專利名稱：新型雙功能抗瘢痕和組織纖維化寡聚核苷酸藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是涉及一種抗瘢痕和組織纖維化治療用的誘騙寡聚 核苷酸，更具體而言，涉及一種能夠同時(shí)與轉(zhuǎn)錄因子活化蛋白-KActivator protein-1, AP-1)和Smad3特異結(jié)合并抑制這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子活性的誘騙寡聚核苷酸。本發(fā)明還涉及這 種寡聚核苷酸的制備及其在治療瘢痕和組織纖維化疾病中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
病理性瘢痕是創(chuàng)面過度修復(fù)和組織纖維化的結(jié)果，不僅影響美觀，且可導(dǎo)致組織 和器官不同程度的功能障礙，甚至是某些疾病治療失敗的主要原因，如抗青光眼濾過術(shù)后， 濾過泡瘢痕的形成是導(dǎo)致抗青光眼手術(shù)失敗的主要原因。輸卵管阻塞再通術(shù)后瘢痕形成、 腹腔術(shù)后形成腸粘連致腸梗阻，以及因炎性等刺激因素所致的腎纖維化和肝纖維化等疾病 的發(fā)生均與組織過度修復(fù)和纖維化相關(guān)。因此，針對(duì)受創(chuàng)后組織過度修復(fù)和組織纖維化的 形成機(jī)制，設(shè)計(jì)、研發(fā)并制備治療病理性瘢痕和組織纖維化疾病的藥物成為本領(lǐng)域的研究 執(zhí)占之一。目前用于治療病理性瘢痕和組織纖維化的主要措施包括以下幾個(gè)方面(1)細(xì)胞 因子抑制劑如TGF-β 2的單克隆抗體、TGF-β 2受體阻滯劑、核心蛋白多糖(Decorin)、 TGF-β 2反義寡核苷酸(OGN)、IL-I受體阻斷劑、整合素抗體等；(2)抑制成纖維細(xì)胞的 增殖與遷移如5-氟尿嘧啶(5-Fu)、絲裂霉素c(MMC)、伊洛馬司他(ilomastat)、蘇拉明 (Suramin)、光動(dòng)力療法、β射線局部照射、Ρ21基因轉(zhuǎn)染等方法；(3)抑制早期炎癥的發(fā) 生包括皮質(zhì)類固醇及非激素類消炎藥兩類；(4)抑制膠原合成與收縮如β氨基丙腈 (β APN)、D青霉胺等；(5)增加細(xì)胞外基質(zhì)的降解如組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)、尿激 酶、肝素等；(6) —些中藥制劑抑制成纖維細(xì)胞的增殖如丹參、苦參堿、川芎和積雪苷等。上述抗瘢痕和組織纖維化藥物對(duì)過渡性瘢痕形成和組織纖維化的治療具有一定 的療效，但也存在一些無法回避的問題，如5-氟尿嘧啶和絲裂霉素是很強(qiáng)的細(xì)胞有絲分裂 抑制劑，毒副作用較大，可造成傷口不愈合等一些嚴(yán)重并發(fā)癥；而針對(duì)TGF-β 2的抑制劑是 抗瘢痕和纖維化的研究熱點(diǎn)，雖然其也可減輕瘢痕的形成和組織纖維化，但也存在明顯不 足，首先，其不能抑制TGF-β 1和TGF-i3 3介導(dǎo)的瘢痕化和纖維化作用；其次，我們知道瘢痕 形成和纖維化是多個(gè)細(xì)胞因子綜合作用的結(jié)果，阻斷單一細(xì)胞因子的生物學(xué)效應(yīng)并不能達(dá) 到徹底減少瘢痕形成和纖維化的目的；此外，如針對(duì)膠原等細(xì)胞外基質(zhì)的合成與降解的藥 物，由于其不能消除細(xì)胞外基質(zhì)合成的始動(dòng)因素，以及阻滯成纖維細(xì)胞的增殖效應(yīng)，其抗瘢 痕和纖維化的作用也就受到了限制。綜上所述，為了預(yù)防病理性瘢痕的形成和組織纖維化， 必須以病理性瘢痕形成和組織纖維化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)為突破口，尋找特異高效的抗瘢痕和纖維 化藥物。傷口愈合是一個(gè)錯(cuò)綜復(fù)雜的生物學(xué)過程，包括炎癥產(chǎn)生、細(xì)胞增生、纖維組織增生 和組織重塑(瘢痕形成)四個(gè)階段。細(xì)胞因子在傷口愈合過程中占有非常重要的作用，參與 傷口愈合的全過程，眾多的細(xì)胞因子形成網(wǎng)絡(luò)，共同調(diào)控成纖維細(xì)胞等各種效應(yīng)細(xì)胞的增生和代謝活動(dòng)，維持膠原等細(xì)胞外基質(zhì)沉積與降解 之間的動(dòng)態(tài)平衡，并對(duì)表皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和凋亡活動(dòng)進(jìn)行有秩序地調(diào) 節(jié)。正性和負(fù)性的細(xì)胞因子在調(diào)節(jié)傷口愈合的過程中保持平衡狀態(tài)，一旦平衡被打破，則會(huì) 出現(xiàn)增生性瘢痕或不愈合等病理性愈合。比如，伴有過渡炎癥反應(yīng)的傷口，由于IL-1、IL_6 等炎癥因子大量分泌，造成細(xì)胞因子之間的平衡失調(diào)，最終導(dǎo)致增生性瘢痕的形成。TGF-β (transforming growth factor-β，TGF-β )是組織纖維化、創(chuàng)傷修復(fù)及 瘢痕形成的關(guān)鍵調(diào)控分子之一。研究表明，活化的TGF-β可通過與細(xì)胞膜上具有絲/蘇 氨酸激酶活性的TGF-β I型和II型受體結(jié)合，形成三聚體復(fù)合物，后誘導(dǎo)I型受體磷酸 化。磷酸化的I型受體特異性地識(shí)別并磷酸化激活TGF-β信號(hào)通路的胞內(nèi)信號(hào)分子-Smad 蛋白家族中的受體調(diào)節(jié)型 Smads (Receptor-regulated Smads, R-Smads)(包括 Smad2 和 Smad3)，活化的R-Smads與Co-Smad (即Smad4)結(jié)合成為轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，并進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，直 接與靶基因啟動(dòng)子或增強(qiáng)子內(nèi)的一個(gè)回紋結(jié)構(gòu)DNA序列(5' -GTCTAGAC-3')順式作用元 件，即Smad結(jié)合元件(Smad-binding element, SBE)特異性結(jié)合，調(diào)節(jié)TGF-β反應(yīng)性靶基 因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。已證實(shí)，許多參與傷口愈合和瘢痕形成的基因，如纖溶酶原激活劑抑制 物-I(PAI-I)、血小板源性生長因子(PDGF)、結(jié)締組織生長因子(CTGF)、纖維結(jié)合素、I型 和III型膠原等基因的增強(qiáng)子或啟動(dòng)子內(nèi)，均含有SBE反應(yīng)元件。Smad轉(zhuǎn)錄復(fù)合物可直接上 調(diào)這些基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。另外，Smad轉(zhuǎn)錄復(fù)合物還可通過與AP-I (c-Fos和c_Jim)、FAST/ R)xH、ATF2、VDR等DNA結(jié)合蛋白(即轉(zhuǎn)錄因子)結(jié)合，與這些轉(zhuǎn)錄因子的信號(hào)通路發(fā)生交 互作用(Cross-talk)，以間接方式，調(diào)節(jié)TGF-β反應(yīng)性基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，且這種間接方 式是TGF-β信號(hào)通路的主要調(diào)節(jié)方式。研究發(fā)現(xiàn)，Smad3的抑制劑柚皮素(Naringenin) 可明顯減弱TGF-β誘導(dǎo)的鼠肝星形細(xì)胞合成I型膠原、纖維連接蛋白和PAI-I等細(xì)胞外 基質(zhì)的能力。此外，Smad3基因缺失小鼠肺泡纖維明顯減少，肺泡腔呈現(xiàn)進(jìn)行性擴(kuò)大，且將 TGF-β 1轉(zhuǎn)染入肺組織也不能誘導(dǎo)肺的纖維化。另外，值得注意的是，TGF-β信號(hào)通路除了 通過Smad信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)外，還可通過絲裂素蛋白活化激酶信號(hào)途徑(MAPK)介導(dǎo)，活化AP-I 等轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控靶基因的表達(dá)。活化蛋白-l(activator protein-1，ΑΡ-1)是一類由Fos蛋白和Jun蛋白同源 或異源二聚體組成的轉(zhuǎn)錄因子，能以許多基因啟動(dòng)子或增強(qiáng)子內(nèi)順式作用元件AP-I位 點(diǎn)(5' -TGAGTGA-3')，即佛波酯反應(yīng)元件結(jié)合，參與介導(dǎo)多種與炎癥、細(xì)胞增殖、組織纖 維化和細(xì)胞外基質(zhì)沉積等相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。在傷口愈合的過程中，許多細(xì)胞因子 (TGF- β、PDGF, EGF、bFGF、IL-I、TNF 等)都能通過 MAPK 信號(hào)通路激活 AP-I，活化的 AP-I 進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。目前已證實(shí)，參與傷口愈合和瘢痕形成的許多基因，如 TGF-β、IL-I β、IL-8、ICAM-I、絲狀分裂控制蛋白_1 (MCP-I)、細(xì)胞周期素D1、纖維連接蛋 白、層粘連蛋白B、I型膠原、金屬蛋白酶組織抑制物-I(TIMP-I)等基因的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子 內(nèi)均含有AP-I位點(diǎn)，其可調(diào)控這些基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。抑制AP-I的信號(hào)通路，可明顯減少 增生性瘢痕的形成和組織纖維化。綜上所述，Smad信號(hào)通路和AP-I信號(hào)通路是兩條與傷口愈合、瘢痕形成和組織纖 維化關(guān)系最為密切的信號(hào)通路。Smad信號(hào)通路主要參與TGF-β誘導(dǎo)的應(yīng)答反應(yīng)，還可上調(diào) Ap-I的JunB亞基轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，以及與c-Fos和c-Jun亞基結(jié)合，協(xié)助AP-I誘導(dǎo)與傷口愈合 和瘢痕形成相關(guān)基因的表達(dá)。而AP-I信號(hào)通路則是許多刺激因素的共同信使傳導(dǎo)分子，不僅介導(dǎo)傷口愈合早期的炎癥反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)，還是傷口愈合和瘢痕形成相關(guān)基因的調(diào) 控者。此外，AP-I是傷口愈合和瘢痕形成過程中信號(hào)放大效應(yīng)的始動(dòng)者，其可被TGF-β活 化，而活化的AP-I又可上調(diào)TGF-β的表達(dá)，由此放大傷口愈合的信號(hào)?？傊?，Smad和AP-I 兩條信號(hào)通路相互協(xié)調(diào)，共同參與介導(dǎo)了傷口愈合和瘢痕的形成。由此，我們認(rèn)為，如能同 時(shí)成功抑制這兩條信號(hào)通路，將能有效抑制傷口愈合過程中病理性瘢痕的形成和組織纖維 化。目前，同時(shí)針對(duì)這兩條信號(hào)通路的抑制劑國內(nèi)外均未見報(bào)道。從Smads和AP-I的活化途徑不難看出，Smads和AP-I與靶基因啟動(dòng)子或增強(qiáng)子內(nèi) 的DNA順式作用元件結(jié)合是特異性的，只有直接干預(yù)Smads和AP-I與DNA順式作用元件相 結(jié)合，才能達(dá)到真正意義上的特異性控制瘢痕的形成和組織纖維化，有效阻滯增生性瘢痕 形成和組織纖維化過程中的信號(hào)放大效應(yīng)和成纖維細(xì)胞的過度增殖，減少細(xì)胞外基質(zhì)的過 度合成，同時(shí)加強(qiáng)細(xì)胞外基質(zhì)的降解速度。而對(duì)Smads和AP-I活化的上下游途徑進(jìn)行干預(yù) 則難以達(dá)到這一目的。此外，在尋找阻斷Smads和AP-I的活化策略時(shí)，應(yīng)把握“適度抑制” 原則，而不是“完全封閉/永久阻斷”。故研制特異性的Smads和AP-I抑制劑(而不是阻斷 劑)將為最終獲得高效、低副作用的理想抗瘢痕藥物提供可能。而應(yīng)用轉(zhuǎn)錄因子“誘騙”策 略可達(dá)到同時(shí)拮抗Smads和AP-I活化的目的，且這一策略是實(shí)現(xiàn)這一理想治療病理性瘢痕 形成和組織纖維化的最佳選擇之一。自1996年第一個(gè)經(jīng)美國FDA批準(zhǔn)的轉(zhuǎn)錄因子E2F “誘騙”策略(decoy strategy) 用于治療血管旁路移植術(shù)后新生內(nèi)膜增生(neointimal hyperplasia in vein bypass grafts)病人以來，許多研究已經(jīng)報(bào)道了該策略作為體內(nèi)基因治療的效果。其基本原理是 合成與順式作用元件相一致的雙鏈寡聚脫氧核苷酸(被稱為誘騙ODNs)，轉(zhuǎn)染入細(xì)胞，競(jìng)爭 性抑制轉(zhuǎn)錄因子與順式作用元件的結(jié)合，干擾轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合活性及其后續(xù)基因的表 達(dá)。由于該策略具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)潛在的藥物靶點(diǎn)(轉(zhuǎn)錄因子)；( 誘騙ODNs的合成相 對(duì)簡單且可靶向特異的組織；(3)不必弄清轉(zhuǎn)錄因子靶分子的精確分子結(jié)構(gòu)；(4)誘騙ODNs 可阻斷與同一順式作用元件結(jié)合的多種轉(zhuǎn)錄因子的效應(yīng)，且也可阻斷同一轉(zhuǎn)錄因子所調(diào)控 的多個(gè)靶基因的表達(dá)，其作用能力比反義ODNs更強(qiáng)。因此國外眾多學(xué)者一致認(rèn)為該策略可 作為治療某些人類疾病一種有效的手段。目前，有關(guān)單獨(dú)靶向Smad或者AP-I的“誘騙”策 略，已應(yīng)用于探討Smad和AP-I在癌癥、心血管和腎臟等相關(guān)疾病中的作用機(jī)制，以及對(duì)這 些疾病的治療性研究，體外實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果已顯示出確切而誘人的結(jié)果。這與該策略 具有拮抗Smad或AP-I活性的特異性、競(jìng)爭抑制性(不是完全阻斷)、使用時(shí)間及劑量的可 控性等特性有關(guān)。為此，我們以介導(dǎo)瘢痕形成和組織纖維化的關(guān)鍵調(diào)控分子Smads和AP-I為靶點(diǎn)， 應(yīng)用核轉(zhuǎn)錄因子的誘騙策略，設(shè)計(jì)并合成可同時(shí)與Smad和AP-I結(jié)合，并具有同時(shí)抑制兩種 轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄活性的雙功能誘騙寡核苷酸，同時(shí)證實(shí)此寡核苷酸能高效抑制成纖維細(xì)胞的 增殖，膠原的合成，有效阻止瘢痕的形成和組織纖維化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種抗瘢痕和組織纖維化的核酸藥物。本發(fā)明所述藥物包含既能與AP-I高親和結(jié)合的AP-I順式作用元件，又能與Smad 高親和結(jié)合的Smad順式作用元件的雙鏈誘騙寡核苷酸。
其中，所述雙鏈誘騙寡核苷酸包括核心序列TGACXTCAGACA或CAGACATGACXTCA或 GTCTAGACTGACXTCA或其功能等價(jià)物，其中所述核苷酸序列中，X代表G或者缺失。其中，所述雙鏈誘騙寡核苷酸包括序列TGACGTCAGACA或TGACTCAGACA或其功能等 價(jià)物。其中，所述雙鏈誘騙寡核苷酸包括序列CAGACATGACGTCA或CAGACATGACTCA或其功 能等價(jià)物。其中，所述雙鏈誘騙寡核苷酸包括序列GTCTAGACTGACGTCA或GTCTAGACTGACTCA或 其功能等價(jià)物。優(yōu)選的核酸，序列如下:ASCES101A 序列2 ；ASCES101B 序列3 ；ASCES101C 序列 4 ；ASCES101D 序列 5 ；ASCES102A 序列 7 和序列 8 ；ASCES102B 序列 9 ；ASCES103A 序列 11 和序列 12 ；ASCES103B 序列 13。本發(fā)明是一系列序列特異的誘騙核酸，可特異性結(jié)合轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。本發(fā)明的藥 物通過下調(diào)smad和AP-I的轉(zhuǎn)錄活性，從而抑制成纖維細(xì)胞的過度增殖，以及細(xì)胞外膠原等 基質(zhì)的分泌，達(dá)到治療病理性瘢痕和組織纖維化的目的。為此，本發(fā)明另一個(gè)目的在于，本發(fā)明的核酸在制備抗AP-I和Smad轉(zhuǎn)錄活性的藥 物中的應(yīng)用。所述抗AP-I和Smad轉(zhuǎn)錄活性的藥物是治療AP-I和Smad異常表達(dá)或活化引 起的瘢痕化和組織纖維化相關(guān)疾病的藥物；所述藥物是治療纖維化疾病、異常傷口愈合、異 常骨生成、免疫/炎癥相關(guān)疾病或抗青光眼濾過性手術(shù)后抗愈合的藥物。本發(fā)明的目的可通過以下措施來達(dá)到抗瘢痕和組織纖維化藥物的設(shè)計(jì)是將轉(zhuǎn)錄因子特異結(jié)合的序列作為藥物誘騙核 酸的核心序列，并適當(dāng)增加核心序列的側(cè)翼長度，使其易形成空間結(jié)構(gòu)，以加強(qiáng)藥物的穩(wěn)定 性及與靶因子的親和力。藥物ASCES101、ASCES102和ASCES103系列是為調(diào)控AP-I和Smads的過度活化 而設(shè)計(jì)。將轉(zhuǎn)錄因子AP-I順式作用元件和轉(zhuǎn)錄因子Smads順式作用元件以不同的先后順 序融合成交錯(cuò)重疊的寡核苷酸TGA(C/G)TCAGACA(序列1)、CAGACATGACGTCA(序列6)和 GTCTAGACTGACGTCA(序列10)，以這些寡核苷酸作為藥物誘騙核酸的核心序列，競(jìng)爭結(jié)合 AP-I和Smads，抑制AP-I和Smads的轉(zhuǎn)錄活性，下調(diào)含AP-I和Smads增強(qiáng)子基因的表達(dá)， 從而抑制成纖維細(xì)胞的增殖、生長和細(xì)胞外基質(zhì)的分泌，達(dá)到治療病理性瘢痕和組織纖維 化的目的。例如藥物ASCES101A由30個(gè)核苷酸的序列2組成，含上述核心序列1，并能通 過自身配對(duì)形成雙鏈線性DNA結(jié)構(gòu)。藥物ASCES101B由28個(gè)核苷酸的序列3組成，含上述 核心序列1，并能通過自身配對(duì)形成雙鏈線性DNA結(jié)構(gòu)。藥物ASCES101C由44個(gè)核苷酸組 成的序列4組成，含上述核心序列1，通過自身環(huán)化配對(duì)形成一個(gè)雙鏈DNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)。藥物 ASCES101D由42個(gè)核苷酸組成的序列5形成，含上述核心序列1，通過自身環(huán)化配對(duì)形成一 個(gè)雙鏈DNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)。藥物ASCES102A由M個(gè)核苷酸的序列7和8組成，含上述核心序列 6，兩個(gè)序列配對(duì)結(jié)合成雙鏈線性DNA結(jié)構(gòu)。藥物ASCES102B由44個(gè)核苷酸的序列9組成， 含上述核心序列6，通過自身環(huán)化成雙鏈DNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)。藥物ASCES103A由沈個(gè)核苷酸組 成的序列11和序列12組成，含上述核心序列10，兩個(gè)序列配對(duì)結(jié)合成雙鏈線性DNA結(jié)構(gòu)。 藥物ASCES1(X3B由46個(gè)核苷酸組成的序列13形成，含上述核心序列10，通過自身環(huán)化配對(duì) 形成一個(gè)雙鏈DNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)。總之，這些誘騙核酸藥物，可以設(shè)計(jì)為以AP-I和Smads順式作用元件交錯(cuò)形成的序列為核心序列，核苷酸總數(shù)為12-46個(gè)，并易形成線性、發(fā)夾、假結(jié)、 莖環(huán)、啞鈴等多種結(jié)構(gòu)的雙鏈寡聚DNA分子。誘騙核酸藥物經(jīng)DNA全自動(dòng)合成儀合成，硫代化，脫保護(hù)，純化和凍干，溶于水中， 定性定量測(cè)定分析后，進(jìn)行體外篩選和藥效試驗(yàn)，用成纖維細(xì)胞作為篩選體系，將細(xì) 胞加入96孔培養(yǎng)板，用RPMI1640完全培養(yǎng)液培養(yǎng)24h后，加入脂質(zhì)體和上述誘騙核酸，繼 續(xù)于37°C，5%C02中培養(yǎng)48h。用ATP生物素?zé)晒夥y(cè)定細(xì)胞的增殖。篩選結(jié)果表明8種 誘騙核酸對(duì)細(xì)胞均有不同程度的抑制作用，其中ASCES101D的抑制作用最大。這些誘 騙核酸均可開發(fā)成為抗瘢痕和組織纖維化藥物。具有上述核苷酸核心序列結(jié)構(gòu)的寡聚誘騙DNA可同時(shí)與AP-I和Smads結(jié)合，并抑 制AP-I和Smads與其順式作用元件的結(jié)合，從而抑制AP-I和Smads的轉(zhuǎn)錄活性，即抑制 AP-I和Smads調(diào)控各種含其順式作用元件的靶基因表達(dá)。此種結(jié)構(gòu)寡聚誘騙DNA既可以以 DNA形式單獨(dú)存在，也可與其它核酸和多肽融和，或被甲基化、硫代化、鎖核酸化和硼烷磷酸 酯化等修飾，或進(jìn)行個(gè)別堿基的突變、缺失或替代，或與其它物質(zhì)連接。無論以什么形式存 在，含此結(jié)構(gòu)DNA的物質(zhì)可能表現(xiàn)出與AP-I和Smads結(jié)合，并抑制AP-I和Smads生物學(xué)活 性的作用。本發(fā)明通過細(xì)胞增殖試驗(yàn)篩選，獲得的DNA不僅能夠競(jìng)爭性阻斷AP-I與其順式作 用元件的結(jié)合，也能夠抑制Smad與其順式作用元件的結(jié)合，進(jìn)而抑制含AP-I和Smads順式 作用元件的靶基因的表達(dá)，具有抗瘢痕和組織纖維化的功能，因而可以成為新的靶向AP-I 和Smads的抗瘢痕和組織纖維化藥物或藥物前體。本發(fā)明的DNA可以用于治療各種瘢痕和 組織纖維化相關(guān)疾病?？梢詫⑵渥鳛樗幬锘钚猿煞种苽涑伤幬锝M合物，該組合物根據(jù)需要 可以加入一些藥物可接受的載體，可以采用制劑學(xué)常規(guī)技術(shù)制備該組合物，本發(fā)明的組合 物可以口服，也可以非胃腸道給藥，優(yōu)選的組合物是單位劑量的納米型噴霧劑、注射劑和軟 膏形式。本發(fā)明的誘騙DNA可通過化學(xué)方式合成，也可將含此序列的核苷酸與其它核酸或 多肽融合或進(jìn)行化學(xué)修飾，用于抑制AP-I和Smads活性為目的的各種瘢痕相關(guān)疾病、各種 纖維化疾病以及其它相關(guān)疾病的治療，這對(duì)于設(shè)計(jì)和研制同時(shí)靶向AP-I和Smads的高效特 異抗瘢痕和組織纖維化藥物具有重要意義。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)與反義核酸和SiRNA相比，無論是作用機(jī)理還是作用效率，誘騙核酸均有著明顯 的差異結(jié)構(gòu)存在明顯差異，反義核酸和siRNA為單鏈線性寡聚核酸，誘騙核酸是具有二級(jí) 結(jié)構(gòu)的雙鏈DNA ；作用位點(diǎn)也存在明顯的差異，反義核酸和siRNA互補(bǔ)于靶基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 mRNA的某段序列，而誘騙核酸則直接結(jié)合于轉(zhuǎn)錄因子(蛋白質(zhì))上；另外，用量上也存在明 顯的差異，一個(gè)拷貝基因可轉(zhuǎn)錄出200-300條mRNA，且mRNA具有瞬時(shí)性，需要大量的反義核 酸和siRNA才能達(dá)到抑制靶基因表達(dá)的目的。相反，一種轉(zhuǎn)錄因子可控制多種效應(yīng)基因的 轉(zhuǎn)錄，且可被循環(huán)利用轉(zhuǎn)錄生成多拷貝的效應(yīng)基因mRNA，然而一個(gè)拷貝的轉(zhuǎn)錄因子僅需要 一個(gè)拷貝誘騙分子即能封阻轉(zhuǎn)錄因子的活性，因此相對(duì)而言，誘騙核酸藥的用量較反義核 酸和siRNA的用量將少1-2個(gè)數(shù)量級(jí)。值得注意的是，因誘騙核酸的核心序列一般在6-12個(gè)堿基對(duì)之間，鏈短易降解， 雙鏈不穩(wěn)定，常溫下易解鏈。而無二級(jí)空間結(jié)構(gòu)的誘騙核酸則不易與轉(zhuǎn)錄因子蛋白結(jié)合，因 此設(shè)計(jì)藥物時(shí)需要適當(dāng)增加堿基，加長鏈長，增強(qiáng)穩(wěn)定性及與轉(zhuǎn)錄因子的親和性，其中以回文結(jié)構(gòu)、發(fā)夾、十字、莖環(huán)和啞鈴狀等結(jié)構(gòu)最佳。本發(fā)明將靶向AP-I和Smads的誘騙核酸有 機(jī)融合成一個(gè)核酸分子，如此一定程度上增加了誘騙核酸的長度，且這種長度的增加并不 是為了增加誘騙核酸長度，進(jìn)而添加無效核酸序列，而是在增加長度的同時(shí)，賦予了誘騙核 酸的新功能。與若各自設(shè)計(jì)并合成AP-I和Smads的誘騙核酸，后將其混合成組合藥相比， 一方面減少了無效堿基的參入量，節(jié)約了藥物合成的成本。另一方面又能避免兩種誘騙核 酸間可能相互交錯(cuò)配對(duì)形成無效二聚體，而降低誘騙核酸的效用。另外，本發(fā)明在設(shè)計(jì)上 也充分考慮誘騙核酸的二級(jí)結(jié)構(gòu)及其穩(wěn)定性，因此誘騙核酸被設(shè)計(jì)成含有上述核心序列的 14-46堿基之間，可合成出單鏈，自交形成雙鏈及其二級(jí)結(jié)構(gòu)，也可各合成兩條單鏈，雜交形 成雙鏈。另外，因核酸在細(xì)胞內(nèi)極易被核酸酶降解失去活性，因此需修飾保護(hù)，以增強(qiáng)其抗 降解能力，提高穩(wěn)定性。硫代修飾為最常見的保護(hù)基團(tuán)。本發(fā)明的另一目的是提供一種含有本發(fā)明誘騙核酸藥物的藥物組合物。本發(fā)明的誘騙核酸藥物可以將其作為藥物活性成分制備成藥物組合物，該組合物 根據(jù)需要可以加入一些藥物可接受的藥用載體，制備成任何藥用的劑型。其中，所述藥物活 性成分占制劑總重量的0. 1-99. 9%，所述藥學(xué)上可接受的載體以重量計(jì)可以是制劑總重量 的0. 1-99. 9%。所述藥用載體包括生理鹽水等常用載體和緩沖液、脂質(zhì)體、聚合物等，可以 采用制劑學(xué)常規(guī)技術(shù)制備該組合物。本發(fā)明的組合物可以口服，也可以非胃腸道給藥，優(yōu)選 的組合物是單位劑量的納米型噴霧劑、注射劑和軟膏形式。本發(fā)明所述的靶向AP-I和Smad 的誘騙核酸藥物對(duì)纖維細(xì)胞的增殖、生長和胞外基質(zhì)分泌均有抑制作用，在制造抗瘢痕和 組織纖維化藥物中具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值及廣闊的市場(chǎng)前景。


圖1為ASCES系列誘騙核酸對(duì)TGF-1和TGF-2誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞的生長抑 制結(jié)果。圖2A為ELISA方法檢測(cè)ASCES系列誘騙核酸對(duì)AP-I與其順式作用元件結(jié)合競(jìng)爭 性抑制實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。圖2B為ELISA方法檢測(cè)ASCES系列誘騙核酸對(duì)Smad與其順式作用元件結(jié)合競(jìng)爭 性抑制實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。表1為流式細(xì)胞儀檢測(cè)ASCES系列誘騙核酸對(duì)TGF-I誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞細(xì)胞周期 影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表2為流式細(xì)胞儀檢測(cè)ASCES系列誘騙核酸對(duì)TGF-2誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞細(xì)胞周期 影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖3A熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)誘騙核酸對(duì)Ap-I反應(yīng)性熒光素酶報(bào)告基因表達(dá) 的抑制效應(yīng)。圖;3B熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)誘騙核酸對(duì)Ap-I反應(yīng)性熒光素酶報(bào)告基因表達(dá) 的抑制效應(yīng)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1、誘騙核酸藥物的制備和分析合成八種下述硫代誘騙核酸藥物:ASCES101A 序列2 ；ASCES101B 序列3 ；ASCES101C 序列 4 ；ASCES101D 序列 5 ；ASCES102A 序列 7 和序列 8 ；ASCES102B 序列 9 ； ASCES103A 序列 11 和序列 12 ；ASCES103B 序列 13。陰性對(duì)照序列正義5' -TGTGGTCATGTGGTCATGTGGTCA-3‘反義5, -TGACCACATGACCACATGACCACA-3‘AP-I 陽性對(duì)照序列5' -TGACGTCATGACGTCATGACGTCA-3‘Smad 陽性對(duì)照序列正義5 ‘ -ATGCAGACAATGCAGACAATGCAGACA-3 ‘反義5' -TGTCTGCATTGTCTGCATTGTCTGCAT-3‘應(yīng)用美國PE公司391型DNA合成儀，以亞磷酰胺固相合成法合成所設(shè)計(jì)的硫代誘 騙核酸。主要原料有四種二異丙基β -氰乙基亞磷酰胺單體腺苷(A)、鳥苷(G)、胞苷(C) 和胸苷(T)；四種控制孔徑玻璃粉(CPG)固相合成柱(A、G、C、T)。蓋帽試劑分別為乙酸酐/ 二甲基吡啶/四氫呋喃和1-甲基咪唑/四氫呋喃；硫代反應(yīng)試劑=Beaucage試劑/乙腈；脫 三苯甲基試劑三氯乙酸/ 二氯甲烷；液體溶劑乙腈和三氯甲烷。合成規(guī)模為100D。堿基 單體溶于無水乙腈中，濃度為100豪摩爾，其它試劑濃度及用量按照儀器操作手冊(cè)進(jìn)行。合 成過程由儀器程序自動(dòng)控制。合成產(chǎn)物置于裝有濃氨水的密封耐壓玻璃瓶中，于55°C 處理15小時(shí)，脫去核酸分子上各種堿基保護(hù)基團(tuán)和氨基保護(hù)基團(tuán)。脫保護(hù)結(jié)束后，揮發(fā)脫 去大部分氨氣，凍干得白色粉末狀粗制品，重溶于緩沖液中，用Wiarmacia Source 30 Q層 析及AKTA層析系統(tǒng)進(jìn)行純化。純化樣品經(jīng)G-15分子篩葡聚糖凝膠層析柱除鹽，后凍干得 到白色絮狀核酸純品，儲(chǔ)存于-20°C，并取少量樣品進(jìn)行純度和分子量分析。用毛細(xì)管電泳 法和高效液相層析法測(cè)其純度及分子量，要求純度均大于90%，DNA測(cè)序法測(cè)定序列完全 正確，核磁共振法測(cè)硫代化程度大于98. 5%。實(shí)施例2、八種ASCES系列誘騙核酸對(duì)L9W成纖維細(xì)胞的生長抑制復(fù)蘇并接種成纖維細(xì)胞于細(xì)胞培養(yǎng)瓶，在37°C、5 % CO2條件下，用含10 % FBS 的RPMI 1640完全培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞；待細(xì)胞匯合至70% -80%時(shí)，胰酶消化細(xì)胞，活細(xì)胞計(jì) 數(shù)后并將細(xì)胞濃度調(diào)整至2 X IO5個(gè)/ml ；于96孔板以每孔100 μ L細(xì)胞懸液接種細(xì)胞，培 養(yǎng)12小時(shí)；后更換成無血清培養(yǎng)液，將細(xì)胞隨機(jī)分成空白對(duì)照組、陽性對(duì)照組、陰性對(duì)照組 和八種ASCES藥物組，且每組設(shè)3復(fù)孔，其中空白對(duì)照組僅加入0. 6 μ 1/孔脂質(zhì)體，其余均 加入0. 6 μ 1/孔脂質(zhì)體和終濃度為IOOnM的不同誘騙核酸；轉(zhuǎn)染5小時(shí)后，更換成含10% FBS的RPMI 1640完全培養(yǎng)液100 μ L，同時(shí)加入終濃度5ng/ml的TGF- β 1或TGF- β 2誘導(dǎo) 細(xì)胞增殖，在37°C、5% CO2條件下培養(yǎng)72h ；每孔加入ATP提取液100 μ L，混勻后室溫下放 置30min，取50 μ L細(xì)胞提取液于檢測(cè)板中，加入熒光素_熒光素酶50 μ L，混勻后置于熒光 分析儀進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定每孔樣品的熒光值。并計(jì)算細(xì)胞生長抑制率，作為誘騙核酸抑制
細(xì)胞增殖的評(píng)價(jià)指標(biāo)，細(xì)胞生長抑制率=(空白對(duì)照組熒光值-藥物組熒光值)/空白對(duì)照 組熒光值。細(xì)胞生長抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，較隨機(jī)誘騙核酸相比，本發(fā)明的八種ASCES序列藥 物以及AP-I和Smad陽性對(duì)照誘騙核酸均對(duì)細(xì)胞的生長均有明顯的抑制作用，其中 ASCES102A和ASCES102B對(duì)細(xì)胞的生長的抑制作用最強(qiáng)，明顯強(qiáng)于AP-I和Smad陽性 對(duì)照誘騙核酸，見圖1。實(shí)施例3、ELISA方法檢測(cè)誘騙核酸對(duì)AP-1和Smad與其順式作用元件結(jié)合的競(jìng)爭 抑制實(shí)驗(yàn)
分別將IOpmol的ASCES系列藥物稀釋于30 μ 1完全結(jié)合緩沖液，并以每孔30 μ 1 量加入包被了 Ap-I或Smad順式作用元件的96孔酶聯(lián)板(購自美國Active Motif公司的 TransAM Transcription factor assay kits)中；再TPAi秀導(dǎo)的 K—562 細(xì)胞核才由 提物(針對(duì)Smad則用TGF-β 1誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞核抽提物)稀釋于20 μ 1完全結(jié)合緩 沖液中，后依次加入96孔酶聯(lián)板中混勻，室溫孵育lh。注以3復(fù)孔進(jìn)行各種樣品的檢測(cè)，實(shí) 驗(yàn)分組如下空白陰性對(duì)照僅加入不含ASCES藥物和細(xì)胞核抽提物的50μ 1完全結(jié)合緩沖 液；空白陽性對(duì)照則為加入不含ASCES藥物，只含5 μ g核抽提物的50 μ 1完全結(jié)合緩沖液； 陰性對(duì)照則為加入同等濃度陰性對(duì)照誘騙核酸和5 μ g細(xì)胞核抽提物的50 μ 1完全結(jié)合緩 沖液；陽性對(duì)照則為加入同等濃度陽性對(duì)照誘騙核酸和5μ g細(xì)胞核抽提物的50μ 1完全結(jié) 合緩沖液；實(shí)驗(yàn)組則為加入含IOpmol的ASCES系列藥物，以及5 μ g細(xì)胞核抽提物的50 μ 1 完全結(jié)合緩沖液。以200 μ 1/孔加入洗脫液洗滌3次，每次細(xì)化，去除洗滌液；以1 500 稀釋度用抗體結(jié)合緩沖液稀釋c-fos抗體或Smad3抗體，后以100 μ 1/孔加入稀釋的抗體， 室溫孵育Ih;再以200 μ 1/孔加入洗脫液洗滌3次，每次細(xì)化，去除洗滌液；以1 1000稀 釋度用抗體結(jié)合緩沖液稀釋羊抗兔IgG-HRP 二抗，后以100 μ 1/孔加入稀釋的二抗，室溫孵 育Ih ；再以200 μ 1/孔加入洗脫液洗滌4次，每次％iin，去除洗滌液；以100 μ 1/孔加入底 物反應(yīng)液，室溫孵育2-20min，待陽性對(duì)照液變深藍(lán)色后，以100 μ 1/孔加入終止液終止反 應(yīng)；于450nm和655nm雙波長檢測(cè)OD值。ASCES系列藥物對(duì)AP-1或Smad與其順式作用元 件結(jié)合的抑制百分?jǐn)?shù)計(jì)算公式為(空白陽性對(duì)照OD-ASCES藥物OD)/空白陽性對(duì)照0D。結(jié)果表明，與隨機(jī)誘騙核酸對(duì)照相比，本發(fā)明的ASCES系列誘騙藥物均能明顯抑 制AP-I的DNA結(jié)合活性。但對(duì)Smad的DNA結(jié)合活性的抑制作用，除ASCES102A和ASCES102B 外，本發(fā)明的其它誘騙核酸對(duì)Smad的DNA結(jié)合活性雖也有一定的抑制作用，但抑制效應(yīng)不 甚明顯，如圖2A和2B所示。實(shí)施例4、流式細(xì)胞儀檢測(cè)誘騙核酸對(duì)成纖維細(xì)胞細(xì)胞周期的影響將細(xì)胞以1\105個(gè)/平板接種于6011平板中，在371、5% CO2條件下，用含 10% FBS的RPMI 1640完全培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞12小時(shí)；后更換成無血清培養(yǎng)液，將細(xì)胞隨機(jī) 分成空白對(duì)照組、陽性對(duì)照組、隨機(jī)誘騙核酸對(duì)照組以及ASCES102A和ASCES102B藥物組， 且每組設(shè)3復(fù)孔，其中空白對(duì)照組僅加入12 μ 1/孔脂質(zhì)體，其余均加入12 μ 1/孔脂質(zhì)體和 終濃度為IOOnM的不同誘騙核酸；轉(zhuǎn)染5小時(shí)后，更換成含10% FBS的RPMI1640完全培養(yǎng) 液，同時(shí)加入終濃度5ng/ml的TGF-β 1或TGF-β 2誘導(dǎo)細(xì)胞，在37°C、5% CO2條件下培養(yǎng) 24h ；收獲細(xì)胞，300g離心5min，棄上清，后將細(xì)胞團(tuán)重懸于殘留液體中；緩慢滴加200 μ 1 70%的乙醇進(jìn)行細(xì)胞固定，在滴加乙醇的同時(shí)注意旋渦震蕩細(xì)胞。后將細(xì)胞于4°C放置 30min ；用2ml含2% BSA的PBS洗細(xì)胞一次，300g離心5min，棄上清，后將細(xì)胞團(tuán)重懸于殘 留液體中；于細(xì)胞懸液中加入0. 5ml的Pl/foiase溶液，混勻，分析前室溫孵育15min。最后 進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析。如表1和表2顯示，與隨機(jī)誘騙核酸相比，AP-I陽性誘騙核酸、Smad陽性誘騙核 酸、ASCES102A和ASCES102B藥物處理的細(xì)胞，無論是TGF- β 1還是TGF- β 2誘導(dǎo)細(xì)胞均被 明顯阻滯于S期，特別是對(duì)TGF-β 2誘導(dǎo)細(xì)胞阻滯效應(yīng)最為明顯。與AP-I和Smad的陽性 誘騙核酸相比，ASCES102A和ASCES102B藥物對(duì)細(xì)胞的阻滯效應(yīng)得到明顯的增強(qiáng)。相比較 而言，雖沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，ASCES102B藥物對(duì)細(xì)胞的阻滯效應(yīng)強(qiáng)于ASCES102A。
表1誘騙核酸對(duì)TGF-β 1誘導(dǎo)的細(xì)胞細(xì)胞周期的影響
權(quán)利要求
1.一種具有治療作用的核酸，其特征在于，所述核酸為包含既能與AP-I高親和結(jié)合的 AP-I順式作用元件，又能與Smad高親和結(jié)合的Smad順式作用元件的雙鏈誘騙寡核苷酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸，其特征在于，包括核心序列TGACXTCAGACA或 CAGACATGACXTCA或GTCTAGACTGACXTCA或其功能等價(jià)物，其中所述核苷酸序列中，X代表G 或者缺失。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的核酸，其特征在于，所述核心序列為TGACGTCAGACA或 TGACTCAGACA或其功能等價(jià)物；序列CAGACATGACGTCA或CAGACATGACTCA或其功能等價(jià)物； GTCTAGACTGACGTCA 或 GTCTAGACTGACTCA 或其功能等價(jià)物。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的核酸，其特征在于，所述核酸序列如下ASCES101A序列2 ； ASCES101B 序歹Ij 3 ；ASCES101C 序列 4 ；ASCES101D 序列 5 ；ASCES102A 序列 7 和序列 8 ； ASCES102B 序列 9 ；ASCES103A 序列 11 和序列 12 ；ASCES103B 序列 13。
5.權(quán)利要求1-3所述的任何一項(xiàng)核酸在制備抗AP-I和Smad轉(zhuǎn)錄活性的藥物中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述抗AP-I和Smad轉(zhuǎn)錄活性的藥物是治 療AP-I和Smad異常表達(dá)或活化引起的瘢痕化和組織纖維化相關(guān)疾病的藥物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述藥物是治療纖維化疾病、異常傷口愈 合、異常骨生成、免疫/炎癥相關(guān)疾病或抗青光眼濾過性手術(shù)后抗愈合的藥物。
8.一種含有權(quán)利要求1所述的核酸的藥物組合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的藥物組合物，其特征在于，含有藥物可接受的載體。
10.一種權(quán)利要求1所述的核酸的制備方法，其特征在于，使用DNA合成儀合成。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是涉及一種新型雙功能抗瘢痕和組織纖維化寡聚核苷酸藥物，所述核酸為包含既能與AP-1高親和結(jié)合的AP-1順式作用的元件，又能與Smad高親和結(jié)合的Smad順式作用的元件。
文檔編號(hào)C12N15/113GK102146411SQ201110001699
公開日2011年8月10日 申請(qǐng)日期2011年1月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月6日
發(fā)明者徐祥, 梁華平, 袁洪峰, 邢偉, 郭韡, 黃宏 申請(qǐng)人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院