶切成兩段(參見圖4泳道R4)，證明先證者樣品含mtDNA A4435G突變；而經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切鑒定后，產(chǎn)生的恒定擴(kuò)增帶沒有被限制性內(nèi)切酶切成兩段(參見圖4泳道R1)，證明該樣品不含mtDNA A4435G突變。家系WZL4的先證者(WZ4L- III -2)的基因組DNA經(jīng)2對(duì)引物F外/R外，、/1^進(jìn)行巢式PCR后，出現(xiàn)了 I條365bp的恒定擴(kuò)增帶(參見圖4泳道R2);而經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后，出現(xiàn)了兩條分別為251bp和114bp條酶切條帶(參見圖4泳道R4)，證明了該樣品攜帶mtDNA A4435G突變。R3為攜帶A4435G突變的先證者父親(WZL4- II -I) ;R4表示先證者攜帶A4435G突變位點(diǎn)檢測(cè)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物酶 切鑒定的電泳圖；R5為攜帶A4435G突變的先證者母親(WZL4- II -2) ;R6_R12分別為母系成員攜帶A4435G突變并且LHON患者。6.基因特異性巢式PCR擴(kuò)增檢測(cè)方法可靠性的檢驗(yàn)
經(jīng)基因特異性巢式PCR擴(kuò)增酶切鑒定后，我們?cè)诩蚁的赶党蓡T中檢測(cè)出攜帶A4435G突變陽性個(gè)體。進(jìn)一步將這些標(biāo)本的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析，測(cè)序結(jié)果與基因特異性巢式PCR擴(kuò)增結(jié)果相吻合，說明使用本發(fā)明方法檢測(cè)線粒體基因A4435G突變的可靠性和穩(wěn)定性?；蛱禺愋猿彩絇CR技術(shù)與熒光定量PCR技術(shù)、測(cè)序及基因芯片技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)(見表3)。表3本專利與其他相關(guān)專利技術(shù)指標(biāo)對(duì)照
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)Leber病調(diào)控子相關(guān)的線粒體DNA突變的試劑盒，由引物序列、提取樣本基因組DNA的試劑、PCR擴(kuò)增反應(yīng)試劑、陽性標(biāo)本對(duì)照、陰性標(biāo)本對(duì)照以及使用說明書構(gòu)成；其中，提取樣本基因組DNA的試劑由細(xì)胞裂解液和主要成分是蛋白酶K的溶液I組成；PCR擴(kuò)增反應(yīng)試劑包括dNTP、10XPCR緩沖液、MgCl2、三蒸Taq水和酶；引物序列是外前向引物 F: TGG CTC CTT TAA CCT CTC CA，外反向引物 R: AAG GAT TAT GGA TGC GGT TG;內(nèi)前向引物 F: CCT ACC ACT CAC CCT AGC AT，內(nèi)反向引物 R: AAT CAG TGC GAG CTT AGC GC;限制性內(nèi)切酶包括限制性內(nèi)切酶犯a III;陽性標(biāo)本對(duì)照是含有線粒體序列第4435位點(diǎn)發(fā)生A>G突變的酶切樣本、陰性標(biāo)本對(duì)照是不含有線粒體序列第4435位點(diǎn)發(fā)生A>G突變的酶切樣本。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種檢測(cè)Leber病調(diào)控子相關(guān)的線粒體DNA突變的試劑盒，其特征在于，在上述試劑盒中，在PCR擴(kuò)增反應(yīng)試劑中添加0. 1-0. 2u I 二甲基亞砜。
3.權(quán)利要求I所述的一種檢測(cè)Leber病調(diào)控子相關(guān)的線粒體DNA突變的試劑盒在檢測(cè)與Leber病調(diào)控子相關(guān)的線粒體基因mtDNA A4435G突變中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，通過以下步驟實(shí)現(xiàn)· (1)基因組DNA的提取運(yùn)用蛋白酶K消化裂解法，從少量的血液標(biāo)本、帶毛囊的毛發(fā)、口腔粘膜刮片、血濾紙片或唾液的樣本中提取基因組DNA ; (2)特異性PCR擴(kuò)增使用Primer5. 0軟件和01igo7. 0軟件根據(jù)SEQ ID NO: 5所示的人類線粒體基因序列設(shè)計(jì)引物包含突變位點(diǎn)的基因片段3777-4679，外前向引物F: TGGCTC CTT TAA CCT CTC CA，外反向引物 R: AAG GAT TAT GGA TGC GGT TG;內(nèi)前向引物 F:CCT ACC ACT CAC CCT AGC AT，內(nèi)反向引物 R: AAT CAG TGC GAG CTT AGC GC ； (3)酶切鑒定將上述PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶A^aIII對(duì)A4435G突變位點(diǎn)處進(jìn)行酶切； (4)突變檢測(cè)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，直接根據(jù)酶切PCR產(chǎn)物產(chǎn)生的DNA片段數(shù)量及DNA片段大小，檢測(cè)mtDNA是否發(fā)生A4435G突變。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，在步驟(I)中，樣本來源于從毛細(xì)血管靜脈血標(biāo)本、帶毛囊的毛發(fā)、口腔粘膜刮片、血濾紙片或唾液，根據(jù)取樣方式或被測(cè)樣本形式不同，對(duì)不同樣本進(jìn)行預(yù)處理，樣本預(yù)處理方法如下 (1)血標(biāo)本或血濾紙片取20 200ii I血標(biāo)本或Icm2的血濾紙片放入I. 5mlEppendorf管，加入900 ill紅細(xì)胞裂解緩沖液室溫靜置lOmin，充分裂解紅細(xì)胞，12000rpm離心lmin，收集白細(xì)胞沉淀；所用緩沖液為20mmol/L Tris-HCl, pH 7. 6 ； (2)帶毛囊的毛發(fā)用70%乙醇洗帶毛囊的毛發(fā)I次，后再用蒸餾水沖洗毛發(fā)2次，在1.5ml Eppendorf管中分別放入2 4根毛發(fā),毛囊置于Eppendorf管底部,用干凈的剪刀剪去毛發(fā)高于Eppendorf管的部分； (3)口腔粘膜刮片或唾液收集唾液前，必須讓被收集者漱口，以除去口腔中過多的老化細(xì)胞、食物殘?jiān)?、牙膏、咖啡、煙，半小時(shí)內(nèi)不喝水、進(jìn)食、吸煙，然后開始收集口腔粘膜刮片或唾液，選擇如下方法收集唾液樣本①舌頭圍繞口腔刮取粘膜細(xì)胞，將0. Iml唾液直接吐進(jìn)Eppendorf管內(nèi)！②生理鹽水漱口，吐進(jìn)Eppendorf管內(nèi)，吸取PBS溶液至裝有通過上述任一種方法收集的唾液樣本的Eppendorf管中，反復(fù)吹打后，12000rpm離心5min,除去上清，重復(fù)該過程一次用棉拭子反復(fù)刮拭面頰內(nèi)壁6次，空氣中干燥，然后用滅菌過的鑷子小心撕去其外表面,放入Eppendorf管中；@將唾液吐在濾紙上，空氣中干燥后形成唾液斑，再用干凈的剪刀剪成Icm2碎紙片置于Eppendorf管中。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，在步驟(I)中經(jīng)過預(yù)處理后，用細(xì)胞裂解液和蛋白酶K對(duì)上述樣本進(jìn)行消化裂解，再鹽析法去除蛋白等雜質(zhì)，異丙醇沉淀DNA，最后用高壓滅菌水或TE緩沖液溶解后于_20°C保存?zhèn)溆谩?br> 全文摘要
本發(fā)明提供一種檢測(cè)Leber病調(diào)控子相關(guān)的線粒體DNA突變的試劑盒，由引物序列、提取樣本基因組DNA的試劑、PCR擴(kuò)增反應(yīng)試劑、陽性標(biāo)本對(duì)照、陰性標(biāo)本對(duì)照以及使用說明書構(gòu)成，限制性內(nèi)切酶包括限制性內(nèi)切酶NlaⅢ；陽性標(biāo)本對(duì)照是含有線粒體序列第4435位點(diǎn)發(fā)生A>G突變的酶切樣本。本發(fā)明的試劑盒可在檢測(cè)與Leber病調(diào)控子相關(guān)的線粒體基因mtDNAA4435G突變中的應(yīng)用。本發(fā)明可確保檢測(cè)結(jié)果的特異性和穩(wěn)定性，成本較其他檢測(cè)方法更低，是檢測(cè)流程簡(jiǎn)便、快速，準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)的LHON相關(guān)基因突變檢測(cè)方法。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102747152SQ20121020765
公開日2012年10月24日 申請(qǐng)日期2012年6月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月24日
發(fā)明者冀延春, 張娟娟, 管敏鑫, 肖云, 蔣萍萍 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)