專利名稱：Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變相關(guān)mtDNA突變位點(diǎn)集成檢測(cè)基因芯片及其制備與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因芯片，具體涉及與Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變相關(guān)的檢測(cè)基因芯片及 其制備與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變(Leber， s hereditary optic neuropathy, L,)是一 種最常見的遺傳性視神經(jīng)萎縮疾病，以兩側(cè)急性或亞急性中央視力喪失為特征，主要累及 青少年男性。1871年，Theodor Leber首次報(bào)道了一個(gè)LHON家系，并詳盡描述了 LHON的 臨床特征。隨后一段時(shí)期內(nèi)，人們認(rèn)為L(zhǎng)HON的遺傳學(xué)模式與X染色體相關(guān)聯(lián)(X-linked), 直到1972年Erickson提議LHON的遺傳方式更傾向于母系遺傳，他認(rèn)為可能存在某個(gè)潛在 的線粒體DNA(mtDNA)突變與LHON相關(guān)。1988年，Wallace及其同事首次報(bào)道LHON與MTND4 基因11778G〉A(chǔ)突變相關(guān)，至今已有30多種mtDNA點(diǎn)突變被報(bào)道與LHON相關(guān)，它們廣泛地 分布在世界各地不同種族和人群中。從MITOMAP數(shù)據(jù)庫(kù)(http:〃w麗.mitomap.org)可以檢 索到與LHON相關(guān)的基因突變位點(diǎn)，其中90%以上的LHON患者與三大原發(fā)性mtDNA突變 (11778G〉A(chǔ), 3460G〉A(chǔ)及14484T〉C)有關(guān)，一些罕見的rotDNA突變也能引發(fā)LH0N，如14459G〉A(chǔ), 10663T〉C, 14568C>T， 14482T〉A(chǔ)/G, 14495A>G, 4171C〉A(chǔ)， 3733G〉A(chǔ)等。雖然LHON的發(fā)病機(jī) 制至今沒有被完全闡明，毋庸置疑，原發(fā)性突變是LHON的發(fā)病基礎(chǔ)。但僅存在原發(fā)性突變 還不足以致病，如攜帶11778G〉A(chǔ), 3460G〉A(chǔ)或14484T〉C的部分家系成員可不表現(xiàn)出任何臨 床癥狀，其他遺傳學(xué)因素(如繼發(fā)性mtDNA突變、核調(diào)節(jié)基因)和環(huán)境因素亦可能在LHON 的病理生理學(xué)進(jìn)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。此外，攜帶相同原發(fā)性突變位點(diǎn)的不同家系可表現(xiàn)出 不同的外顯率、發(fā)病年齡、嚴(yán)重程度以及視力喪失過(guò)程。因而，有必要對(duì)原發(fā)性突變以外 的致病因素(如罕見突變和繼發(fā)性突變)進(jìn)行篩査，以進(jìn)一步闡明mtDNA突變與LHON的關(guān) 系，為診斷和治療提供指導(dǎo)。
基因診斷技術(shù)的出現(xiàn)，改變了過(guò)去臨床上僅依靠典型家族史和臨床特征為判斷依據(jù)，提 高了對(duì)散發(fā)LHON病的確診率。至今LHON病仍無(wú)十分有效的療法，婚前遺傳咨詢和分子遺 傳學(xué)檢測(cè)是預(yù)防和降低本病發(fā)生率的有效措施。己經(jīng)建立了不少mtDNA突變檢測(cè)方法，如
4限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性(Restriction fragment length poly morphism， RFLP)、單鏈 構(gòu)象多態(tài)性(Single- strand conformation polymorphism, SSCP)、等位基因特異性寡核 苷酸斑點(diǎn)印記(Allele-specific oligonucleotide dot blot)、溫度梯度電泳(Temperature gradient gel electrophoresis, TGGE)、 瞬時(shí)溫度梯度電泳(Temporal temperature gradient gel electrophoresis, TTGE)、變性梯度凝膠電泳(Denaturant gradient gel electrophoresis, DGGE)禾口變性高效液相色譜(Denaturing high performance liquid chromatography, DHPLC)等，但在實(shí)際運(yùn)用中這些技術(shù)仍存在一定的局限性，如RFLP花費(fèi) 高、工作量大，且有些重要突變位點(diǎn)因不在所用限制性內(nèi)切核酸酶的識(shí)別范圍而不能被檢 測(cè)到，其他方法相對(duì)于RFLP要復(fù)雜，更主要的是，這些方法大多一次只能針對(duì)一個(gè)或幾個(gè) 突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果常需DNA測(cè)序驗(yàn)證。全長(zhǎng)mtDNA測(cè)序技術(shù)是目前LHON病最可 靠的基因診斷方法，但該方法工作量大、費(fèi)用昂貴，難以在常規(guī)臨床診斷實(shí)驗(yàn)室普及運(yùn)用。
目前，與本發(fā)明相關(guān)的中國(guó)發(fā)明專利共有三個(gè)，發(fā)明名稱分別是Leber氏遺傳性視 神經(jīng)病變檢測(cè)方法及其試劑盒(申請(qǐng)?zhí)?6116296.1)， Leber' s遺傳性視神經(jīng)病病人的線 粒體DNA突變定量檢測(cè)方法(申請(qǐng)?zhí)?00410027623.4)和Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變的 基因診斷試劑盒及其檢測(cè)方法(申請(qǐng)?zhí)?00510006097.8)。這些專利都只針對(duì)LH0N三種 原發(fā)性突變(11778G〉A(chǔ)， 3460G〉A(chǔ)及14484T〉C)中的部分或全部進(jìn)行檢測(cè)，而不針對(duì)罕見 突變或繼發(fā)性突變進(jìn)行檢測(cè)，在運(yùn)用上仍有一定的局限性。
基因芯片是近年來(lái)迅速發(fā)展起來(lái)的集物理學(xué)、化學(xué)、材料科學(xué)和生命科學(xué)于一體的高新 技術(shù)，利用微電子芯片技術(shù)的集約化和平行處理原理，將大量具有生物學(xué)意義的特殊序列 的生物樣品有序地固化在玻璃片和硅片等基質(zhì)表面，并利用微量反應(yīng)體積， 一次雜交就可 以對(duì)許多基因表達(dá)水平、突變和多態(tài)性進(jìn)行特異、快速、精確檢測(cè)，己經(jīng)在基因表達(dá)、基 因突變、基因多態(tài)性研究和基因診斷等領(lǐng)域獲得成功應(yīng)用。由于基因芯片具有這些獨(dú)特的 優(yōu)點(diǎn)使其在線粒體基因檢測(cè)方面得到一定的運(yùn)用，如利用表達(dá)譜微陣列對(duì)線粒體基因的表 達(dá)狀況進(jìn)行檢測(cè)，來(lái)探討線粒體病的發(fā)病機(jī)制，或利用寡核苷酸微陣列上的引物延伸反應(yīng) 或直接核酸雜交檢測(cè)線粒體單核苷酸多肽性(SNP)等。
由于與LH0N相關(guān)的mtDNA突變位點(diǎn)數(shù)量較多，常規(guī)基因診斷方法已經(jīng)難以滿足要求， 因而，研發(fā)一種新型基因芯片，用于對(duì)LHON相關(guān)mtDNA突變位點(diǎn)的集成檢測(cè)，無(wú)疑具有潛 在的社會(huì)效益和臨床價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于提供一種Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變相關(guān)mtDNA突變位點(diǎn)集成檢 測(cè)基因芯片及其制作方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種上述Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變相關(guān)mtDNA突變位點(diǎn) 集成檢測(cè)基因芯片的使用方法。
本發(fā)明的構(gòu)思如下
建立一種檢測(cè)Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變相關(guān)32個(gè)突變位點(diǎn)的基因芯片。該基因芯片 包括檢測(cè)系統(tǒng)和監(jiān)控系統(tǒng)。檢測(cè)系統(tǒng)根據(jù)MITOMAP數(shù)據(jù)庫(kù)(hUp:〃麗w.mitomap.org)報(bào)道 的32個(gè)與Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變相關(guān)的線粒體DNA (mtDNA)突變位點(diǎn)，設(shè)計(jì)相應(yīng)的位點(diǎn) 特異性寡核苷酸探針，利用氨基與醛基的共價(jià)結(jié)合將寡核苷酸探針固定在芯片表面，探針 與熒光標(biāo)記的樣本PCR擴(kuò)增產(chǎn)物雜交，根據(jù)雜交信號(hào)可判斷有無(wú)突變發(fā)生及突變類型。監(jiān) 測(cè)系統(tǒng)與檢測(cè)系統(tǒng)位于同一陣列，包括陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和平行對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照為檢測(cè) 系統(tǒng)各探針的等量混合物，陰性探針為點(diǎn)樣液，平行對(duì)照為東亞人常見的mtDNA U719G〉A(chǔ) 單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)探針，可以根據(jù)監(jiān)控系統(tǒng)來(lái)判斷雜交的質(zhì)量。
具體來(lái)說(shuō)，根據(jù)修正版劍橋mtDNA參考序列(revised Cambridge Reference Sequence, rCRS)和MITOMAP數(shù)據(jù)庫(kù)(http:〃www. mitomap. org)報(bào)道的32種與Leber氏遺傳性視神經(jīng) 病變相關(guān)的mtDNA點(diǎn)突變(分別為:T3394C、 G3460A、 G3635A、 G3733A、 A4136G、 T4160C、 C4171A、 T4216C、 A4435G、 C4640A、 A4917G、 G5244A、 G7444A、 G9738T、 G9804A、 T10663C、 G11696A、 G11778A、 G13708A、 G13730A、 G14459A、 C14484A、 A14495G、 T14498C、 A14495G、 T14498C、 C14568T、 A14596T、 A14693G、 G15257A、 G15812A、 A15951G)和東亞人常見的mtDNA 11719G〉A(chǔ)多態(tài)性位點(diǎn)，共設(shè)計(jì)了 33對(duì)探針(其中32對(duì)探針針對(duì)32個(gè)Leber氏遺傳性視神 經(jīng)病變相關(guān)突變位點(diǎn)，1對(duì)探針針對(duì)11719G〉A(chǔ)多態(tài)性位點(diǎn))和11對(duì)PCR引物。11對(duì)引物 分成三組在同一熱循環(huán)下進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，能特異地?cái)U(kuò)增出包含上述32個(gè)Leber氏遺傳 性視神經(jīng)病變相關(guān)mtDNA突變位點(diǎn)和11719G〉A(chǔ)多態(tài)性位點(diǎn)的目的DNA片段。在一張芯片上 固定上述33對(duì)探針，只用一次PCR和一次雜交反應(yīng)，就可以在6—8小時(shí)及時(shí)準(zhǔn)確地確認(rèn) 被檢者是否存在上述突變位點(diǎn)，.從而為治療和遺傳學(xué)咨詢提供確鑿證據(jù)，并可以進(jìn)一步闡 明這些突變位點(diǎn)在中國(guó)人群中的分布及其對(duì)病因、發(fā)病機(jī)理、臨床治療及預(yù)后的影響。
本發(fā)明一方面公開了一種Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變相關(guān)mtDNA突變位點(diǎn)集成檢測(cè)基因 芯片，在基因芯片載體表面點(diǎn)陣固定有與Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變相關(guān)的mtDNA突變位 點(diǎn)的特異性寡核苷酸探針和mtDNA 11719G〉A(chǔ)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的特異性寡核苷酸探針。
6上述特異性寡核苷酸探針的設(shè)計(jì)原則為根據(jù)MITOMAP數(shù)據(jù)庫(kù)報(bào)道的32種LHON相關(guān) mtDNA突變位點(diǎn)和11719G〉A(chǔ)多態(tài)性位點(diǎn)，參考修正版劍橋mtDNA參考序列(revised Cambridge Reference Sequence, rCRS)，使不同探針的Tm值盡量位于(45±5) °C，使探 針長(zhǎng)度位于14-20 bp，使每對(duì)探針?biāo)鶛z測(cè)的基因位點(diǎn)位于探針序列中部或中部附近，使探 針與相應(yīng)單鏈靶基因的結(jié)合部位盡量靠近單鏈靶基因的5'端至中部區(qū)域之間以保障雜交 效率。特異性寡核苷酸探針可特異性識(shí)別Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變相關(guān)的mtDNA突變位 點(diǎn)和11719G〉A(chǔ)多態(tài)性位點(diǎn)。
上述特異性寡核苷酸探針選自序列為SEQ ID NO. 1 65的寡核苷酸探針中的一個(gè)或多個(gè)。
較佳的，基因芯片載體表面點(diǎn)陣固定有序列為SEQ ID NO. 1 65的寡核苷酸探針，該 芯片可用于特異檢測(cè)LHON相關(guān)的mtDNA突變和11719G〉A(chǔ)多態(tài)性位點(diǎn)。
優(yōu)選的，上述寡核苷酸探針的5'端有氨基修飾基團(tuán)，以便與醛基修飾芯片相結(jié)合，探 針5'端加上一段15聚的Poly T，以減少雜交時(shí)的空間位阻。
上述基因芯片還可固定有陰性對(duì)照及陽(yáng)性對(duì)照。陰性對(duì)照為點(diǎn)樣液，陽(yáng)性對(duì)照為所選的 各寡核苷酸探針的等量混合液。
上述基因芯片載體可以為載玻片，優(yōu)選醛基修飾的載玻片。
本發(fā)明第二方面，公開了上述Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變相關(guān)mtDNA突變位點(diǎn)集成檢測(cè) 基因芯片的制備方法，包括下列步驟
將選自序列為SEQ ID NO. 1 65的寡核苷酸探針5'端加上一段15聚的Poly T,并對(duì) 5'端進(jìn)行氨基修飾，用去離子水將各探針?lè)謩e稀釋，并分別與點(diǎn)樣液等體積混合，獲得終 濃度為12.5 50 uM的寡核苷酸探針溶液，采用常規(guī)的方法將寡核苷酸探針溶液與陰性對(duì) 照和陽(yáng)性對(duì)照一起點(diǎn)陣于載玻片表面并固定。
上述點(diǎn)樣液的作用在于優(yōu)化芯片制作的質(zhì)量，可選用各種市售或自行配置的點(diǎn)樣液。
本發(fā)明的第三方面，公開了上述Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變相關(guān)mtDNA突變位點(diǎn)集成檢 測(cè)基因芯片的使用方法，包括下列步驟
1) 收集患者外周血，抽取樣本DNA;
2) 樣本DNA的PCR擴(kuò)增和標(biāo)記以樣本DNA為模板，選擇合適引物PCR擴(kuò)增并標(biāo)記待 測(cè)的突變相關(guān)序列；
3) 采用前述基因芯片于樣本PCR產(chǎn)物變性后進(jìn)行雜交檢測(cè)將樣本PCR擴(kuò)增產(chǎn)物等體
7積混合后，與適量體積雜交液混合(如將樣本PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與雜交液以1: 2 1: l的體積 比混合)，將與雜交液混勻后的PCR產(chǎn)物變性，取適量體積滴在芯片的點(diǎn)陣區(qū)進(jìn)行雜交，雜 交后用洗液洗滌，再檢測(cè)標(biāo)記信號(hào)的強(qiáng)度。通過(guò)檢測(cè)標(biāo)記信號(hào)的強(qiáng)度比對(duì)，可判斷是否發(fā) 生相應(yīng)突變。
上述雜交液為常規(guī)用于核酸雜交反應(yīng)的雜交液，可選用各種市售或自行配置的雜交液。
上述雜交液溶解后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物變性可采用常規(guī)的變性方法，如95'C變性。 洗液用于將未完全匹配的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物從芯片上除去，可選用本領(lǐng)域常規(guī)的用于核酸雜 交的洗液。
較佳的，上述步驟3中，雜交溫度為35-40。C;雜交時(shí)間為30-60分鐘。
洗液洗滌時(shí)，先用一次洗液洗5-15分鐘，再用二次洗液洗5-15分鐘。優(yōu)選的， 一次洗 液為2xSSC+0. lw%SDS (以洗液總重量為基礎(chǔ)計(jì))；二次洗液為0. 2xSSC+0. lw%SDS ; —次 洗脫條件為30'C洗滌IO分鐘；二次洗脫條件為3(TC洗滌5分鐘。
改進(jìn)的，上述步驟2中的引物選自序列為SEQ ID N0.66 87的核苷酸序列。每對(duì)正反 引物中，至少有一個(gè)被標(biāo)記，標(biāo)記可采用常規(guī)的標(biāo)記，如熒光標(biāo)記等，本發(fā)明實(shí)施例中使 用了 Cy5熒光分子標(biāo)記，并使用激光共聚集掃描儀掃描熒光信號(hào)強(qiáng)度。
更佳的，上述步驟2中的PCR擴(kuò)增為多重PCR擴(kuò)增將序列為ID NO. 66 71、 ID NO. 72 79、 IDN0.80 87的核苷酸序列分別作為三組多重PCR的引物，在同一熱循環(huán)下以樣本DNA 為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
本發(fā)明的第四方面，公開了上述檢測(cè)Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變相關(guān)mtDNA突變位點(diǎn)集 成檢測(cè)基因芯片在制備Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變相關(guān)mtDNA突變位點(diǎn)的檢測(cè)試劑盒中的 應(yīng)用。
本發(fā)明第五方面，公開了一種Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變相關(guān)mtDNA突變位點(diǎn)的檢測(cè)試 劑盒，包括上述基因芯片，及Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變相關(guān)mtDNA突變位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增 引物。
較佳的，上述Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變相關(guān)mtDNA突變位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增引物為選自序 列為SEQ ID NO. 66 87的核苷酸序列中的一個(gè)或多個(gè)。
優(yōu)選的，上述Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變相關(guān)mtDNA突變位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增引物為SEQ ID N0.66 87的核苷酸序列。各引物可分別獨(dú)立包裝。
試劑盒中還可包括其他在試劑盒使用過(guò)程中需用到的常規(guī)試劑，如雜交液、核酸雜交洗 液等。較佳的，上述洗液包括一次洗液和二次洗液，其中一次洗液為2xSSC+0. lw%SDS; 二次洗液為0. 2xSSC + 0. lw%xSDS。
本發(fā)明的基因芯片可用于檢測(cè)Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變相關(guān)的mtDNA突變位點(diǎn)，可一 次同時(shí)檢測(cè)32種mtDNA突變位點(diǎn)。優(yōu)選方案僅需1次PCR擴(kuò)增和1次雜交反應(yīng)，即可特異 性檢測(cè)臨床樣本中32種與Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變相關(guān)的突變位點(diǎn)。本發(fā)明的基因芯片 具有省時(shí)、費(fèi)用低廉和操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，從樣本制備到PCR擴(kuò)增，得到檢測(cè)結(jié)果，可在6 一8小時(shí)內(nèi)完成，大大縮短了對(duì)患者的診斷時(shí)間，可以對(duì)臨床上疑似Leber氏遺傳性視神經(jīng) 病變患者的mtDNA進(jìn)行初步篩查，以確定有無(wú)已知突變體，從而為疾病的治療或遺傳學(xué)咨 詢提供一定的線索，具有較好的臨床推廣價(jià)值。本發(fā)明的基因芯片還具有很高的靈敏度和 特異性，與傳統(tǒng)分子生物學(xué)方法相比，檢測(cè)時(shí)間大大縮短，達(dá)到LHON臨床診斷與鑒別診斷 的目的。


圖l芯片點(diǎn)樣布陣圖，P為陽(yáng)性對(duì)照，成份為SEQ ID NO. 1 65探針的等量混合物，N為 陰性對(duì)照，成份為點(diǎn)樣液。
圖2 P卜11778G〉A(chǔ)均質(zhì)性突變體芯片檢測(cè)與DM測(cè)序結(jié)果
圖3 P2-11778G〉A(chǔ)異質(zhì)性突變體芯片檢測(cè)與DNA測(cè)序結(jié)果
圖4 P3-3460G〉A(chǔ)和3394T>C均質(zhì)性突變體芯片檢測(cè)與DNA測(cè)序結(jié)果
圖5 P4-14484T>C均質(zhì)性突變體芯片檢測(cè)與DNA測(cè)序結(jié)果
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而非限制 本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法及未說(shuō)明配方的試劑均為按照常 規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆試驗(yàn)手冊(cè)(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件或者制造商建議的條件進(jìn)行或配置。
實(shí)施例1 探針設(shè)計(jì)和芯片的制備 (1)芯片上探針的設(shè)計(jì) 根據(jù)MIT0MAP數(shù)據(jù)庫(kù)報(bào)道的32種LHON相關(guān)mtDNA突變位點(diǎn)和11719G〉A(chǔ)多態(tài)性位點(diǎn)， 參考修正版劍橋ratDNA參考序列(revised Cambridge Reference Sequence, rCRS)，設(shè)計(jì)并篩選獲得33對(duì)寡核苷酸探針，使不同探針的Tm值盡量位于(45±5) 'C，使探針長(zhǎng)度位 于14-20 bp，使每對(duì)探針?biāo)鶛z測(cè)的基因位點(diǎn)位于探針序列中部或中部附近，使探針與相應(yīng) 單鏈靶基因的結(jié)合部位盡量靠近單鏈靶基因的5'端至中部區(qū)域之間以保障雜交效率。探針 的5'端有氨基修飾基團(tuán)，以便與醛基修飾芯片相結(jié)合；不同探針的綜合參數(shù)(探針長(zhǎng)度、 GCX及Tm值)盡量接近，為了減少雜交時(shí)的空間位阻，合成時(shí)，在33對(duì)探針的寡核苷酸 5'端加上一段15聚的Poly T (連接臂)。陽(yáng)性對(duì)照探針選取各個(gè)探針的等量混合物，陰性 對(duì)照探針選取點(diǎn)樣液。檢測(cè)系統(tǒng)和平行對(duì)照的33對(duì)探針如表1所列
表1檢測(cè)系統(tǒng)和平行對(duì)照氨基修飾探針
探針名稱 SEQ ID NO.探針序列(5， 一3')
3394T1ATTCTAGGCTATATACAACT
3394C2ATTCTAGGCCATATACAAC
3460G3GTTTTATGGCGTCAGCG
3460A4AGTTTTATGGTGTCAGCGA
3635G5ACCTCTAGCCTAGCC
3635A6ACCTCTAACCTAGCC
3733G7TCTCATATGAAGTCACC
3733A8TCTCATATAAAGTCACC
4136A9TCGGGGGTATGCTGT
4136G10TCGGGGGCATGCTG
4160T11GGTGTATGAGTTGGTC
4160C12GGTGTATGGGTTGGT
4171C13TTTTTCATAGGAGGTG
4171A14TTTTTCATATGAGGTG
4216T15TGGAGACATATCATATAAG
4216C16TGGAGACATGTCATATAAG
4435A17TTCGGGGTATGGGC
4435G18TTCGGGGCATGGGC
4640C19GCTGCCATCAAGTATT
4640A20GCTGCCATAAAGTATT4917 A21CCTCACTAAACGTAAG
4917 G22CCTCACTAGACGTAAG
5244 G23GCTAACCGGCTT
5244 A24GCTAACCAGCTTTTT
7444 G25CTTTTTTGTCTAGATTT
7444 A26CTTTGTTTAGATTT
9738 G27CCTACAAGCCTCAGA
9738 T28CCTACAATCCTCAGA
9804 G29TTTTGTAGCCACAGG
9804 A30TTTTGTAACCACAGG
10663 T31CGGCAAAGACTAGTAT
10663 C32CGGCAAAGGCTAGTA
11696 G33TGAGAATGACTGCGC
11696 A34TGAGAATGATTGCGC
11719 G35GATGTAAGCCCGTGG
11719 A36GATGTAAGTCCGTGG
11778 G37TATGATGCGACTGTG
11778 A38TTATGATGTGACTGTG
13708 G39AACGCCTGGCAGCC
13708 A40AACGCCTGACAGCC
13730 G41TCGCAGGATTTCTCA
13730 A42TCGCAGAATTTCTCA
14459 G43TACTACAGCGATGGC
14459 A44TACTACAGTGATGGC
14482 C45GGAATGATGGTTGTCT
14482 A46GGAATGATTGTTGTCT
14482 G47GGAATGATCGTTGTC T14484 T48GGGAATGATGGTTGT
14484 C49GGGAATGGTGGTTG
1114495A50AATTTATTTAGGGGGA
14495G51AATTTATTCAGGGGGA
14498T52TTTAATTTATTTAGGGG
14498C53TTTAATTTGTTTAGGGG
14568C54TGTTAGCGGTGTGGT
14568T55TGTTAGCAGTGTGGT
14596A56CCTTCTCCTATTTATGGG
14596T57CCTTCTCCTATATATGGG
14693A58GTCGTGGTTGTAGTC
14693G59GTCGTGGCTGTAGTC
15257G60ACTCAGTAGACAGTCCC
15257A61ACTCAGTAAACAGTCCC
15812G62TAGCATCCGTACTATAC
15812A63TAGCATCCATACTATAC
15951A64TTCCAAGGACAAATC
15951G65TTCCAAGGGCAAATC
(2)芯片的制備
點(diǎn)樣液為Micro-Spotting Solution (2X)，購(gòu)自TeleChem Internation公司，室 溫保存。
探針由Takara公司負(fù)責(zé)合成，用去離子水將探針稀釋，并與點(diǎn)樣液等體積混合，使探 針終濃度為12.5uM，通過(guò)Cartesian Tech. ， PROSYS 5510A芯片制作系統(tǒng)點(diǎn)陣于醛基修飾 的載玻片表面，檢測(cè)系統(tǒng)和平行對(duì)照的每個(gè)探針平行點(diǎn)3個(gè)點(diǎn)，置于70%的相對(duì)濕度、室 溫條件下48-72小時(shí)進(jìn)行固定。取出后于沸水浴中30秒，空氣中充分干燥，4'C保存，即 制成了檢測(cè)Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變32種相關(guān)突變的基因芯片，芯片點(diǎn)樣布陣圖見圖1。
實(shí)施例2 樣本的突變檢測(cè) (1)樣本的制備、標(biāo)記和處理 用Qiagen公司DNA抽提試劑盒提取Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變患者或疑似患者樣本
12DNA，備用。
樣本的PCR擴(kuò)增和標(biāo)記處理在同一熱循環(huán)下，通過(guò)三組多重PCR(將序列為ID NO. 66 71、 ID NO. 72 79、 ID NO. 80 87的核苷酸序列分別作為三組多重PCR的引物)來(lái)擴(kuò)增11 條靶基因，這11條靶基因涵蓋與Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變相關(guān)的32個(gè)rnt潔A突變位點(diǎn) 和11719G〉A(chǔ)多態(tài)性位點(diǎn)。在25ul PCR反應(yīng)體系中(擴(kuò)增體系包括2. 5 ul 10*PCR buffer, 各200 uM的dATP、 dGTP、 dCTP、 dTTP， 1. 5mM MgCl" 1. 5U DNA TagE (Takara),和介于 0.05-0. 5 uM之間不等的引物，每個(gè)反應(yīng)中加入100 ng樣本DNA，通過(guò)以下熱循環(huán)過(guò)程制 備11條熒光標(biāo)記的樣本DNA目的片段首先在94。C變性5min，以94。C， 35s， 61°C, 55s ， 72°C， 90s循環(huán)35次，最后在72。C延伸10min。上述PCR引物由Takara公司合成，其中， 每對(duì)正向引物和反向引物中至少有一條引物的5'端加cy5熒光分子標(biāo)記，引物序列如表2 所列。
表2 PCR引物
引物名稱 SEQ ID NO.引物序列(5， 一3')
PI--F66CAG CCGCTATTA AAGGTTCGT
PI--R67TGG CAGGAGTAA TCAGAGGTG
P2--F68TCT TCAATCAGC CACATAGCC
P2--R69TCT CGGTAAATA AGGGGTCGT
P3--F70ACC AATCCTACC TCCATCG
PS--R71CCA AGGAGTGAG CCGAAGT
PI-F72TAG AAGAACCCT CCATAAACCTG
P4--R73TA GCG TCT TGT AGA CCT ACT TGCP5--F74ACA CCCACTCCC TCTTAGCC
P5--R75GTT GGGACGATT AGTTTTAGCA
P6--F76CGT CCTTGCCCT ATTACTATCC
P6--R77TTG GGTGCTAAT GGTGGAGT
P7--F78GAC CCTACTTCT AACCTCCCTG
P7--R79CAC CTCAACTGC CTGCTATG
P8--F80GCA CCACGACCC TACTACTATC
13P8-R 81 GGG ATG ATG AGG CTA TTG TTT
P9-F 82 CGA AAC CAA ATA ATT CAA GCA C
P9-R 83 GAA AGT TGA GCC AAT AAT GAC G
P10-F 84 CAA ACG CCT GAG CCC TAT C
PIO-R 85 GAA TCC GAG TAT GTT GGA GAA AT
Pll-F 86 CAT CGG CAT TAT CCT CCT G
Pll-R 87 GTT GTT TGA TCC CGT TTC G
注F表示正向引物，R表示反向引物。
從三組多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中分別取10yl，與30ul雜交液混勻，作為芯片雜交用靶基因。
(2)雜交反應(yīng)和信號(hào)檢測(cè) 取實(shí)施例2步驟(l)的芯片雜交用靶基因15ul， 95。C變性10min，迅速冰浴3-5 min， 取lOul變性后的芯片雜交靶基因滴于實(shí)施例1制備的檢測(cè)Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變32 種相關(guān)突變的基因芯片表面的點(diǎn)陣區(qū)域，蓋上蓋玻片，置于37。C濕盒中雜交45min，然后 30。C于洗液l (2XSSC， 0. P/。SDS)中蕩洗10min，再于洗液2 (0.2XSSC， 0.1°/。SDS)中蕩洗 5min，氮?dú)獯蹈?。用激光共聚集掃描儀(GenePix4000B，Axon Instruments, Inc.)在635咖處 掃描前述洗脫并干燥后的雜交芯片，掃描強(qiáng)度設(shè)為700 (最大為920);通過(guò)圈點(diǎn)過(guò)濾背景 信號(hào)，提取各點(diǎn)平均熒光信號(hào)強(qiáng)度值。配合其配套軟件分析，最終獲得芯片檢測(cè)結(jié)果。以 診斷比值(野生型探針信號(hào)強(qiáng)度平均值與相應(yīng)位點(diǎn)突變型探針信號(hào)強(qiáng)度平均值的比值)作 為分析突變是否存在的標(biāo)準(zhǔn)，如果診斷比值在3以上為野生型，在0.3以下為均質(zhì)性突變， 介于0.3和3之間為異質(zhì)性突變。(比值衡量標(biāo)準(zhǔn)參考Du W， Marsac C， Kruschina M, Ortigao F， Florentz C. Functionalized self-assembled monolayer on gold for detection of human mitochondrial tRNA gene mutations. Anal Biochem， 2003， 322(1): 14-25獲得)
用實(shí)施例1制備的檢測(cè)Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變32種相關(guān)突變的基因芯片分別對(duì)20 例健康對(duì)照和12例Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變患者按上述方法進(jìn)行檢測(cè)各健康對(duì)照均未 檢測(cè)到32種相關(guān)突變；12例患孝中8例檢測(cè)到11W8G〉A(chǔ)均質(zhì)性突變，1例檢測(cè)到11"8G〉A(chǔ) 異質(zhì)性突變，1例同時(shí)檢測(cè)到3460G〉A(chǔ)和3394T〉C均質(zhì)性突變，1例檢測(cè)到14484T>C均質(zhì) 性突變；所有健康對(duì)照和患者均檢測(cè)到11719G〉A(chǔ)單核苷酸多態(tài)性。芯片檢測(cè)結(jié)果與DNA測(cè) 序結(jié)果完全吻合。
144例含不同突變體患者樣本芯片掃描圖示例和相應(yīng)突變位點(diǎn)DNA測(cè)序結(jié)果如圖2-5所 示，對(duì)應(yīng)位點(diǎn)的芯片診斷比值如表3所列
表3突變?cè)\斷比值
mtDNA突變位點(diǎn)Pl (w/m)P2(w/m)P3(w/m)P4(w/m)
3394T>C4. 23. 4。.763. 2
3460G〉A(chǔ)3. 74. 3。J3. 5
3635G>A18341114
3733G>A66452455
4136A>G12145. 613
4160T〉C8. 57. 75.47. 5
4171C>A33361724
4216T〉C9.5117.49.2
4435A〉G9. 5265. 67. 7
4640OA14234. 09. 3
4917A〉G13186. 148
5244G〉A(chǔ)49482048
7444G〉A(chǔ)11104.332
9738G〉T62331964
9804G>A614813147
10663T>C8.98.74,411
11696G〉A(chǔ)17161029
11719G〉A(chǔ)0. 060. 040. 120. 06
11778G〉A(chǔ)ft "7. 77. 513
13708G〉A(chǔ)9. 1101315
13730G〉A(chǔ)786629132
14459G〉A(chǔ)28191647
144820A63482311
144820G13883339. 5
14484T〉C138.47.3。.似
14495A〉G4. 47.73.913
14498T>C3. 58.33.210
14568C〉T463915156
14596A〉T12141619
151柳3A〉G 21 24 9.7 128
15257G>A 64 34 22 394
15812G>A 26 26 13 94
15951A>G 5.9 6.4 5.0 20
w/m指野生型探針熒光信號(hào)強(qiáng)度平均值與相應(yīng)位點(diǎn)突變。 實(shí)施例3試劑盒的組裝
按實(shí)施例1制備基因芯片，將實(shí)施例2記載的SEQ ID NO. 66 87的PCR引物分裝，與制得 的基因芯片、雜交液、核酸雜交洗液組配后包裝制得試劑盒。序列表
<110〉安徽醫(yī)科大學(xué)中國(guó)科學(xué)院上海微系統(tǒng)與信息技術(shù)研究所
<120〉 Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變相關(guān)mtDNA突變位點(diǎn)集成檢測(cè)基因芯片及其制備與應(yīng)用
<130> PCNWX081297
<160> 87
<170〉 Patentln version 3. 1
〈210〉 1
<211〉 20
〈212〉 腿
<213> artificial sequence <220>
<223>探針
<■> 1
attctaggct atatacaact 20
<210〉 2
<211> 19
<212〉 腿
<213> artificial sequence <220>
〈223>探針
〈400> 2
attctaggcc atatacaac 19
<210> 3
〈211〉 17
<212> DNA
<213> artificial sequence〈220〉
〈223〉 探針 〈400> 3
gttttatggc gtcagcg 17
<210> 4
〈211〉 19
〈212〉 腿
〈213〉 artificial sequence <220〉
〈223〉探針
〈400> 4
agttttatgg tgtcagcga 18
〈210〉 5
〈211〉 15
<212> DNA
〈213〉 artificial sequence <220>
〈223〉探針
<400> 5
acctctagcc tagcc 15
〈210〉 6
〈211〉 15
<212> DNA
〈213> artificial sequence 〈220〉
〈223〉 探針
〈400〉 6
18tagcc 15
〈210〉 7
〈211〉 17
〈212〉 DNA
〈213〉 artificial sequence 〈220〉
<223〉 探針
〈400> 7
tctcatatga agtcacc 17
〈210〉 8
〈211〉 17
〈212〉 DNA
〈213〉 artificial sequence <220〉
〈223〉探針
〈400〉 8
tctcatataa agtcacc 17
〈210〉 9
<211> 15
〈212〉 DNA
〈213〉 artificial sequence 〈220〉
〈223〉 探針
〈400〉 9
tcgggggtat gctgt 15
〈210〉 10〈211> 14
〈212> DNA
<213〉 artificial sequence 〈220〉
〈223〉 探針
〈400> 10
tcgggggcat gctg 14
<210〉 11
<211> 16
〈212〉 DNA
〈213〉 artificial sequence 〈220>
〈223〉 探針
〈400〉 11 ggtgtatgag ttggtc
〈210〉 12
〈211〉 15
<212〉 DNA
〈213〉 artificial sequence 〈220〉
〈223〉探針
〈400〉 12 ggtgtatggg ttggt
<210> 13
〈211〉 16
<212〉 DNA
〈213〉 artificial sequence<220>
<223> 探針 <400〉 13
tttttcatag gaggtg 16
〈210> 14
〈211〉 16
<212〉 DNA
〈213〉 artificial sequence 〈220〉
〈223〉 探針
〈400〉 14
tttttcatat gaggtg 16
〈210> 15
〈211> 19
〈212〉 DNA
〈213> artificial sequence 〈220〉
〈223〉探針
<400> 15
tggagacata tcatataag 19
〈210〉 16
〈211〉 19
〈212> 腿
<213> artificial sequence 〈220>
<223〉 探針
〈400〉 16
21tggagacatg tcatataag 19
<210〉 17
<211〉 14
〈212〉 ■
〈213〉 artificial sequence 〈220〉
〈223〉探針
〈400〉 17
ttcggggtat gggc 14
〈210〉 18
〈211〉 14
〈212〉 腿
〈213> artificial sequence 〈220〉
〈223〉 探針
<400〉 18
ttcggggcat gggc 14
〈210〉 19
〈211〉 16
〈212〉 DNA
〈213〉 artificial sequence 〈220〉
〈223〉 探針
<400> 19
gctgccatca agtatt 16
〈210〉 20
22<formula>formula see original document page 23</formula>〈220>
〈223> 探針 〈400〉 23
gctaaccggc ttttt 15
<210〉 24
〈211> 15
〈212〉 廳
<213〉 artificial sequence 〈220〉
<223> 探針
〈400〉 24
gctaaccagc ttttt 15
〈210〉 25
〈211〉 17
〈212〉 DNA
<213〉 artificial sequence 〈220〉
<223>探針
〈400> 25
cttttttgtc tagattt 17
〈210〉 26
<211> 17
<212〉 腿
<213〉 artificial sequence 〈220>
<223〉 探針
〈400〉 26
24cttttttgtt tagattt 17
〈210> 27
〈211〉 15
<212〉 DNA
<213> artificial sequence 〈220〉
<223> 探針
〈400〉 27
cctacaagcc tcaga 15
〈210〉 28
〈211〉 15
<212〉 DNA
<213〉 artificial sequence 〈220>
〈223>探針
<400〉 28
cctacaatcc tcaga 15
〈210〉 29
<211〉 15
〈212〉 DNA
〈213> artificial sequence 〈220〉
<223>探針
〈400〉 29
ttttgtagcc acagg 15
〈210〉 30
25<211> 15
〈212〉 DNA
〈213〉 artificial sequence 〈220〉
〈223> 探針
〈400〉 30
ttttgtaacc acagg 15
〈210〉 31
〈211> 16
<212> 腿
<213〉 artificial sequence 〈220〉
<223〉 探針
〈400〉 31 cggcaaagac tagtat
〈210> 32
<211〉 15
<212> 腿
<213〉 artificial sequence 〈220〉
<223> 探針
< 32 cggcaaaggc tagta
<210〉 33
<211〉 15
〈212〉 DNA
〈213> artificial sequence
26<220〉
〈223> 探針
<400〉 33 tgagaatgac tgcgc
<210〉 34
〈211> 15
〈212〉 DNA
〈213> artificial sequence 〈220〉
〈223〉 探針
〈400> 34 tgagaatgat tgcgc
〈210〉 35
<211> 15
〈212〉 DNA
<213> artificial sequence 〈220>
<223〉 探針
<400> 35 gatgtaagcc cgtgg
<210> 36
〈211〉 15
<212〉 DNA
<213〉 artificial sequence 〈220>
<223〉 探針
<400> 36
15
15
15
27〈210> 37
<211> 15
〈212> 纖
<213> artificial sequence <220〉
<223> 探針
<400> 37 tatgatgcga ctgtg
〈210〉 38
〈211〉 16
〈212〉 腿
〈213〉 artificial sequence 〈220〉
〈223〉 探針
〈400〉 38 ttatgatgtg actgtg
〈210〉 39
<211> 14
〈212> 廳
〈213〉 artificial sequence <220>
<223> 探針
〈400〉 39 aacgcctggc agcc
〈210〉 40
15
15
16
14
28<211> 14
<212〉 DNA
〈213> artificial sequence 〈220>
〈223〉 探針
<400> 40
aacgcctgac agcc 14
〈210〉 41
〈211〉 15
〈212〉 DNA
〈213〉 artificial sequence 〈220>
〈223〉探針
〈400〉 41
tcgcaggatt tctca 15
〈210〉 42
<211〉 15
〈212〉 腿
〈213〉 artificial sequence 〈220>
〈223〉探針
〈400> 42
tcgcagaatt tctca 15
〈210〉 43
〈211> 15
〈212〉 腿
〈213> artificial sequence<220〉
〈223〉 探針 〈400〉 43
tactacagcg atggc 15
〈210〉 44
〈211> 15
<212> ■
<213〉 artificial sequence 〈220〉
<223> 探針
〈400〉 44
tactacagtg atggc 15
〈210〉 45
〈211> 16
<212> DNA
<213> artificial sequence 〈220〉
〈223>探針
〈400〉 45
ggaatgatgg ttgtct 16
<210> 46
〈211〉 16
〈212> DNA
〈213〉 artificial sequence <220>
〈223> 探針
〈400〉 46ggaatgattg ttgtct
〈210〉 47
〈211〉 16
〈212〉 DNA
〈213〉 artificial sequence 〈220〉
〈223> 探針
〈400〉 47 ggaatgatcg ttgtct
〈210〉 48
〈211〉 15
〈212> DNA
〈213> artificial sequence 〈220〉
<223〉探針
〈400〉 48 gggaatgatg gttgt
〈210> 49
〈211〉 14
<212〉 腿
<213〉 artificial sequence 〈220〉
<223> 探針
〈400〉 49 gggaatggtg gttg
〈210〉 50
16
16
15
14
31<211> 16
<212> DNA
<213> artificial sequence 〈220〉
〈223〉 探針
〈400> 50
aatttattta ggggga 16
<210〉 51
<211〉 16
〈212〉 腿
〈213〉 artificial sequence 〈220〉
<223> 探針
〈400〉 51 aatttattca ggggga
〈210> 52
<211〉 17
<212> 腿
〈213〉 artificial sequence 〈220〉
〈223〉 探針
<400〉 52
tttaatttat ttagggg
<210> 53 <211> 17 〈212〉 DNA
〈213〉 artificial sequence<220〉
〈223〉 探針 〈400〉 53
tttaatttgt ttagggg 17
〈210〉 54
〈211〉 15
〈212> 腿
〈213〉 artificial sequence 〈220〉
〈223〉 探針
〈400〉 54
tgttagcggt gtggt 15
〈210〉 55
〈211〉 15
<212> DNA
〈213〉 artificial sequence <220>
〈223〉探針
〈400〉 55
tgttagcagt gtggt 15
〈210〉 56
〈211〉 19
〈212> DNA
<213> artificial sequence 〈220〉
<223〉 探針
<400> 56
33<formula>formula see original document page 34</formula><211> 17
〈212〉 DNA
<213> artificial sequence 〈220〉
〈223〉 探針
〈400〉 60
actcagtaga cagtccc 17
<210> 61
<211〉 17
〈212〉 DNA
<213〉 artificial sequence <220>
<223〉 探針
〈400〉 61
actcagtaaa cagtccc
〈210〉 62
<211〉 17
<212> DNA
〈213〉 artificial sequence <220〉
〈223> 探針
<400> 62
tagcatccgt actatac
〈210〉 63
<211> 17
〈212〉 ■
<213> artificial sequence〈220〉 ' 〈223〉 探針 〈400〉 63
tagcatccat actatac 17
〈210〉 64
〈211> 15
〈212> DNA
〈213> artificial sequence 〈220〉
〈223〉 探針
〈400〉 64 ttccaaggac aaatc
〈210〉 65
〈211〉 15
<212> 騰
〈213> artificial sequence <220〉
<223> 探針
〈400〉 65 ttccaagggc aaatc
〈210〉 66
<211〉 21
〈212> 腿
<213〉 artificial sequence 〈220〉
〈223〉 引物
〈400〉 66
36cagccgctat taaaggttcg t 21
〈210〉 67
<211〉 21
〈212〉 DNA
<213> artificial sequence 〈220>
〈223〉 引物
<400> 67
tggcaggagt aatc卿ggt g 21
〈210〉 68
〈211> 21
〈212〉 腿
<213〉 artificial sequence <220〉
〈223〉 引物
〈400〉 68
tcttcaatca gccacatagc c 21
〈210〉 69
〈211〉 21
〈212〉 廳
<213> artificial sequence <220〉
<223> 引物
〈400〉 69
tctcggtaaa taaggggtcg t 21
<210〉 70〈211〉 19
〈212〉 腿
<213> artificial sequence <220>
〈223〉 引物
〈400〉 70
accaatccta cctccatcg 19
〈210〉 71
〈211〉 19
<212〉 DNA
〈213〉 artificial sequence 〈220〉
<223> 引物
〈400〉 71
ccaaggagtg agccgaagt
〈210〉 72
<211〉 23
〈212〉 DNA
<213> artificial sequence 〈220〉
〈223〉 引物
〈400〉 72
tagaagaacc ctccataaac ctg
<210〉 73
〈211〉 23
〈212〉 DNA
〈213〉 artificial sequence
38〈220〉
<223〉 引物 〈400> 73
tagcgtcttg tagacctact tgc 23
〈210〉 74
〈211〉 20
〈212〉 DNA
〈213〉 artificial sequence 〈220〉
〈223〉 引物
〈400> 74
acacccactc cctcttagcc 20
〈210〉 75
〈211> 22
〈212> 腿
<213〉 artificial sequence 〈220〉
<223〉 引物
〈400〉 75
gttgggacga ttagttttag ca 22
〈210〉 76
〈211〉 22
〈212〉 腿
<213〉 artificial sequence 〈220〉
〈223〉 引物
<400〉 76
39cgtccttgcc ctattactat cc 22
〈210〉 77
〈211> 20
〈212〉 DNA
〈213〉 artificial sequence <220>
〈223〉 引物
〈400〉 77
ttgggtgcta atggtggagt 20
〈210〉 78
〈211> 22
〈212〉 畫
〈213> artificial sequence 〈220〉
〈223〉 引物
〈400〉 78
gaccctactt ctaacctccc tg 22
〈210〉 79
〈211〉 20
<212〉 DNA
〈213〉 artificial sequence <220>
〈223〉 引物
<400> 79
cacctcaact gcctgctatg 20
〈210〉 80
40說(shuō)明書第38/40頁(yè)
〈211〉 22
〈212〉 DNA
〈213〉 artificial sequence 〈220〉
〈223〉 引物
〈400〉 80
gcaccacgac cctactacta tc 22
〈210〉 81
<211〉 21
〈212〉 腿
〈213〉 artificial sequence <220〉
〈223〉 引物
〈400〉 81
gggatgatga ggctattgtt t 21
<210〉 82
〈211〉 22
<212> DNA
<213> artificial sequence 〈220〉
〈223〉 引物
〈400〉 82
cgaaaccaaa taattcaagc ac 22
〈210〉 83
〈211〉 22
〈212〉 畫
<213> artificial sequence
41<formula>formula see original document page 42</formula>catcggcatt atcctcctg 19
<210> 87
〈211〉 19
<212> DNA
<213〉 artificial sequence <220>
<223> 引物
〈400〉 87
gttgtttgat cccgtttcg 19
權(quán)利要求
1. 一種Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變相關(guān)mtDNA突變位點(diǎn)集成檢測(cè)基因芯片，其特征在于，在基因芯片載體表面點(diǎn)陣固定有與Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變相關(guān)的mtDNA突變位點(diǎn)的特異性寡核苷酸探針和mtDNA 11719G>A單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的特異性寡核苷酸探針。
2. 如權(quán)利要求1所述Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變相關(guān)mtDNA突變位點(diǎn)集成檢測(cè)基因芯片， 其特征在于，所述與Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變相關(guān)的mtDNA突變位點(diǎn)的特異性寡核苷 酸探針和mtDNA 11719G〉A(chǔ)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的特異性寡核苷酸探針選自序列為SEQ ID NO. 1 65的寡核苷酸探針中的一個(gè)或多個(gè)，且所述基因芯片上還固定有陰性對(duì)照及 陽(yáng)性對(duì)照，其中，陽(yáng)性對(duì)照為所選的各寡核苷酸探針的等量混合液。
3. 如權(quán)利要求1所述Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變相關(guān)mtDNA突變位點(diǎn)集成檢測(cè)基因芯片， 其特征在于，所述基因芯片載體表面點(diǎn)陣固定有序列為SEQ ID NO. 1 65的寡核苷酸 探針。
4. 如權(quán)利要求1-3中任一權(quán)利要求所述Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變相關(guān)mtDNA突變位點(diǎn)集 成檢測(cè)基因芯片，其特征在于，所述寡核苷酸探針的5'端有氨基修飾基團(tuán)，且探針5' 端有一段15聚的Poly T。
5. 如權(quán)利要求1-4中任一權(quán)利要求所述Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變相關(guān)mtDNA突變位點(diǎn)集 成檢測(cè)基因芯片的制備方法，包括下列步驟將選自序列為SEQ ID NO. 1 65的寡核苷酸探針5，端加上一段15聚的Poly T，并對(duì) 5'端進(jìn)行氨基修飾，用去離子水將各探針?lè)謩e稀釋，并分別與點(diǎn)樣液等體積混合，獲 得終濃度為12. 5 50 uM的寡核苷酸探針溶液，將寡核苷酸探針溶液與陰性對(duì)照和陽(yáng)性 對(duì)照一起點(diǎn)陣于載玻片表面并固定。
6. 如權(quán)利要求1-4中任一權(quán)利要求所述Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變相關(guān)mtDNA突變位點(diǎn)集 成檢測(cè)基因芯片的使用方法，包括下列步驟a) 收集患者外周血，抽取樣本DNA;b) 樣本DNA的PCR擴(kuò)增和標(biāo)記以樣本DNA為模板，PCR擴(kuò)增并標(biāo)記待測(cè)的突變相關(guān) 序列；c) 采用如權(quán)利要求1-4中任一權(quán)利要求所述Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變相關(guān)mtDNA突 變位點(diǎn)集成檢測(cè)基因芯片于樣本PCR產(chǎn)物變性后進(jìn)行雜交檢測(cè)將樣本PCR擴(kuò)增產(chǎn) 物等體積混合后，與適量體積雜交液混合，將與雜交液混勻后的PCR產(chǎn)物變性，滴 在芯片的點(diǎn)陣區(qū)進(jìn)行雜交，雜交后用洗液洗滌，再檢測(cè)標(biāo)記信號(hào)的強(qiáng)度。
7. 如權(quán)利要求6所述Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變相關(guān)mtDNA突變位點(diǎn)集成檢測(cè)基因芯片的 使用方法，其特征在于，所述步驟b中PCR擴(kuò)增引物選自序列為SEQ ID NO. 66 87的 核苷酸序列中的一個(gè)或多個(gè)，且每對(duì)正反引物中至少有一個(gè)被標(biāo)記。
8. 如權(quán)利要求7所述Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變相關(guān)mtDNA突變位點(diǎn)集成檢測(cè)基因芯片的 使用方法，其特征在于，所述步驟b的PCR擴(kuò)增為多重PCR擴(kuò)增將序列為IDN0.66 71、 ID N0.72 79、 ID NO. 80 87的核苷酸序列分別作為三組多重PCR的引物，在同 一熱循環(huán)下以樣本DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
9. 如權(quán)利要求1-4中任一權(quán)利要求所述Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變相關(guān)mtDNA突變位點(diǎn)集 成檢測(cè)基因芯片在制備Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變相關(guān)mtDNA突變位點(diǎn)的檢測(cè)試劑盒中 的應(yīng)用。
10. —種Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變相關(guān)mtDNA突變位點(diǎn)的檢測(cè)試劑盒，包括權(quán)利要求1_4 中任一權(quán)利要求所述Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變相關(guān)mtDNA突變位點(diǎn)集成檢測(cè)基因芯 片，和Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變相關(guān)mtDNA突變位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增引物。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因芯片，公開了一種Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變相關(guān)mtDNA突變位點(diǎn)集成檢測(cè)基因芯片及其制備與應(yīng)用，該基因芯片的載體表面點(diǎn)陣固定有與Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變相關(guān)的mtDNA突變位點(diǎn)的特異性寡核苷酸探針和mtDNA 11719G＞A單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的特異性寡核苷酸探針。本發(fā)明的基因芯片具有省時(shí)、費(fèi)用低廉和操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，僅需1次PCR擴(kuò)增和1次雜交反應(yīng)，即可特異性檢測(cè)臨床樣本中32種與Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變相關(guān)的突變位點(diǎn)。適用于Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變的基因診斷。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101497925SQ20081020477
公開日2009年8月5日 申請(qǐng)日期2008年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月17日
發(fā)明者張學(xué)軍, 曹慧敏, 杜衛(wèi)東, 趙建龍, 金慶輝, 剛 陳 申請(qǐng)人:安徽醫(yī)科大學(xué);中國(guó)科學(xué)院上海微系統(tǒng)與信息技術(shù)研究所