專利名稱：：Leber遺傳性視神經(jīng)病變線粒體DNA原發(fā)突變G3635A的快速檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種Leber遺傳性視神經(jīng)病變線粒體DNA原發(fā)突變G3635A的快速檢測方法，屬Leber遺傳性視神經(jīng)病變研究
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：Leber遺傳性視神經(jīng)病變(Leberhereditaryopticneuropathy,LHON;MM535000)是由線粒體DNA突變所導(dǎo)致的致盲性母系遺傳性疾病，主要多發(fā)于青壯年男性，并且存在疾病不完全外顯現(xiàn)象，即含有線粒體DNA原發(fā)突變的個體也不一定會臨床發(fā)病?；跉W洲西部人群的調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，每25，000-50，000人中就有一例LHON患者；亞洲人群中目前還沒有相關(guān)的臨床調(diào)查資料。前人研究表明，95%以上的LHON是由線粒體DNA的三個點突變G11778A、G3460A、T14484C中的一種引起的?；谶@三個原發(fā)突變的基因檢測是目前臨床上對該病確診的一種重要的手段。歐亞病人群體中，這三種原發(fā)突變的分布情況差別很大，提示原發(fā)突變譜在歐亞人群中迥異。針對臨床上大量的疑似LHON病例的研究，有望拓展國人LHON原發(fā)突變的名錄，為臨床遺傳診斷和咨詢服務(wù)。Jia等人2006年對國人群體中903個有LHON臨床癥狀的患者檢測發(fā)現(xiàn)，有557個患者沒有檢測到上述三個原發(fā)突變中的任何一個，提示國人群體中存在新的有待證實和發(fā)現(xiàn)的線粒體DNA原發(fā)突變。Brown等人2001年在一個不含有三個主要的原發(fā)突變的俄羅斯LHON家系中發(fā)現(xiàn)，線粒體DNA突變G3635A是其發(fā)病的原因。該突變導(dǎo)致線粒體呼吸鏈復(fù)合物INADH脫氫酶ND1亞基第110位高度保守的絲氨酸轉(zhuǎn)變成天冬酰胺，從而使呼吸鏈功能受損。G3635A突變被首次報道后，一直未見相關(guān)的后續(xù)研究和報道來證實該突變的致病性。近期，我們在一個有LHON臨床癥狀卻沒有攜帶三個原發(fā)突變的國人家系中也檢測到G3635A突變，二級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析顯示該突變減弱了ND1蛋白的疏水性，這種結(jié)構(gòu)上的改變或許會進而引發(fā)LHON。Yang等人幾乎同時在另外兩個疑似LHON但無三個原發(fā)突變的國人家系中也發(fā)現(xiàn)了G3635A突變。我們未發(fā)表數(shù)據(jù)顯示，G3635A突變在表現(xiàn)LHON臨床癥狀的國入患者群體中出現(xiàn)的頻率達到1%。這些研究證實了G3635A是國人群體中LHON發(fā)病的一個重要的致病性突變。目前，對于LHON尚無有效的治療方法。以分子遺傳學(xué)檢測方法對該病進行遺傳研究在一定程度上能預(yù)防該病的發(fā)生。因此，對于基因檢測未發(fā)現(xiàn)有G11778A、G3460A、T14484C三個主要原發(fā)突變的LH0N患者家系進行G3635A突變檢測，無疑對于該病的遺傳研究、遺傳咨詢和預(yù)防具有重要的意義。目前公開的與本發(fā)明相似的檢測線粒體DNA突變G3635A的申請專利有一個，其名稱為"Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變相關(guān)mtDNA突變位點集成檢測基因芯片及其制備與應(yīng)用"，申請?zhí)?00810204771.7，該發(fā)明所用方法為基因芯片技術(shù)，該方法對儀器設(shè)備的要求很高，且成本較高，不適合在常規(guī)的實驗室推廣使用?，F(xiàn)有很多其他檢測DNA突變的技術(shù)，如單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(SSCP)、變性高效液相色譜(DHPLC)、等位基因特異PCR等。其中，等位基因特異PCR(Allele-specificPCR，AS-PCR)由于其經(jīng)濟、快速、簡易的特點被廣泛應(yīng)用到各種DNA突變檢測工作中。等位基因特異PCR的原理是將引物3'末端設(shè)計成突變特異的堿基，配合適當?shù)姆聪蛞铮型蛔兊腄NA因3'末端與引物配對從而擴增得到突變特異的PCR產(chǎn)物，而無突變的DNA模板不能與突變特異性引物配對，從而不能擴增得到PCR產(chǎn)物。通過常規(guī)的瓊脂糖電泳檢測PCR產(chǎn)物的有無，進而來判斷檢測樣本DNA是否存在突變。經(jīng)文獻檢索，未見與本發(fā)明方法相同的公開報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種快速、簡易、經(jīng)濟的Leber遺傳性視神經(jīng)病變線粒體DNA原發(fā)突變G3635A的快速檢測方法。本發(fā)明基于AS-PCR的原理，將突變特異的引物3'端第一位設(shè)計成T堿基(見表1，H3635)，用于擴增突變型DNA;在引物3'端第四位引入一個錯配堿基(堿基A突變成堿基T，形成T/T錯配)，增強引物對于突變位點的特異性；在線粒體DNA序列上遠離G3635A突變的一個區(qū)段，即1138-1782區(qū)域，設(shè)計了一對內(nèi)參引物(見表1，L1156/H1782)，用于監(jiān)測PCR擴增反應(yīng)體系中是否存在標本DNA及反應(yīng)體系是否合適。采用上述兩對引物(L3179/H3635和L1156/H1782)，在單個PCR反應(yīng)中對待測標本DNA樣品進行擴增。無論檢測的標本DNA是否含有G3635A突變，內(nèi)參引物L(fēng)1156/H1782都會得到擴增，這樣就能避免由于PCR失敗而造成的G3635A突變假陰性的結(jié)果。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳檢測，依據(jù)突變特異的電泳圖譜對G3635A突變進行基因分型，實現(xiàn)基因突變的快速檢測。由于線粒體DNA突變具有異質(zhì)性，即突變的與正常的線粒體DNA同時共存的現(xiàn)象，如果檢測方法的靈敏度不夠高，則很有可能在有突變異質(zhì)性的患者個體中檢不到突變，從而導(dǎo)致假陰性結(jié)果。本發(fā)明通過將正常人與含有G3635A突變的病人的DNA樣品按不同比例混合，進行AS-PCR，以檢測本技術(shù)方法的靈敏度，并提供本技術(shù)檢測到的最低水平的突變DNA的技術(shù)參數(shù)。本發(fā)明利用等位基因特異PCR(Allele-specificPCR，AS-PCR)方法檢測Leber遺傳性視神經(jīng)病變線粒體DNA原發(fā)突變G3635A，具體步驟如下(l)DNA提取使用常規(guī)酚/氯仿法從臨床樣本中提取基因組DNA。(2)以步驟(1)提取的基因組DNA為模板，進行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)引物擴增引物序列及產(chǎn)物大小見表1表lAS-PCR所用引物組成、序列及產(chǎn)物大小<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>PCR反應(yīng)體系總體系為20iiL，包含50ng基因組DNA，10mMTris-HCl(pH8.3)，1.5mMMgCl2，50mMKCl，O.5UTaKaRarTaq，175yMdNTP，突變特異引物L(fēng)3179和H3635各0.15iiM，內(nèi)參引物L(fēng)1156和H1782各0.075iiM。PCR反應(yīng)程序94。C，預(yù)變性5min;94。C變性30s，60。C退火30s，72。C延伸30s，重復(fù)30個循環(huán)；72。C延伸7min。(3)PCR產(chǎn)物檢測取PCR產(chǎn)物2iiL在1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳，電泳緩沖液為1XTAE，130V恒壓電泳30min，溴化乙啶染色5min，凝膠成像系統(tǒng)下觀察拍照。(4)靈敏度檢測能檢到的最低水平的突變DNA的濃度以lng、2.5ng、5ng、10ng的含有G3635A突變的DNA為模板，用與步驟(2)和(3)相同的PCR反應(yīng)體系和程序擴增并檢測；能檢到的最低水平的突變異質(zhì)性將正常人DNA樣本與含有G3635A突變的患者DNA樣本在總量為50ng的情況下按設(shè)定比例混合，使突變的DNA樣本比例分別為5%、10%、15%和20%，將混合好的DNA模板按照與步驟(2)和(3)相同的PCR反應(yīng)體系和程序擴增并檢測。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有快速、簡單、經(jīng)濟、準確、靈敏的特點，儀器設(shè)備要求不高，適合于在大規(guī)模的臨床樣本檢測中推廣應(yīng)用。本發(fā)明對于Leber遺傳性視神經(jīng)病變的遺傳研究及咨詢具有重要的意義。圖1為用本發(fā)明方法進行等位基因特異PCR檢測LHON線粒體原發(fā)突變G3635A的電泳圖譜。圖2為本發(fā)明方法的靈敏度檢測電泳圖譜。具體實施方案1、引物設(shè)計根據(jù)線粒體DNAG3635A突變，將突變特異的引物3'端第一位設(shè)計成T堿基(見表1，H3635)，用于擴增突變型DNA，同時在引物3'端第四位引入一個錯配堿基(堿基A突變成堿基T，形成T/T錯配)，以增強引物對于突變位點的特異性，在上游設(shè)計另一個引物(表l，L3179)，和突變特異性引物一起擴增出一條496bp的突變特異的片段。同時，在線粒體DNA1138-1782區(qū)段設(shè)計了一對內(nèi)參引物(見表1，L1156/H1782)，無論有無G3635A突變，內(nèi)參引物都能擴增得到一條664bp的片段。引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列及產(chǎn)物大小見表l。2、樣本采集采集5例經(jīng)過DNA序列測定證實攜帶有G3635A突變的DNA樣本和4例正常人全血樣本。3、樣品基因組DNA提取使用酚/氯仿法提取全血樣本中基因組DNA。4、PCR擴增PCR反應(yīng)體系總體系為20iiL，包含50ng基因組DNA，10mMTris-HCl(pH8.3)，1.5mMMgCl2，50mMKCl，O.5UTaKaRarTaq，175yMdNTP，突變特異引物L(fēng)3179和H3635各0.15iiM，內(nèi)參引物L(fēng)1156和H1782各0.075iiM。PCR反應(yīng)程序94。C，預(yù)變性5min;94。C變性30s，60。C退火30s，72。C延伸30s，重復(fù)30個循環(huán)；72。C延伸7min。5、PCR產(chǎn)物檢測PCR產(chǎn)物檢測取PCR產(chǎn)物2iiL在1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳，電泳緩沖液為1XTAE，130V恒壓電泳30min，溴化乙啶染色5min，凝膠成像系統(tǒng)下觀察拍照。6、靈敏度檢測能檢到的最低水平的突變DNA濃度以lng、2.5ng、5ng和10ng的含有G3635A突變的DNA為模板，用與步驟4和5相同的PCR反應(yīng)體系和程序擴增并檢測；能檢到的最低水平的突變異質(zhì)性將正常人DNA樣本與含有G3635A突變的患者DNA樣本在保持總量為50ng模板DNA的情況下按一定比例混合，使突變的DNA樣本比例分別為5%、10%、15%和20%，將混合好的DNA模板用與步驟4和5相同的PCR反應(yīng)體系和程序擴增并檢測。用本發(fā)明方法進行等位基因特異PCR檢測LHON線粒體突變G3635A的電泳結(jié)果(見圖1)。其中泳道1為未加DNA模板進行PCR擴增的陰性對照，泳道2-5為無G3536A突變的正常人DNA樣本擴增結(jié)果，泳道6-10為有G3635A突變的LHON患者DNA樣本擴增結(jié)果，泳道M為50bp的核酸分子量標準。圖中664bp的條帶為內(nèi)參條帶，除了陰性對照外，所有的檢測樣本都有此條帶，表明PCR體系和條件合適，擴增成功；496bp的條帶為突變特異條帶，只有G3635A突變存在的樣本才會擴增出此條帶。本發(fā)明方法的靈敏度檢測結(jié)果(見圖2)。其中泳道1為未加DNA模板進行PCR擴增的陰性對照；泳道2-5分別為以lng、2.5ng、5ng和10ng含有G3635A突變的DNA為模板進行擴增的結(jié)果；泳道6-9為突變的與正常的DNA在總量為50ng模板DNA的情況下混合，使突變的DNA比例分別為5%、10%、15%和20%，再進行擴增的結(jié)果；泳道10為含有G3635A突變的LHON患者DNA樣本擴增結(jié)果；泳道M為50bp的核酸分子量標準。如圖所示，本發(fā)明提供的實驗條件最少可以采用2.5ng的DNA為模板進行有效的擴增檢測。在DNA模板總量為50ng的情況下，本發(fā)明可以檢測到低至5-10%的G3635A突變的異質(zhì)性水平。序列表〈110〉中國科學(xué)院昆明動物研究所〈120〉Leber遺傳性視神經(jīng)病變線粒體DNA原發(fā)突變G3635A的快速檢測技術(shù)〈130〉說明書〈160>4〈170>PatentInversion3.3〈210>1<211〉20〈212>DNA〈213〉人工合成〈220>〈221>primer_bind〈222>(1)..(20)〈223〉引物L(fēng)3179〈400>1agcgccttcccccgtaaatg〈210>2〈211>21<212〉DNA〈213〉人工合成〈220〉〈221>primer—bind<222〉(1)..(21)〈223〉引物H3635〈400>2ggattgagtaaacggcttggt〈210>3〈211>19〈212>DNA〈213>人工合成〈220〉〈221>primer_bind〈222>(1)..(19)〈223〉引物L(fēng)1156〈400>3g朋cactecg3gccac3gc〈210>4<211〉22〈212>DNA〈213〉人工合成〈220〉〈221〉primer_bind〈222〉(1).(22)〈223〉引物H1782〈400>4ctgttaaaagtgcataccgcca2權(quán)利要求一種Leber遺傳性視神經(jīng)病變線粒體DNA原發(fā)突變G3635A的快速檢測方法，包括基因組DNA提取、引物設(shè)計、PCR擴增、電泳檢測步驟，其特征在于本方法的具體步驟如下(1)使用常規(guī)酚/氯仿法從臨床樣本中提取基因組DNA；(2)以步驟(1)提取的基因組DNA為模板，進行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)引物為PCR反應(yīng)體系總體系為20μL，包含50ng基因組DNA，PH為8.3的10mMTris-HCl，1.5mMMgCl2，50mMKCl，0.5UTaKaRarTaq，175μMdNTP，突變特異引物L(fēng)3179和H3635各0.15μM，內(nèi)參引物L(fēng)1156和H1782各0.075μM；PCR反應(yīng)程序94℃，預(yù)變性5min；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，重復(fù)30個循環(huán)；72℃延伸7min；(3)PCR產(chǎn)物檢測取PCR產(chǎn)物2μL在1.5％的瓊脂糖凝膠上電泳，電泳緩沖液為1×TAE，130V恒壓電泳30min，溴化乙啶染色5min，凝膠成像系統(tǒng)下觀察拍照；(4)靈敏度檢測能檢到的最低水平的突變DNA的濃度以1ng、2.5ng、5ng、10ng的含有G3635A突變的DNA為模板，用與步驟(2)和(3)相同的PCR反應(yīng)體系和程序擴增并檢測；能檢到的最低水平的突變異質(zhì)性將正常人DNA樣本與含有G3635A突變的患者DNA樣本在總量為50ng的情況下按設(shè)定比例混合，使突變的DNA樣本比例分別為5％、10％、15％和20％，將混合好的DNA模板按照與步驟(2)和(3)相同的PCR反應(yīng)體系和程序擴增并檢測。全文摘要本發(fā)明涉及一種Leber遺傳性視神經(jīng)病變線粒體DNA原發(fā)突變G3635A的快速檢測方法，屬Leber遺傳性視神經(jīng)病變研究
技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明基于AS-PCR的原理，將突變特異的引物3′端第一位設(shè)計成T堿基H3635，同時在引物3′端第四位引入一個錯配堿基(堿基A突變成堿基T，形成T/T錯配)，在線粒體DNA序列的1138-1782區(qū)域，設(shè)計一對內(nèi)參引物L(fēng)1156/H1782。采用上述兩對引物(L3179/H3635和L1156/H1782)，在單個PCR反應(yīng)中對待測標本DNA樣品進行擴增。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳檢測，依據(jù)突變特異的電泳圖譜對G3635A突變進行基因分型，實現(xiàn)基因的快速檢測。本發(fā)明具有簡單、快速、經(jīng)濟、靈敏的特點。本發(fā)明對于Leber遺傳性視神經(jīng)病變的遺傳研究及咨詢具有重要的意義。文檔編號C12Q1/68GK101781683SQ20101003916公開日2010年7月21日申請日期2010年1月14日優(yōu)先權(quán)日2010年1月14日發(fā)明者姚永剛,畢蕊申請人:中國科學(xué)院昆明動物研究所