專(zhuān)利名稱(chēng)：Leber遺傳性視神經(jīng)病變線粒體DNA突變G10680A的快速檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種Leber遺傳性視神經(jīng)病變線粒體DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)突變G10680A的快速檢測(cè)方法，屬Leber遺傳性視神經(jīng)病研究技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
Leber 遺傳性視神經(jīng)病(Leber hereditary optic neuropathy, LHON ；MIM 535000)是經(jīng)典的線粒體遺傳性疾病，即該病為母系遺傳性疾病，主要由mtDNA的點(diǎn)突變引 起發(fā)病。LHON有兩大臨床特1、性別偏好，即男性青壯年是易發(fā)人群；2、不完全外顯現(xiàn)象， 即攜帶mtDNA原發(fā)突變的個(gè)體不一定發(fā)病。目前對(duì)于LHON的研究開(kāi)展較多，但是對(duì)于該病 的流行病學(xué)調(diào)查較少有報(bào)道，歐洲人群調(diào)查表明LHON人群頻率為1/50000-1/25000，而在 亞洲人群特別是我國(guó)未見(jiàn)流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)。超過(guò)95%的LHON患者攜帶mtDNA的三個(gè)原發(fā)突變G11778A、G3460A, T14484C之 一，少數(shù)患者會(huì)同時(shí)攜帶兩個(gè)原發(fā)突變。臨床上對(duì)LHON的診斷除依據(jù)典型的臨床癥狀和 家族遺傳史外，最終的確診還包括對(duì)原發(fā)突變的檢測(cè)。報(bào)道表明，在歐洲和我國(guó)LHON人群 中，三個(gè)常見(jiàn)原發(fā)突變的分布頻率具有較大差異，G11778A在國(guó)人LHON患者中的頻率高達(dá) 90%, G3460A的頻率只在左右，T14484C占到約9%的病人，而在歐洲LHON患者中，這 三個(gè)突變的頻率分別約為57%，20%和23%。臨床上除確診的LHON患者外，還存在大量的 疑似LHON患者，這些患者具有較典型的LHON臨床癥狀，有或缺乏家族母系遺傳史，不攜帶 三個(gè)常見(jiàn)原發(fā)突變。我們近期研究表明，在收集的16 例(疑似)LHON患者中，有843例 不攜帶三個(gè)常見(jiàn)的原發(fā)突變，同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)突變G3635A是我國(guó)LHON人群的一個(gè)稀有原 發(fā)突變，這也進(jìn)一步說(shuō)明我國(guó)LHON患者與歐洲LHON人群的mtDNA突變圖譜存在差異。針 對(duì)這些疑似LHON病例進(jìn)行研究，有望進(jìn)一步豐富國(guó)人LHON患者mtDNA的突變譜，為我國(guó) LHON疾病的遺傳咨詢和臨床診治提供依據(jù)。2009年，Yang等人報(bào)道了一個(gè)攜帶原發(fā)突變 T14484C的我國(guó)LHON大家系，該家系表現(xiàn)出完全外顯率，這提示除T14484C外，一定存在其 它的影響因素導(dǎo)致家系所有母系患者的發(fā)病，經(jīng)對(duì)先證者mtDNA全序列分析后發(fā)現(xiàn)，該家 系同時(shí)攜帶突變G10680A。該突變位于線粒體ND4L基因，在脊椎動(dòng)物中具有較高的保守性， 因此該突變很可能與T14484C協(xié)同作用，導(dǎo)致了該LHON家系完全臨床外顯。我們?cè)趯?duì)10 個(gè)無(wú)常見(jiàn)原發(fā)突變的國(guó)人LHON家系研究后，在一個(gè)家系中檢測(cè)到G10680A的存在。通過(guò)進(jìn) 化醫(yī)學(xué)分析方法，我們排除了其它mtDNA變異位點(diǎn)致病的可能性，同時(shí)未在檢索的來(lái)自一 般人群5000多例個(gè)體中發(fā)現(xiàn)該突變的存在，因此我們提出突變G10680A是該LHON家系發(fā) 病的致病因素。我們未發(fā)表的數(shù)據(jù)表明，突變G10680A在我國(guó)LHON患者中占有一定的比例 (約為0. 5% )，這些研究提示G10680A是國(guó)人LHON患者的一個(gè)稀有致病突變。由于目前缺乏對(duì)LHON的有效治療措施，因此通過(guò)分子遺傳學(xué)檢測(cè)對(duì)該病進(jìn)行遺 傳咨詢及臨床預(yù)防有著極其重要的作用。因此，對(duì)無(wú)原發(fā)突變Gl 1778A、G3460A、T14484C和 G3635A的LHON患者/家系進(jìn)行G10680A突變檢測(cè)，無(wú)疑對(duì)于該病的遺傳研究、遺傳咨詢和預(yù)防具有重要的意義。目前有很多檢測(cè)DNA突變的技術(shù)方法，如序列測(cè)定、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分 析(SSCP)、變性高效液相色譜(DHPLC)、及等位基因特異PCR。其中，等位基因特異 PCR(Allele-specific PCR, AS-PCR)方法操作簡(jiǎn)便、快速，所需實(shí)驗(yàn)器材簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)試劑經(jīng) 濟(jì)，因此該方法被廣泛的應(yīng)用于DNA突變或單核苷酸多態(tài)性(SNP)的檢測(cè)。等位基因特異 PCR的原理是將一條引物的3'末端堿基設(shè)計(jì)成特異的突變堿基，配合適當(dāng)?shù)姆聪蛞?，?突變的DNA因3 ‘末端與引物配對(duì)從而擴(kuò)增得到突變特異的PCR產(chǎn)物，而無(wú)突變的DNA模 板不能與突變特異性引物配對(duì)，因此不能擴(kuò)增得到PCR產(chǎn)物。通過(guò)常規(guī)的瓊脂糖電泳檢測(cè) PCR產(chǎn)物的有無(wú)，進(jìn)而來(lái)判斷檢測(cè)樣本DNA是否存在突變。經(jīng)文獻(xiàn)檢索，未見(jiàn)與本發(fā)明檢測(cè)突變位點(diǎn)相同的公開(kāi)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種快速、簡(jiǎn)易、經(jīng)濟(jì)的Leber遺傳性視神經(jīng)病變線粒體 DNA突變G10680A的快速檢測(cè)方法。本發(fā)明基于AS-PCR的原理，將突變特異的引物3'端第一位設(shè)計(jì)成A堿基(見(jiàn) 表1，L10680A)，用于擴(kuò)增突變型DNA;在引物3'端第二位引入一個(gè)錯(cuò)配堿基(堿基A突 變成堿基T，形成T/T錯(cuò)配)，增強(qiáng)引物對(duì)突變DNA模板擴(kuò)增的特異性；在mtDNA序列上遠(yuǎn) 離G10680A突變的區(qū)域，即包含4866-5461范圍，設(shè)計(jì)了一對(duì)內(nèi)參引物(見(jiàn)表1，L4887/ H5442)，用于監(jiān)測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系是否合適及反應(yīng)是否正常進(jìn)行擴(kuò)增。采用上述兩對(duì)引 物(L10680A/H10972和L4887/H544》，在一個(gè)PCR反應(yīng)中對(duì)待測(cè)標(biāo)本DNA樣品進(jìn)行擴(kuò)增。 無(wú)論檢測(cè)的標(biāo)本DNA是否含有G10680A突變，內(nèi)參引物L(fēng)4887/H5442都會(huì)擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物， 這樣就避免了由于PCR失敗而造成的突變G10680A假陰性的檢測(cè)結(jié)果。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊 脂糖電泳檢測(cè)，依據(jù)突變特異的電泳圖譜對(duì)G10680A突變進(jìn)行基因分型，實(shí)現(xiàn)基因突變的 方便快速檢測(cè)。由于線粒體DNA突變具有異質(zhì)性，即突變的與正常的mtDNA共存的現(xiàn)象，如果檢 測(cè)方法的靈敏度不夠高，則會(huì)在有突變異質(zhì)性的患者中不能檢測(cè)到突變，從而導(dǎo)致假陰性 結(jié)果。本發(fā)明通過(guò)將正常人與含有G10680A突變病人的DNA樣品按不同比例混合，進(jìn)行 AS-PCR，以檢測(cè)本技術(shù)方法的靈敏度，并提供本技術(shù)檢測(cè)到的最低水平的突變DNA的技術(shù)參數(shù)。本發(fā)明利用等位基因特異PCR(Allele-specific PCR, AS-PCR)方法檢測(cè)Leber遺 傳性視神經(jīng)病變線粒體DNA突變G10680A，具體步驟如下(I)DNA提取使用常規(guī)酚/氯仿法或試劑盒法從臨床樣本中提取基因組DNA。(2)以步驟(1)提取的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)引物擴(kuò)增引物序列及產(chǎn)物大小見(jiàn)表1表IAS-PCR所用引物組成、序列及產(chǎn)物大小引物名稱(chēng)引物位置引物序列5' -3'產(chǎn)物大小用途L10680A10661-10680ntAGTCTTTGCCGCCTGCGAta312 bp檢測(cè)10680AH1097210972-10952ntTCAGGTAGTTAGTATTAGGAGL48874866-4887ntTGACAAAAACTAGCCCCCATCT596 bp內(nèi)參H54425461-5442ntGCGATGAGTGTGGGGAGGAAPCR 反應(yīng)體系總體系為 20 μ L，包含 30ng 基因組 DNA，IOmM Tris-HCl(pH 8.3)， 1. 5mM MgCl2, 50mM KCl，0. 5U TaKaRa rTaq, 175μΜ dNTP，突變特異引物 L10680A和 H10972 及內(nèi)參引物L(fēng)4887和H5442各0. 3 μ M。PCR 反應(yīng)程序94°C，預(yù)變性 3min ；94°C變性 20s，61°C退火 20s，72°C延伸 30s，重 復(fù)30個(gè)循環(huán)；72°C延伸5min。(3) PCR產(chǎn)物檢測(cè)取PCR產(chǎn)物3 μ L在1. 5%的瓊脂糖凝膠上電泳，電泳緩沖液為 IX TAE, 150V恒壓電泳15min，溴化乙啶染色5min，凝膠成像系統(tǒng)下觀察拍照。(4)靈敏度檢測(cè)能檢到的最低水平的突變DNA的濃度以lng、2. 5ng、5ng、IOng和15ng的含有 G10680A突變的DNA為模板，用與步驟(2)和(3)相同的PCR反應(yīng)體系和程序擴(kuò)增并檢測(cè)。能檢到的最低水平的突變異質(zhì)性將正常人DNA樣本與含有G10680A突變的患者 DNA樣本在總量為30ng的情況下按設(shè)定比例混合，使突變的DNA樣本比例分別為5%、10% 和20%，將混合好的DNA模板按照與步驟(2)和(3)相同的PCR反應(yīng)體系和程序擴(kuò)增并檢 測(cè)。本發(fā)明與其它現(xiàn)有技術(shù)相比，具有快速、簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確、靈敏的特點(diǎn)，儀器設(shè)備 要求不高，適合于在大規(guī)模的臨床樣本檢測(cè)中推廣應(yīng)用。本發(fā)明對(duì)于Leber遺傳性視神經(jīng) 病變的遺傳研究及咨詢具有重要的意義。


圖1為用本發(fā)明方法進(jìn)行等位基因特異PCR檢測(cè)LHON線粒體突變G10680A的電 泳圖譜。圖2為本發(fā)明方法的靈敏度檢測(cè)電泳圖譜。
具體實(shí)施方案1、引物設(shè)計(jì)根據(jù)mtDNA G10680A突變，將突變特異的引物3'端第一位設(shè)計(jì)成A堿基(見(jiàn)表1， L10680A)，用于擴(kuò)增突變型DNA，同時(shí)在引物3'端第二位引入一個(gè)錯(cuò)配堿基(堿基A突變 成堿基T，形成T/T錯(cuò)配)，以增強(qiáng)引物對(duì)于突變位點(diǎn)的特異性，在下游設(shè)計(jì)另一個(gè)引物(表 1，H10972)，和突變特異性引物一起擴(kuò)增出一條312bp的突變特異的片段。同時(shí)，在mtDNA 4866-5461區(qū)段設(shè)計(jì)了 一對(duì)內(nèi)參引物(見(jiàn)表1，L4887/H5442)，無(wú)論有無(wú)G10680A突變，內(nèi)參 引物都能擴(kuò)增得到一條596bp的片段。引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列
5及產(chǎn)物大小見(jiàn)表1。2、樣本采集采集3例經(jīng)過(guò)DNA序列測(cè)定證實(shí)攜帶有G10680A突變的DNA樣本和3例正常人全 血樣本。3、樣品基因組DNA提取使用酚/氯仿法提取全血樣本中基因組DNA。4、PCR 擴(kuò)增PCR 反應(yīng)體系總體系為 20 μ L，包含 30ng 基因組 DNA，IOmM Tris-HCl (pH 8. 3)， 1. 5mM MgCl2, 50mM KCl，0. 5U TaKaRa rTaq, 175μΜ dNTP，突變特異引物 L10680A和 H10972 及內(nèi)參引物L(fēng)4887和H5442各0. 3 μ M。PCR 反應(yīng)程序94°C，預(yù)變性 3min ；94°C變性 20s，61°C退火 20s，72°C延伸 30s，重 復(fù)30個(gè)循環(huán)；72°C延伸5min。5、PCR產(chǎn)物檢測(cè)PCR產(chǎn)物檢測(cè)取PCR產(chǎn)物3 μ L在1. 5 %的瓊脂糖凝膠上電泳，電泳緩沖液為 IX TAE, 150V恒壓電泳15min，溴化乙啶染色5min，凝膠成像系統(tǒng)下觀察拍照。6、靈敏度檢測(cè)能檢到的最低水平的突變DNA濃度以lng、2. 5ng、5ng、IOng和15ng的含有 G10680A突變的DNA為模板，用與步驟4和5相同的PCR反應(yīng)體系和程序擴(kuò)增并檢測(cè)；能檢到的最低水平的突變異質(zhì)性將正常人DNA樣本與含有G10680A突變的患者 DNA樣本在保持總量為30ng模板DNA的情況下按一定比例混合，使突變的DNA樣本比例分 別為5%、10%和20%，將混合好的DNA模板用與步驟4和5相同的PCR反應(yīng)體系和程序擴(kuò) 增并檢測(cè)。用本發(fā)明方法進(jìn)行等位基因特異PCR檢測(cè)LHON線粒體突變G10680A的電泳結(jié)果 (見(jiàn)圖1)。其中泳道1為未加DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增的陰性對(duì)照，泳道2-4為無(wú)突變G10680A 的正常人DNA樣本擴(kuò)增結(jié)果，泳道5-7為有G10680A突變的LHON患者DNA樣本擴(kuò)增結(jié)果， 泳道M為2000bp的核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)。圖中596bp的條帶為內(nèi)參條帶，除了陰性對(duì)照外，所 有的檢測(cè)樣本都有此條帶，表明PCR體系和條件合適，擴(kuò)增成功；312bp的條帶為突變特異 條帶，只有G10680A突變存在的樣本才會(huì)擴(kuò)增出此條帶。本發(fā)明方法的靈敏度檢測(cè)結(jié)果(見(jiàn)圖2)。其中泳道1為未加DNA模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增的陰性對(duì)照；泳道2-6分別為以lng、2. 5ng、5ng、10ng和15ng含有G10680A突變的 DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增的結(jié)果；泳道7-9為突變的與正常的DNA在總量為30ng模板DNA的情 況下混合，使突變的DNA比例分別為5%、10%和20%，再進(jìn)行擴(kuò)增的結(jié)果；泳道10為含有 G10680A突變的LHON患者DNA樣本擴(kuò)增結(jié)果；泳道M為2000bp的核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)。如圖所 示，本發(fā)明提供的實(shí)驗(yàn)條件最少能采用5ng的DNA為模板進(jìn)行有效的擴(kuò)增檢測(cè)。在DNA模 板總量為30ng的情況下，本發(fā)明能檢測(cè)到低至10%的G10680A突變的異質(zhì)性水平。
權(quán)利要求
1. 一種Leber遺傳性視神經(jīng)病變線粒體DNA突變G10680A的快速檢測(cè)方法，包括基因 組DNA提取、引物設(shè)計(jì)、PCR擴(kuò)增、電泳檢測(cè)步驟，其特征在于本快速檢測(cè)方法的具體步驟如 下(1)使用酚/氯仿法或試劑盒提取法從臨床樣本中提取基因組DNA；(2)以步驟⑴提取的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)引物為
全文摘要
本發(fā)明涉及一種Leber遺傳性視神經(jīng)病變線粒體DNA突變G10680A的快速檢測(cè)方法，屬Leber遺傳性視神經(jīng)病變研究技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明基于AS-PCR的原理，將突變特異的引物3′端第一位設(shè)計(jì)成A堿基L10680A，同時(shí)在引物3′端第二位引入一個(gè)錯(cuò)配堿基(堿基A突變成堿基T，形成T/T錯(cuò)配)，在線粒體DNA序列的4866-5461區(qū)域，設(shè)計(jì)一對(duì)內(nèi)參引物L(fēng)4887/H5442。采用上述兩對(duì)引物(L10680A/H10972和L4887/H5442)，在一個(gè)PCR反應(yīng)中對(duì)待測(cè)標(biāo)本DNA樣品進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳檢測(cè)，依據(jù)突變特異的電泳圖譜對(duì)G10680A突變進(jìn)行基因分型，實(shí)現(xiàn)突變基因的快速檢測(cè)。本發(fā)明具有簡(jiǎn)單、快速、經(jīng)濟(jì)、靈敏的特點(diǎn)。本發(fā)明對(duì)于Leber遺傳性視神經(jīng)病變的遺傳研究及咨詢具有重要的意義。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102146443SQ20111000171
公開(kāi)日2011年8月10日 申請(qǐng)日期2011年1月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月6日
發(fā)明者姚永剛, 張阿梅 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所