一種利用絲素蛋白對(duì)dna保存的方法及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及DNA保存技術(shù)，尤其涉及一種利用絲素蛋白對(duì)DNA保存的方法及試劑盒；本發(fā)明的利用絲素蛋白對(duì)DNA保存的方法，包括以下步驟：S1、將絲素蛋白溶液添加至多孔基底中，然后干燥處理得到絲素蛋白涂層基底；S2、將待保存的目標(biāo)DNA制成DNA溶液，添加至絲素蛋白涂層基底中，然后干燥處理得到樣本基底；S3、向樣本基底中加入抽提液，抽提后得到目標(biāo)DNA；本發(fā)明的利用絲素蛋白對(duì)DNA保存的試劑盒，包括絲素蛋白溶液、多孔基底以及抽提液；本發(fā)明的利用絲素蛋白對(duì)DNA保存的方法及試劑盒，可快速保存DNA樣品，使其在高溫以及紫外線照射條件下保持分子結(jié)構(gòu)和功能的完整，并快速抽提DNA用于檢測(cè)，解決了目前DNA產(chǎn)品的保存只能在低溫及避光保存的難題。
【專利說(shuō)明】
-種利用竺素蛋白對(duì)DNA保存的方法及試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及DNA保存技術(shù)，尤其設(shè)及一種利用絲素蛋白對(duì)DNA保存的方法及試劑 盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 脫氧核糖核酸(DNA)是一種雙鏈結(jié)構(gòu)的分子，在生物細(xì)胞內(nèi)，DNA可與蛋白質(zhì)組成 染色體，構(gòu)成生物體遺傳密碼，指導(dǎo)生物體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成W及生命體的運(yùn)作。DNA被廣泛 應(yīng)用于物種研究、身份鑒別、醫(yī)學(xué)開(kāi)發(fā)等領(lǐng)域。但DNA極易受紫外、溫度、氧化劑、福射等的破 壞，使得DNA的保存和運(yùn)輸受到了很大的限制，進(jìn)而導(dǎo)致有關(guān)DNA研究和應(yīng)用上的不便。
[0003] 為了避免功能損傷，核酸樣品通常儲(chǔ)存在-80°C冰箱或液氮里(-196°C)。比如生物 學(xué)家通常用乙醇從生物樣本中抽提DNA，溶解在堿性(P冊(cè).5)緩沖液中并保存在低溫下，運(yùn) 是由于堿性環(huán)境可W抑制酸性依賴的DNA降解過(guò)程。但是，低溫保存DNA樣品給長(zhǎng)距離運(yùn)輸 帶來(lái)不便，并大大增加了運(yùn)輸和儲(chǔ)藏的成本。據(jù)美國(guó)相關(guān)部口的統(tǒng)計(jì)，全美國(guó)每年大約有3 億份人類核酸樣品需要儲(chǔ)藏保存，光購(gòu)買(mǎi)用于樣品儲(chǔ)存的冰箱就需要約1.2億美元的成本， 運(yùn)還不算日常的場(chǎng)地和耗電費(fèi)用。之前研究人員采用噴霧干燥、噴霧冷凍、冷凍干燥等方法 處理DNA樣品，用于常溫下長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)輸和儲(chǔ)藏DNA。雖然運(yùn)些方法都達(dá)到了一定的效果，但很 多研究同時(shí)指出對(duì)于長(zhǎng)鏈DNA分子而言，處理過(guò)程中采用的高剪切力會(huì)對(duì)DNA的天然螺旋結(jié) 構(gòu)產(chǎn)生破壞，導(dǎo)致DNA功能損傷。
[0004] 目前市面上現(xiàn)有的一些DNA存儲(chǔ)產(chǎn)品，F(xiàn)TATM card是一種W纖維素為基質(zhì)的濾紙， 在運(yùn)種纖維素基質(zhì)濾紙上添加了可W使細(xì)胞裂解W及使蛋白質(zhì)變性的化合物，通過(guò)運(yùn)些化 合物，該產(chǎn)品可W將細(xì)胞樣品中的細(xì)胞裂解，使DNA溢出W便保存。經(jīng)過(guò)FTATM card的保存， DNA可被長(zhǎng)途運(yùn)輸W及室溫下長(zhǎng)時(shí)間保存。但是，將DNA從運(yùn)種FTATM card中重新抽提出來(lái) 的步驟比較麻煩，需要用到一種特殊的DM抽提液才能將DM從濾紙中抽提出來(lái)。 Bioma化ica公司所生產(chǎn)的SampleMa化ix的主要作用成分則是能在極端環(huán)境中生存的節(jié)肢 動(dòng)物、郵等體內(nèi)提取的物質(zhì)，運(yùn)些極端生物能夠在干燥環(huán)境中存活長(zhǎng)達(dá)120年之久，基于從 運(yùn)些生物中提取的物質(zhì)的保護(hù)，SampleMatrix可W在高溫W及紫外破壞條件下保存DNA。但 是使用運(yùn)種產(chǎn)品前，DNA需經(jīng)過(guò)干燥處理，運(yùn)不利于運(yùn)種產(chǎn)品的大范圍使用。GenVault公司 所生產(chǎn)的GenTegra DNA保存產(chǎn)品則是一種內(nèi)置抗氧化保護(hù)和抗菌成分的惰性化學(xué)基質(zhì)。對(duì) 于GenTegra和SampleMa化ix運(yùn)兩種產(chǎn)品來(lái)說(shuō)，DNA均需要存儲(chǔ)在一種特質(zhì)的試管中，并且運(yùn) 兩種產(chǎn)品的主要作用成分均不易提取且價(jià)格昂貴，運(yùn)兩種產(chǎn)品每管存儲(chǔ)DNA的量有限 (30ug)。
[0005] 絲素蛋白是從天然蠶絲纖維中提取出來(lái)的天然蛋白質(zhì)，是由絲氨酸、丙氨酸、甘氨 酸等十八種氨基酸組成的。具有獨(dú)特的理化性能及良好的生物相容性。絲素蛋白廣泛應(yīng)用 于生物醫(yī)療、組織工程等領(lǐng)域。現(xiàn)已有人用絲素蛋白材料作為阿霉素、辣根過(guò)氧化氨酶、膜 島素等等藥物的保存載體，但尚未有用絲素蛋白材料對(duì)核酸類物質(zhì)進(jìn)行保存的研究。絲素 蛋白來(lái)源豐富，價(jià)格低廉，且絲素蛋白材料可被加工成多元化的材料W及具有可調(diào)控的二 級(jí)結(jié)構(gòu)，利用絲素蛋白材料保存DM使得DM在不同領(lǐng)域的應(yīng)用具有了更廣闊的可能性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供一種物料來(lái)源豐富、價(jià)格低廉、常溫下 即可實(shí)現(xiàn)、可快速保存DNA樣品并使其在高溫W及紫外線照射條件下保持分子結(jié)構(gòu)和功能 的完整性的利用絲素蛋白對(duì)DNA保存的方法及試劑盒。
[0007] 本發(fā)明第一方面提供一種利用絲素蛋白對(duì)DNA保存的方法，包括W下步驟：
[000引S1、將絲素蛋白溶液添加至多孔基底中，然后干燥處理得到絲素蛋白涂層基底；
[0009] S2、將待保存的目標(biāo)DNA制成DNA溶液，添加至絲素蛋白涂層基底中，然后干燥處理 得到樣本基底；
[0010] S3、向樣本基底中加入抽提液，抽提后得到目標(biāo)DNA。
[0011] 應(yīng)當(dāng)說(shuō)明的是，本發(fā)明中所指的"目標(biāo)DNA"，指的是從目的生物中提取出的欲進(jìn)行 保存的DNA樣品。"DNA"又稱去氧核糖核酸，是一種雙鏈結(jié)構(gòu)分子，由脫氧核糖核巧酸組成， 其可組成遺傳指令，引導(dǎo)生物發(fā)育與生命機(jī)能運(yùn)作。應(yīng)當(dāng)說(shuō)明的是，本發(fā)明中的"DNA"應(yīng)包 括但不限于單鏈DNA、閉環(huán)DNA、連接DNA、雙鏈DNA、互補(bǔ)DNA，其中，雙鏈DNA為通俗意義中的 真核生物的遺傳物質(zhì)，應(yīng)當(dāng)包括動(dòng)物、植物、真菌等的染色體DNA，W及線粒體、葉綠體等細(xì) 胞器中的DNA。
[0012] 另外，單鏈DNA(single-stranded DNA)大部分DNAW雙螺旋結(jié)構(gòu)存在，但一經(jīng)熱 或堿處理就會(huì)變?yōu)閱捂湢顟B(tài)。某些隧菌體粒子內(nèi)含有單鏈環(huán)狀的DNA，運(yùn)樣的隧菌體DNA在 細(xì)胞內(nèi)增殖時(shí)則形成雙鏈DNA。
[0013] 閉環(huán)DNA(closed circular DNA)沒(méi)有斷口的雙鏈環(huán)狀DNA，亦稱為超螺旋DNA。由 于具有螺旋結(jié)構(gòu)的雙鏈各自閉合，結(jié)果使整個(gè)DNA分子進(jìn)一步旋曲而形成=級(jí)結(jié)構(gòu)。另外如 果一條或二條鏈的不同部位上產(chǎn)生一個(gè)斷口，就會(huì)成為無(wú)旋曲的開(kāi)環(huán)DNA分子。從細(xì)胞中提 取出來(lái)的質(zhì)?；虿《綝NA都含有閉環(huán)和開(kāi)環(huán)運(yùn)二種分子。
[0014] 連接DNA化i址er DNA)，為核小體中除147bp核屯、DNA外的所有DNA。
[0015] 互補(bǔ)DNA(cDNA，complementary DNA):構(gòu)成基因的雙鏈DNA分子用一條單鏈作為模 板，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生與其序列互補(bǔ)的信使RNA分子，然后在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，WmRNA分子為模板， 合成一條與mRNA序列互補(bǔ)的單鏈DNA，最后再W單鏈DNA為模板合成另一條與其互補(bǔ)的單鏈 DNA，兩條互補(bǔ)的單鏈DNA分子組成一個(gè)雙鏈cDNA分子.因此，雙鏈cDNA分子的序列同轉(zhuǎn)錄產(chǎn) 生的mRNA分子的基因是相同的.所W-個(gè)cDNA分子就代表一個(gè)基因.但是cDNA仍不同于基 因，因?yàn)榛蛟谵D(zhuǎn)錄產(chǎn)生mRNA時(shí)，一些不編碼的序列即內(nèi)含子被刪除了，保留的只是編碼序 列，即外顯子.所WcDNA序列都比基因序列要短得多，因?yàn)閏DNA中不包括基因的非編碼序 列---內(nèi)含子。
[0016] 應(yīng)當(dāng)說(shuō)明的是，本發(fā)明所指的多孔基底，因具有較高比表面積，其作用在于，通過(guò) 多孔結(jié)構(gòu)，支撐和吸附絲素蛋白溶液中的有效成分W及DNA溶液中的有效成分，而加入抽提 液之后，又可實(shí)現(xiàn)纖維表面涂層的有效成分的快速分離。其種類應(yīng)當(dāng)包括但不限于多孔膜、 多孔非織造網(wǎng)、多孔纖維、發(fā)泡件等。多孔基底可包含一種或多種聚合物材料或天然纖維。
[0017] 所述聚合物材料可包括(但不限于)聚締控、聚(異戊二締）、聚(下二締）、氣化聚合 物、氯化聚合物、聚醋、聚酷胺、聚酷亞胺、聚酸、聚（酸諷）、聚諷、聚苯酸、聚（乙酸乙締醋）、 乙酸乙締醋的共聚物、聚憐臘、聚（乙締基醋）、聚（乙締基酸）、聚（乙締醇）w及聚(碳酸醋）。
[0018] 所述天然纖維包括植物纖維、動(dòng)物纖維、人造纖維、無(wú)機(jī)纖維等。其中，植物纖維主 要組成物質(zhì)是纖維素，是由植物上種巧、果實(shí)、莖、葉等處獲得的纖維;動(dòng)物纖維主要組成物 質(zhì)是蛋白質(zhì)，分為毛和腺分泌物兩類;人造纖維為用纖維素、蛋白質(zhì)等天然高分子物質(zhì)為原 料，經(jīng)化學(xué)加工、紡絲、后處理而制得的紡織纖維;無(wú)機(jī)纖維是W礦物質(zhì)為原料制成的纖維， 如玻璃纖維、金屬纖維等。
[0019] 合適的多孔基底可能具有各種形狀和大小，如膜狀、紙張、發(fā)泡件等。
[0020] 濾紙大多由棉質(zhì)纖維組成，其表面有無(wú)數(shù)小孔可供液體粒子通過(guò)，而體積較大的 固體粒子則不能通過(guò)，濾紙具有較好的固體粒子過(guò)濾、大分子吸附等功能，且生產(chǎn)成本較 低、獲取較為便捷。由于多孔基底所設(shè)及的材質(zhì)眾多，而濾紙具有前述優(yōu)勢(shì)，本發(fā)明中所述 的多孔基底優(yōu)選為濾紙，作為較為適宜的實(shí)施方式，并在本發(fā)明后續(xù)內(nèi)容中做進(jìn)一步說(shuō)明， 其它材質(zhì)的多孔基底不再寶述。然而應(yīng)當(dāng)說(shuō)明的是，凡是能夠?qū)崿F(xiàn)上述功能的多孔基底，均 應(yīng)落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0021] 進(jìn)一步的，所述步驟S2中的DNA溶液，與絲素蛋白溶液混合后再添加至絲素蛋白涂 層基底中。
[0022] 具體的，所述步驟S1和S2中的絲素蛋白溶液濃度范圍為1-30%。應(yīng)當(dāng)說(shuō)明的是，絲 素蛋白溶液制備完成后，通常濃度為7-8%，經(jīng)濃縮后可達(dá)30%，由于絲素蛋白溶液的濃度 在較大范圍內(nèi)，均體現(xiàn)出對(duì)DNA的保護(hù)效果，因此本發(fā)明中所述絲素蛋白溶液濃度范圍為1- 30%。
[0023] 具體的，所述絲素蛋白溶液的濃度范圍為3-6%。
[0024] 具體的，所述步驟S1中絲素蛋白溶液的濃度與步驟S2中絲素蛋白的濃度相等。
[0025] 進(jìn)一步的，所述步驟S2中的DNA溶液，與絲素蛋白溶液和T邸緩沖液混合后再添加 至絲素蛋白涂層基底中。T邸是一種凝膠電泳緩沖液。它具有良好的導(dǎo)電性并且有利于DNA 分子遷移。T肥是由抓TA、TrisW及棚酸所組成。實(shí)驗(yàn)表明T肥能夠幫助絲素蛋白材料更好的 保存DNA。
[00%]進(jìn)一步的，所述步驟S1中將絲素蛋白溶液添加至多孔基底中，然后干燥處理之后， 還包括甲醇、乙醇、丙醇或多元醇浸泡后干燥處理的步驟，W得到絲素蛋白涂層基底。多元 醇是指分子中含有=個(gè)或=個(gè)W上徑基的醇類，醇類的作用在于，誘導(dǎo)絲素蛋白的無(wú)規(guī)卷 曲（silk I)轉(zhuǎn)變?yōu)?-折疊 （silk II)，運(yùn)種轉(zhuǎn)變能夠減少材料的溶解性并能增加降解時(shí)間 和機(jī)械強(qiáng)度。由于甲醇的揮發(fā)性和蛋白變性能力較強(qiáng)，有利于浸泡后的干燥處理，在本發(fā)明 后續(xù)實(shí)施例中，優(yōu)選采用甲醇。
[0027] 應(yīng)當(dāng)說(shuō)明的是，本發(fā)明中所述的抽提液應(yīng)包括濃鹽法、陰離子去污劑發(fā)、苯酪抽提 法、水抽提法中所采用的各種試劑，例如各種緩沖液，如化is-HCl緩沖液、PBS緩沖液等，凡 是能夠?qū)崿F(xiàn)將DNA自多孔基底上抽提的抽提液，均應(yīng)落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。由于本發(fā)明的 目的在于保護(hù)已獲取的DNA樣品，步驟S3的抽提過(guò)程為二次抽提，其中雜質(zhì)成分較少，本發(fā) 明中優(yōu)選的抽提液為超純水、化is-HCl緩沖液、或PBS緩沖液。
[0028] 本發(fā)明第二方面提供一種利用絲素蛋白對(duì)DNA保存的試劑盒，包括絲素蛋白制劑 和多孔基底，所述絲素蛋白制劑包括絲素蛋白凍干粉、絲素蛋白溶液中的一種或多種，所述 多孔基底為不包含絲素蛋白的多孔基底、或經(jīng)過(guò)添加絲素蛋白溶液后干燥處理制得的絲素 蛋白涂層基底。
[0029] 應(yīng)當(dāng)說(shuō)明的是，本發(fā)明中所述的試劑盒，可W多種實(shí)現(xiàn)形式，1)絲素蛋白凍干粉+ 多孔基底，使用時(shí)將絲素蛋白凍干粉配制成絲素蛋白溶液，并將部分絲素蛋白溶液添加至 多孔基底然后干燥處理W備用；2)絲素蛋白溶液+多孔基底，使用時(shí)，將部分絲素蛋白溶液 添加至多孔基底然后干燥處理W備用；3)絲素蛋白溶液+絲素蛋白涂層基底，無(wú)需前期準(zhǔn)備 工作，直接使用即可。
[0030] 進(jìn)一步的，還包括甲醇、乙醇、丙醇或多元醇、或者所述多孔基底為經(jīng)過(guò)添加絲素 蛋白溶液后干燥處理并經(jīng)甲醇、乙醇、丙醇或多元醇浸泡后干燥處理的絲素蛋白涂層基底。 本發(fā)明中所述的試劑盒，可W在使用時(shí)自行添加甲醇等醇類后干燥處理，也可將絲素蛋白 涂層基底經(jīng)醇類浸泡后干燥處理后密封保存。
[0031] 進(jìn)一步的，還包括T邸緩沖液。
[0032] 進(jìn)一步的，所述絲素蛋白溶液濃度范圍為1-30%。
[0033] 具體的，所述絲素蛋白溶液的濃度范圍為3-6%。
[0034] 進(jìn)一步的，所述多孔基底為濾紙。
[0035] 進(jìn)一步的，還包括抽提液。本發(fā)明中所述試劑盒中的抽提液，應(yīng)包括濃鹽法、陰離 子去污劑法、苯酪抽提法、水抽提法中所采用的各種試劑，例如各種緩沖液，如化is-HCl緩 沖液、PBS緩沖液等，凡是能夠?qū)崿F(xiàn)將DNA自多孔基底上抽提的抽提液，均應(yīng)落入本發(fā)明的保 護(hù)范圍。由于本發(fā)明的目的在于保護(hù)已獲取的DNA樣品，抽提液的作用在于將多孔基底中的 DNA二次抽提出來(lái)，其中雜質(zhì)成分較少。因此本發(fā)明中所述的試劑盒，可W不包含抽提液，使 用時(shí)直接采用超純水，也可包含非超純水的其它抽提液，如化is-HCl緩沖液、PBS緩沖液等。
[0036] 借由上述方案，本發(fā)明至少具有W下優(yōu)點(diǎn):本發(fā)明的利用絲素蛋白對(duì)DNA保存的方 法，可快速保存DNA樣品，使其在高溫W及紫外線照射條件下保持分子結(jié)構(gòu)和功能的完整， 解決了目前DNA產(chǎn)品的保存只能在低溫(-20°C W下)及避光保存的難題。
[0037] 上述說(shuō)明僅是本發(fā)明技術(shù)方案的概述，為了能夠更清楚了解本發(fā)明的技術(shù)手段， 并可依照說(shuō)明書(shū)的內(nèi)容予W實(shí)施，W下W本發(fā)明的較佳實(shí)施例并配合附圖詳細(xì)說(shuō)明如后。
【附圖說(shuō)明】
[0038] 圖1是本發(fā)明第一實(shí)施例中絲素蛋白涂層濾紙對(duì)DNA保護(hù)效果的凝膠電泳圖；
[0039] 圖2是本發(fā)明第一實(shí)施例中絲素蛋白涂層濾紙對(duì)DNA保護(hù)效果的相對(duì)灰度值結(jié)果 圖；
[0040] 圖3是本發(fā)明第一實(shí)施例中DNA溶液直接滴加在甲醇處理后的絲素蛋白涂層濾紙 進(jìn)行處理后的相對(duì)灰度值結(jié)果圖；
[0041] 圖4是本發(fā)明第一實(shí)施例中DNA與絲素蛋白混合溶液滴加在甲醇處理后的絲素蛋 白涂層濾紙進(jìn)行處理后的凝膠電泳圖；
[0042] 圖5是本發(fā)明第一實(shí)施例中DNA與絲素蛋白混合溶液滴加在甲醇處理后的絲素蛋 白涂層濾紙進(jìn)行處理后的相對(duì)灰度值結(jié)果圖；
[0043] 圖6是本發(fā)明第一實(shí)施例中S種溫度下加入TOE對(duì)DNA保存效果影響的凝膠電泳 圖；
[0044] 圖7是本發(fā)明第一實(shí)施例中室溫下加入TBE對(duì)DNA保存效果影響的相對(duì)灰度值結(jié)果 圖；
[0045] 圖8是本發(fā)明第一實(shí)施例中37°C下加入TBE對(duì)DM保存效果影響的相對(duì)灰度值結(jié)果 圖；
[0046] 圖9是本發(fā)明第一實(shí)施例中45°C下加入TBE對(duì)DNA保存效果影響的相對(duì)灰度值結(jié)果 圖；
[0047] 圖10是本發(fā)明第二實(shí)施例中不同溫度和時(shí)間條件下絲素蛋白對(duì)DNA保存效果的凝 膠電泳圖；
[0048] 圖11是本發(fā)明第二實(shí)施例中室溫在不同時(shí)間下絲素蛋白對(duì)DNA保存效果的相對(duì)灰 度值對(duì)比結(jié)果圖；
[0049] 圖12是本發(fā)明第二實(shí)施例中37°C在不同時(shí)間下絲素蛋白對(duì)DNA保存效果的相對(duì)灰 度值對(duì)比結(jié)果圖；
[0050] 圖13是本發(fā)明第二實(shí)施例中45°C在不同時(shí)間下絲素蛋白對(duì)DNA保存效果的相對(duì)灰 度值對(duì)比結(jié)果圖；
[0051] 圖14是本發(fā)明第二實(shí)施例中各樣品經(jīng)高溫破壞后的PCR反應(yīng)的凝膠電泳圖；
[0052] 圖15是本發(fā)明第=實(shí)施例中=種濾紙樣品紫外照射不同時(shí)間后的凝膠電泳圖；
[0053] 圖16是本發(fā)明第=實(shí)施例中=種濾紙樣品紫外照射不同時(shí)間后的相對(duì)灰度值對(duì) 比結(jié)果圖；
[0054] 圖17是本發(fā)明第S實(shí)施例中各樣品經(jīng)紫外破壞后的PCR反應(yīng)的凝膠電泳圖。
【具體實(shí)施方式】
[0055] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)描述。W下實(shí)施 例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。
[0化6] 實(shí)施例一
[0057]本發(fā)明一較佳實(shí)施例提供一種利用絲素蛋白對(duì)DNA保存的方法，其所設(shè)及的實(shí)驗(yàn) 方法及實(shí)驗(yàn)對(duì)比結(jié)果具體如下：
[0化引1、實(shí)驗(yàn)方法
[0059] 1)再生絲素蛋白溶液的制備
[0060] 將30克家蠶生絲放入1化含有化20)3(2.12g/L)的沸水溶液中煮30分鐘，期間需要 不斷攬拌W提高脫膠率。隨后用去離子水磋洗煮好后的脫膠絲W去除殘余絲膠。將洗好后 的蠶絲蛋白纖維平鋪于通風(fēng)楓中通風(fēng)干燥。取25克干燥過(guò)后的蠶絲纖維溶于lOOmL的Li化 溶液中（9.3M)，隨后放入60°C烘箱中4小時(shí)，每小時(shí)用干凈玻璃棒輕輕攬動(dòng)溶液W確保蠶絲 纖維完全溶解。取出溶解后的溶液裝入分子截留量為3500的透析袋中用夾子夾緊，隨后將 透析袋放入不低于1:100比例的去離子水中透析36小時(shí)，去離子水每=小時(shí)換一次水。用高 速離屯、機(jī)W9000r/min的條件離屯、透析后的溶液20分鐘，重復(fù)一次離屯、過(guò)程后，獲得較干凈 的絲素蛋白溶液。絲素蛋白溶液可置于4 °C冰箱中保存。
[0061] 絲素蛋白溶液的濃度可W利用蒸發(fā)稱重法測(cè)定，具體操作如下：將干燥后的稱量 皿標(biāo)號(hào)后稱重為Wo(g)，加入ImL絲素蛋白溶液在稱量皿中，用電子天平稱重為Wi(g)，將稱量 皿放入60°C烘箱干燥6小時(shí)候后每隔20min稱重一次直至稱量皿重量不再改變時(shí)記錄數(shù)據(jù) 為W2(g)，依據(jù)W下公式可得到絲素蛋白溶液的濃度。
[0062] 濃度（％ ) = [ (W2-Wo)/(W廣Wo) ] X 100
[0063] 2) DM溶液的制備
[0064] 本發(fā)明所用總DM是從人成纖維細(xì)胞中提取而來(lái)，在提取DM前，需要將成纖維細(xì) 胞培養(yǎng)至=代W上W保證其細(xì)胞活力。細(xì)胞培養(yǎng)完成后需要用細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)算細(xì)胞數(shù)量， 估算出5xl06個(gè)細(xì)胞。依據(jù)DNA提取試劑盒使用手冊(cè)（e.Z.N.A Tissue DNA Kit，0MEGA，中 國(guó)），用20化LPBS緩沖液(4°C，pH = 7.4)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行吹打重懸，隨后向細(xì)胞懸液中加入25化 的細(xì)胞裂解酶使細(xì)胞裂解，用移液槍將細(xì)胞懸液吹打數(shù)次后置于65°C水浴鍋中解育五分鐘 W使細(xì)胞完全裂解。隨后向裂解后的混合液中加入22化L的化緩沖液并幹旋均勻后放入70 °(：的水浴鍋中解育十分鐘。待混合液冷卻到室溫后繼續(xù)加入22化L無(wú)水乙醇并W最大的速 度滿旋均勻，隨后將混合液移至DNA收集柱中（收集柱已經(jīng)與2mL收集管組合）。用8000巧m/ min的速度對(duì)收集柱進(jìn)行一分鐘離屯、。離屯、完成后丟棄下層收集管，向收集柱中繼續(xù)加入 500化洗脫緩沖液后W8000rpm/min離屯、一分鐘。隨后將收集柱轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的2mL離屯、管 中并滴加70化L DNA清洗緩沖液后繼續(xù)離屯、一分鐘。重復(fù)運(yùn)一過(guò)程后將收集柱轉(zhuǎn)移到一個(gè) 新的2mL離屯、管中，Wl2000xg/min的速度高速離屯、兩分鐘使得收集柱內(nèi)的乙醇完全揮發(fā)。 最后，在收集柱內(nèi)加入10化L經(jīng)過(guò)70°C預(yù)熱后的DNA洗脫液，用lOOOOxg/min的速度對(duì)收集柱 進(jìn)行離屯、，離屯、管中得到的溶液即為抽提出來(lái)的DNA，DNA溶液可放置于-20°C冰箱內(nèi)保存。
[0065] 3)從細(xì)胞中抽提DNA濃度W及質(zhì)量的確定
[0066] 從細(xì)胞中抽提出的DNA的濃度是由酶標(biāo)儀(Synergy H1，BioTek，美國(guó)）。測(cè)取260nm 和280皿的吸光度通過(guò)公式計(jì)算得來(lái)。DNA濃度主要由W下公式確定:c(ngAiL) =A260 X 50 X稀釋倍數(shù)。根據(jù)A260/A280的比值可W得到抽提DNA的純度，當(dāng)比值為1.7-1.9時(shí)，可認(rèn)為 DNA的純度在85%-95%范圍內(nèi)。0論的質(zhì)量主要是用基于目標(biāo)基因（2肥750)的？〔3^及 ZNF750基因測(cè)序兩個(gè)手段進(jìn)行評(píng)估。
[0067] 4)絲素蛋白涂層濾紙的制作及抽提
[0068] 首先將化學(xué)分析試紙(新星，杭州，中國(guó)）按照二十四孔板中孔徑尺寸剪成大小一 致的濾紙小圓片（直徑14mm)后，分別將運(yùn)些濾紙小圓片放入二十四孔細(xì)胞培養(yǎng)板中 (Corning cos化r，中國(guó)）。將絲素蛋白溶液分別稀釋成濃度為l%-30%(w/v)的工作濃度。 為了制作絲素蛋白涂層濾紙，需將10化1 1-30% (w/v)絲素蛋白溶液加入在二十四孔板中 的濾紙。隨后將所有樣品放入通風(fēng)楓中通風(fēng)干燥，待二十四孔板中濾紙干燥完全后每孔分 別加入10化1超純水并于常溫下解育5分鐘，用綴子擠壓二十四孔板中濾紙W抽提絲素蛋白 溶液。根據(jù)同等條件下獲得的絲素蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，用酶標(biāo)儀對(duì)含絲素蛋白的抽提溶液 進(jìn)行濃度測(cè)定(280nm)。本發(fā)明中定義絲素蛋白抽提回收率為：
[0069]
[0070] 5) DNA從絲素蛋白涂層濾紙中的抽提
[0071 ] DNA分子將會(huì)通過(guò)兩種方式嵌入絲素蛋白涂層濾紙:直接在絲素蛋白涂層濾紙中 加入DNAW及將絲素蛋白涂層濾紙進(jìn)行后處理后加入DNA。
[0072] 方法一:直接在絲素蛋白涂層濾紙中加入DNA溶液。將絲素蛋白溶液用超純水分別 稀釋成1、3、6 %，用超純水將從細(xì)胞中抽提出的DNA原始溶液稀釋成96ngAiL。將40化不同濃 度的絲素蛋白溶液與40化DNA溶液混合均勻后，將混合液加入到對(duì)應(yīng)的分別經(jīng) 不同濃度（1%-30%)絲素蛋白涂層的濾紙小圓片中。隨后將二十四孔板放入通風(fēng)楓中通風(fēng) 干燥，待二十四孔板中濾紙全部干燥完全后，每個(gè)樣品加入80化的超純水對(duì)DNA進(jìn)行抽提。 此種方法簡(jiǎn)稱為S i化/DNA+f i 11 er。
[0073] 方法二：用甲醇對(duì)經(jīng)絲素蛋白涂層的濾紙進(jìn)行后處理。向二十四孔板中的濾紙中 每孔加入1(K)化的不同濃度絲素蛋白溶液（1%-30%)，隨后將二十四孔板放入通風(fēng)楓通風(fēng) 干燥，待濾紙全部干燥完全后，每個(gè)樣品加入ImL甲醇浸泡兩小時(shí)后，繼續(xù)將二十四孔板放 入通風(fēng)楓通風(fēng)干燥。將DNA溶液(96ngAiL，4化L)分別注入上述經(jīng)過(guò)甲醇處理的絲素蛋白涂 層濾紙中。繼續(xù)將二十四孔板放入通風(fēng)楓中干燥，待所有樣品均干燥完全后，每個(gè)樣品中加 入80化超純水對(duì)DNA進(jìn)行抽提，對(duì)抽提液進(jìn)行后續(xù)凝膠電泳測(cè)試。本發(fā)明中簡(jiǎn)稱此種方法為 DNA+PT-mter。將DNA溶液（96ngAiL，40化）分別與不同濃度（1%-30%)的絲素蛋白溶液 (4化L)混合均勻，混合液分別注入經(jīng)上述甲醇處理過(guò)的對(duì)應(yīng)濃度絲素蛋白涂層濾紙中，待 所有樣品干燥后，每個(gè)樣品加入80化超純水對(duì)樣品中的DNA進(jìn)行抽提。本發(fā)明中簡(jiǎn)稱此種方 法為 S i 化/DNA+PT-f i 1 ter。
[0074] 6)利用TBE對(duì)DM保存進(jìn)行優(yōu)化
[0075] T邸是一種凝膠電泳緩沖液。它具有良好的導(dǎo)電性并且有利于DNA分子遷移。T邸是 由抓TA、TrisW及棚酸所組成。抓TA具有馨合儀離子的能力，能夠在DNA凝膠電泳過(guò)程中抑 審化魁酶的活性?；?3常用于配制生物緩沖液。將1義化13-6〇阿*6-抓14(1'肥）（抑=8.3)，絲 素蛋白溶液（3 %或6 % )和DNA溶液（96ng/化）按照體積比1:1:1混合均勻。將12化L 3 % si化/DNA/T邸混合液直接加入在濾紙中（簡(jiǎn)稱為3%silk/DNA/T邸+filter);將120化6% S i Ik/DNA/T肥混合液加入在經(jīng)甲醇處理過(guò)的6 %絲素蛋白涂層濾紙中（簡(jiǎn)稱為6 % si Ik/ DNA/T邸+PT-filter)。待所有樣品制作完畢，將所有樣品放入通風(fēng)楓中通風(fēng)干燥直至所有 樣品完全干燥。每個(gè)樣品中加入80化超純水后解育五分鐘，用綴子對(duì)每個(gè)樣品反復(fù)擠壓抽 提。收集每個(gè)樣品的抽提液后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
[0076] 7)凝膠電泳及基于凝膠電泳的定量分析
[0077] 用電子天平稱取0.8g的瓊脂糖溶于lOOmL的0.5xlYis-borate-抓TA(T?。┚彌_液 中，將溶液至于微波爐中高火加熱兩分鐘直至瓊脂糖全部融化于T邸緩沖液中，向加熱后的 TBE緩沖液中加入10化Gel RED(BIOTIUM)染色劑并搖晃均勻，將染色后的瓊脂糖緩沖液緩 緩倒入已經(jīng)調(diào)水平并插入制膠梳的制膠板中靜止1個(gè)小時(shí)待瓊脂糖溶液完全凝固后拔出制 膠梳，將制好的瓊脂糖膠板放入電泳儀器中。為了避免實(shí)驗(yàn)過(guò)程中造成的人為誤差，在每板 跑膠時(shí)均設(shè)置了一個(gè)控制組DNA樣品（96ngAiL，-80°C)。制膠完成后，每個(gè)膠孔上樣量為扣 L，所有樣品在上樣前應(yīng)與DNA loading buffer染色液按體積比為1:5混合均勻。凝膠電泳 時(shí)間為1.5小時(shí)，電壓為100V。待凝膠電泳完成后，輕輕的取出瓊脂糖膠板，將膠板置于暗室 中放在245nm的紫外燈下進(jìn)行拍照。得到凝膠電泳圖片后，用Image J軟件對(duì)照片進(jìn)行處理， 通過(guò)軟件的處理，可W得到每個(gè)條帶的灰度值，定義樣品相對(duì)灰度值W及樣品DNA抽提率如 下：
[007引
[0079] 2、實(shí)驗(yàn)對(duì)比結(jié)果
[0080] 1 )DNA從絲素蛋白濾紙中的抽提
[0081 ] 將40化DNA分別與40化不同濃度的絲素蛋白溶液（1、3、6% )混合均勻后，將S種 混合液分別滴加在二十四孔板中相對(duì)應(yīng)濃度（1、3、6%)的絲素蛋白涂層濾紙中，將二十四 孔板放置通風(fēng)楓于室溫下通風(fēng)干燥。待所有濾紙樣品均干燥完畢后，在每個(gè)樣品中加入80y L超純水并解育5分鐘，隨后用綴子對(duì)運(yùn)些濾紙樣品進(jìn)行擠壓抽提。用凝膠電泳的方法對(duì)抽 提液中的DNA進(jìn)行質(zhì)量W及半定量的分析評(píng)估。凝膠電泳結(jié)果如圖1所示，條帶1和2采用對(duì) 照組標(biāo)準(zhǔn)DNA(96ng/iiL);條帶3和4采用總DNA;條帶5和6采用l%silk/DNA;條帶7和8采用 3%si化/DNA;條帶9和10采用6%si化/DNA;其中，條帶3、5、7、9的樣品為經(jīng)濾紙?zhí)幚沓樘岷?的樣品凝膠電泳結(jié)果;條帶4、6、8、10為溶液樣品直接凝膠電泳結(jié)果。條帶灰度值對(duì)比結(jié)果 如圖2所示，圖中SF為silk簡(jiǎn)稱，W下各實(shí)施例相同，相對(duì)灰度值的計(jì)算為經(jīng)濾紙?zhí)幚沓樘?后的樣品灰度與溶液樣品灰度的比值。從圖1和圖2可知，含有1、3、6%絲素蛋白的濾紙樣品 抽提液經(jīng)凝膠電泳后可看到清晰無(wú)降解的條帶，而不含絲素蛋白的DNA濾紙樣品的條帶則 明顯弱于含絲素蛋白的DNA濾紙樣品。3%silk/DNA+filter和6%si化/DNA+filter樣品抽 提液的相對(duì)灰度值分別為0.9和0.7，顯著高于(p<0.05)DNA+f ilter樣品抽提率的灰度值。 W上結(jié)果表明絲素蛋白能夠在樣品制備W及抽提步驟中對(duì)DNA分子有保護(hù)作用。
[0082] 2)甲醇處理絲素蛋白涂層濾紙法保存DNA
[0083] 甲醇處理絲素蛋白能夠誘導(dǎo)絲素蛋白的無(wú)規(guī)卷曲（silk I)轉(zhuǎn)變?yōu)?-折疊 （silk II)，運(yùn)種轉(zhuǎn)變能夠減少材料的溶解性并能增加降解時(shí)間和機(jī)械強(qiáng)度。本實(shí)施例分別將DNA 和DNA/si化混合液滴加在經(jīng)過(guò)甲醇處理過(guò)的絲素蛋白涂層濾紙中（用1毫升的甲醇浸泡1、 3、6%絲素蛋白涂層濾紙2小時(shí)W誘導(dǎo)0-折疊的形成），做進(jìn)一步測(cè)試。
[0084] 將DNA溶液(96ng/山）不與絲素蛋白溶液混合，直接滴加在甲醇處理后的絲素蛋白 涂層濾紙（1、3、6%絲素蛋白處理）中，相對(duì)灰度值如圖3所示，可見(jiàn)隨著處理濾紙的絲素蛋 白濃度的提高，絲素蛋白對(duì)DNA的保護(hù)效果得到一定程度的提高，但是差異并不顯著。
[0085] 將DNA溶液(96ng Ail)與1、3、6 %絲素蛋白溶液混合，分別滴加在相應(yīng)濃度的經(jīng)甲 醇處理過(guò)的絲素蛋白涂層濾紙（1、3、6%絲素蛋白處理）中后，凝膠電泳結(jié)果和條帶灰度值 對(duì)比結(jié)果分別如圖4和圖5所示，圖4中，條帶1和2采用對(duì)照組標(biāo)準(zhǔn)DNA(96ngAiL);條帶3和4 采用總DNA;條帶5和6采用l%silk/DNA;條帶7和8采用3%silk/DNA;條帶9和10采用6% silk/DNA;其中，條帶3、5、7、9的樣品為經(jīng)濾紙?zhí)幚沓樘岷蟮臉悠纺z電泳結(jié)果;條帶4、6、 8、10為溶液樣品直接凝膠電泳結(jié)果。圖5中，相對(duì)灰度值的計(jì)算為經(jīng)濾紙?zhí)幚沓樘岷蟮臉悠?灰度與溶液樣品灰度的比值。從圖4和圖5可知，3%31化/0魁+?1'寸1116'和6%31化/0麻+ PT-f i 1 ter樣品抽提液與DNA+f i 1 ter樣品抽提液相比具有明顯更高的相對(duì)灰度值(0.8)。
[0086] 比較圖3和圖5,將絲素蛋白與DNA的混合液加入到經(jīng)甲醇處理過(guò)的絲素蛋白涂層 濾紙中，相比于直接將DNA滴加到經(jīng)甲醇處理的絲素蛋白涂層濾紙中，更加有利于DNA的保 存。
[0087] 基于W上抽提實(shí)驗(yàn)中，我們選擇了 W下兩種濾紙樣品制備方法來(lái)進(jìn)行后續(xù)的穩(wěn)定 性研究：（1) 3 % S i 化/DNA+f ilter;(2)6%si 化/DNA+PT-f i 11 er。
[0088] 3)T邸對(duì)DNA保存的影響
[0089] 本發(fā)明評(píng)估了在絲素蛋白/DM混合液中加入T肥對(duì)DNA保存的影響。所有樣品分別 放置于不同溫度中保存二十四小時(shí)后再進(jìn)行檢測(cè)。凝膠電泳結(jié)果如圖6所示，其中，條帶1和 5采用標(biāo)準(zhǔn)樣DNA(96ng/iiL)，條帶巧日6為DNA+filter，條帶3和7為3%31化/0臟+門(mén)11日'，條 帶4和8為6%silk/DNA+PT-filter，所有的濾紙樣品均用IxT邸緩沖液進(jìn)行抽提。在S種不 同存儲(chǔ)溫度下，含有T肥的樣品條帶明顯較不含TBE的樣品條帶更加清晰明亮。S種不同存 儲(chǔ)溫度(室溫、37°C、45°C)下條帶灰度值對(duì)比結(jié)果分別如圖7至9所示，例如，存儲(chǔ)在45°C中 的3 % S i化/DNA/T邸+f i 11 er樣品的相對(duì)灰度值達(dá)到了 0.7，而3 % S i化/DNA+f i 1 ter僅僅只 有0.1 (p<0.05)。綜合上述實(shí)驗(yàn)，TBE能夠幫助絲素蛋白材料更好的保存DM。
[0090] 實(shí)施例二
[0091] 本發(fā)明提供實(shí)施例一中利用絲素蛋白對(duì)DNA保存的方法，在不同溫度下對(duì)DNA穩(wěn)定 性的影響結(jié)果，其所設(shè)及的實(shí)驗(yàn)方法及實(shí)驗(yàn)對(duì)比結(jié)果具體如下：
[0092] 1、實(shí)驗(yàn)方法
[0093] 1)兩種DNA絲素蛋白濾紙膜的制備
[0094] W實(shí)施例一中的方法分別制作3%silk/DNA+filter樣品W及6%silk/DNA+PT- mter樣品。待所有濾紙樣品制作完畢后用真空封口機(jī)對(duì)所有樣品進(jìn)行真空封口。最后將 各樣品分別保存于室溫、37°C、W及45°C中。
[0095] 2)絲素蛋白DNA凍干粉的制備
[0096] 取40化DNA溶液分別與40化濃度為0、3、6 %的絲素蛋白溶液混合均勻，將S種溶 液放入液氮中冷凍。待所有樣品冷凍完成后，將樣品放入凍干機(jī)中進(jìn)行凍干。兩天后，待所 有樣品凍干完成后，取出所有樣品。
[0097] 3)PCR 反應(yīng)
[009 引上游引物：5'-4414機(jī)616(：(：1'(：此4666141'-3'（569 10^:1);下游引物：5'- GTACTTACCAGAGGTGGGCAGTG-3'（SEQIDN0:2);每個(gè)反應(yīng)包含W下體系：5化10xPCR Buffer、化L lOmM dNTPs、lU Taq酶、400nM上游引物、400nM下游引物、5化模板DNA、d地20。 每個(gè)反應(yīng)體系總體積為SOwLdPCR反應(yīng)主要如下表所示：
[0099] 表1 PCR反應(yīng)條件
[0100]
[0101] 4)切膠純化W及基因測(cè)序
[0102] 待PCR反應(yīng)產(chǎn)物凝膠電泳完成后，在紫外燈下小屯、地用小刀將含有條帶的凝膠切 下之后放入2mL離屯、管中。根據(jù)切出的凝膠重量，向離屯、管中加入3倍體積的溶膠緩沖液。將 離屯、管置于50°C水浴鍋中解育10分鐘直至凝膠全部溶解。隨后將離屯、管中的溶液轉(zhuǎn)移至切 膠純化試劑盒提供的吸附柱中，用緩沖液反復(fù)沖洗吸附柱W去除雜質(zhì)。待雜質(zhì)去除完全之 后用50化洗脫液抽提DNA。將抽提純化后的DNA送至測(cè)序公司測(cè)序檢測(cè)(金維智，蘇州）。待測(cè) 序檢測(cè)完畢后，用NCBI基因庫(kù)比對(duì)測(cè)序結(jié)果與ZNF750基因。
[0103] 2、實(shí)驗(yàn)對(duì)比結(jié)果
[0104] 1)基于凝膠電泳分析的DNA穩(wěn)定性分析
[0105] 按照不同方法將DNA保持在絲素蛋白涂層濾紙中，在特定時(shí)間取出后每個(gè)樣品加 入80化超純水進(jìn)行抽提，將抽提后的溶液進(jìn)行凝膠電泳成像。如圖10所示，圖中條帶1、4、7 為DNA濾紙樣品；條帶2、5、8為3 % si 化/DNA+f i 1 ter;條帶3、6、9為6 % si 化/DNA+PT-f i 1 ter， 圖11至圖13為根據(jù)圖10中各條帶灰度計(jì)算出的不同溫度下（室溫、37°C、45°C)在不同時(shí)間 (3天、10天、40天）的相對(duì)灰度值結(jié)果，由圖10-13可知，不含絲素蛋白的DNA對(duì)照樣在濾紙中 降解迅速。在相同溫度、相同時(shí)間條件下，6 % S i化/DNA+PT-f i 1 ter組樣品與3 % S i lk/DNA+ f iIter和對(duì)照組相比，具有更好的保存DNA的效果，例如，37°C時(shí)，6%silk/DNA+PT-f iIter 組樣品依然有清晰條帶，其相對(duì)灰度值為0.4，明顯高于3 % si Ik/DNA+fi Iter (0.3)和對(duì)照 組(0.1)。
[0106] 2)經(jīng)絲素蛋白保存的DM的PCR反應(yīng)
[0107] Zinc finger protein 750(ZNF750)即鋒指蛋白750基因，其通過(guò)抑制原始基因而 誘導(dǎo)分化基因來(lái)控制上皮內(nèi)穩(wěn)態(tài)，該基因的突變可能引起癌癥或是牛皮癖。本發(fā)明對(duì) ZNF750基因（53化p)PCR擴(kuò)增反應(yīng)W驗(yàn)證經(jīng)絲素蛋白保存過(guò)的DNA的活性。
[0108] 如圖14所示，各條帶采用的樣品為:條帶1為DNA ladder,條帶2為存儲(chǔ)于-80°C的 控制組DNA(96ng/化）；條帶3為DNA+filter;條帶4為3%Silk/DNA+filter，條帶5為6% Si化/DNA+PT-f i 1 ter，條帶6為DNA凍干粉;條帶7為3 % Si化/DNA凍干粉，條帶8為6 % Si Ik/ DNA凍干粉。所有濾紙樣品及凍干粉樣品均在45°C條件下保存二十四小時(shí)后進(jìn)行抽提，抽提 液進(jìn)行ZNF750基因的PCR反應(yīng)。由圖可見(jiàn)，對(duì)照組DNA溶液在進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)后在500bp左 右可見(jiàn)清晰明亮的條帶。但是在經(jīng)過(guò)45°C高溫作用二十四小時(shí)后，條帶3的DNA濾紙樣品條 帶亮度明顯下降。條帶4和5的含有絲素蛋白的3%silk/DNA+filter和6%Silk/DNA+PT- filter樣品均在5(K)bp處有清晰明亮條帶，且條帶強(qiáng)度明顯高于DNA濾紙樣品。同樣的，將絲 素蛋白DNA混合液進(jìn)行凍干后所得到的PCR反應(yīng)條帶在50化P處也有清晰明亮的條帶并且條 帶亮度均比DNA濾紙組樣品條帶高?；赪上結(jié)果，經(jīng)由絲素蛋白保存的DNA在高溫破壞后 依然可W在PCR反應(yīng)中當(dāng)作模板DNA。
[0109] 本發(fā)明將上述PCR產(chǎn)物所得到的DNA進(jìn)行測(cè)序得到的測(cè)序結(jié)果與NCBI中ZNF750基 因序列做比對(duì)可W得到基因一致性與差異結(jié)果。在溶液樣品中，DNA樣品W及3%silk/DNA 樣品的基因一致性達(dá)到了 99%，運(yùn)表明了圖14中所獲得的PCR產(chǎn)物正是ZNF750基因擴(kuò)增產(chǎn) 物。并且絲素蛋白的存在不會(huì)影響PCR過(guò)程W及基因測(cè)序。3 % S i化/DNA和6 % S i化/DNA+PT- fi 1 ter濾紙樣品在經(jīng)過(guò)45 °C高溫破壞二十四小時(shí)后，仍然具有與ZNF750基因大于99 %的一 致性，運(yùn)個(gè)結(jié)果表明了經(jīng)由絲素蛋白保存的DNA即使是在高溫下也能夠較好的保存DNA使其 能夠作為PCR反應(yīng)的模板。同時(shí)，S種凍干粉樣品（DNA，3 % S i 1 k/DNA，6 % S i 1 k/DNA)作為對(duì) 照，其結(jié)果表明均與ZNF750基因有99%的一致性。與經(jīng)絲素蛋白濾紙保存的DNA相比，凍干 雖然也能在一定程度上在高溫環(huán)境下保存DNA，但經(jīng)凍干保存的DNA質(zhì)量并沒(méi)有明顯高于絲 素蛋白濾紙法，且制作凍干粉需要用到特殊的設(shè)備(凍干機(jī)），制備時(shí)間也相對(duì)較長(zhǎng)。
[0110] 表2各方法對(duì)DNA保存效果的PCR檢測(cè)結(jié)果表
[0111]
[0112] 實(shí)施例S
[0113] 本發(fā)明提供實(shí)施例一中利用絲素蛋白對(duì)DNA保存的方法，在紫外光照射下對(duì)DNA穩(wěn) 定性的影響結(jié)果，其所設(shè)及的實(shí)驗(yàn)方法及實(shí)驗(yàn)對(duì)比結(jié)果具體如下：
[0114] 1、實(shí)驗(yàn)方法
[0115] 本實(shí)施例所設(shè)及到的實(shí)驗(yàn)方法，如再生絲素蛋白溶液的制備、DNA溶液的制備、凝 膠電泳及基于凝膠電泳的定量分析、PCR反應(yīng)、切膠純化W及基因測(cè)序、W及絲素蛋白DNA凍 干粉的制備，與實(shí)施例一和二相同，不再寶述。本實(shí)施例設(shè)及兩種DNA絲素蛋白濾紙膜的制 備，其方法如下：
[0116] 制作3%51化/0麻+門(mén)116'樣品^及6%51化/0麻+?1'寸1116'樣品。分別將0麻+ Fi 1 ter、3 % Si 化/DNA+f i 1 ter和6 % Si 化/DNA+PT-f i 1 ter樣品放置于紫外燈(245nm)下分別 照射1、2、10小時(shí)。
[0117] 2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0118] 1)基于凝膠電泳成像的DNA穩(wěn)定性分析
[0119] 將 S 種濾紙樣品（DNA+filter，3%Si 化/DNA+filter，6%Si化/DNA+PT-filter)放 置于紫外燈(245nm)下分別照射1、2、10小時(shí)，待照射完畢后取出所有濾紙樣品用超純水對(duì) 每個(gè)濾紙樣品進(jìn)行抽提。如圖15所示，條帶1、5、9為存儲(chǔ)于-80°C的控制組DNA(96ngAiL)，條 帶2、6、10為 DNA+filter，條帶3、7、11為3%Si 化/DNA+filter，條帶4、8、12為6%Silk/DNA+ PT-filter，由圖可知，對(duì)照組DNA濾紙樣品在紫外照射一小時(shí)后就已經(jīng)完全降解，而3% Silk/DNA+filter和6%Silk/DNA+PT-filter即使是在兩小時(shí)的紫外照射后依然有較清晰 的條帶。6%Si化/DNA+PT-filter在經(jīng)過(guò)10小時(shí)的紫外照射后依然有一定的條帶。如圖16所 示，根據(jù)凝膠電泳圖所計(jì)算出的相對(duì)灰度值也說(shuō)明了相同的趨勢(shì)，6%Si化/DNA+PT-filter 相比較3 % Si Ik/DNA+fi 1 ter和DNA濾紙樣品在所有的時(shí)間點(diǎn)都有更加高的相對(duì)灰度值。因 此，與高溫條件下DNA的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)一致，絲素蛋白能夠更好的在紫外破壞下保存DNA。
[0120] 2)經(jīng)絲素蛋白保存的DNA的PCR反應(yīng)
[0121] 所有樣品經(jīng)紫外照射兩小時(shí)后加超純水進(jìn)行抽提，對(duì)抽提液進(jìn)行ZNF750基因 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)。如圖17所示，條帶1-8分別為DNA ladder、存儲(chǔ)于-80°C的控制組DNA(96ng/iiL)、 DNA+f i 1 ter、3 % Si 化/DNA+f i 1 ter、6 % Si 1 k/DNA+PT-f i 1 ter、DM凍干粉、3 % Si 1 k/DNA凍干 粉、W及6%Si化/DNA凍干粉。由圖可知，控制組樣品（未經(jīng)紫外照射的DNA溶液）、6%Silk/ DNA+PT-f i Iter、DNA凍干粉、3 % Si化/DM凍干粉、6 % Si化/DM凍干粉在紫外破壞兩小時(shí)后 均能在50化p左右處出現(xiàn)清晰明亮的條帶，3%Silk/DNA+filter在紫外破壞兩小時(shí)后具有 微弱的條帶。運(yùn)表明絲素蛋白W及凍干粉樣品均能在紫外破壞下對(duì)DNA起到保護(hù)作用，經(jīng)運(yùn) 些樣品保存的DNA能夠用于PCR反應(yīng)。
[0122] 將W上所有PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用膠純化試劑盒進(jìn)行純化抽提后進(jìn)行ZNF750基因測(cè)序。 待得到所有樣品的測(cè)序結(jié)果后與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)可得到基因一致率(identity)與基 因缺失數(shù)(gaps)。結(jié)果如表3所示，所有能從圖17中看到清晰條帶的樣品的基因比對(duì)一致率 均在99% W上，基因缺失數(shù)為1或2。研究表明絲素蛋白因其含有豐富的絡(luò)氨酸而具有吸收 紫外線的功能，能夠在一定范圍紫外破壞下保護(hù)DNA。
[0123] 表3紫外破壞下樣品基因測(cè)序的一致性和基因缺失數(shù)
[0124]
[0125] W上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，并不用于限制本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技 術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可W做出若干改進(jìn)和 變型，運(yùn)些改進(jìn)和變型也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種利用絲素蛋白對(duì)DNA保存的方法，其特征在于:包括以下步驟： 51、 將絲素蛋白溶液添加至多孔基底中，然后干燥處理得到絲素蛋白涂層基底； 52、 將待保存的目標(biāo)DNA制成DNA溶液，添加至絲素蛋白涂層基底中，然后干燥處理得到 樣本基底； 53、 向樣本基底中加入抽提液，抽提后得到目標(biāo)DNA。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用絲素蛋白對(duì)DNA保存的方法，其特征在于:所述步驟S2中 的DNA溶液，與絲素蛋白溶液混合后再添加至絲素蛋白涂層基底中。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用絲素蛋白對(duì)DNA保存的方法，其特征在于:所述步驟S1和 S2中的絲素蛋白溶液濃度范圍為1 -30 %。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的利用絲素蛋白對(duì)DNA保存的方法，其特征在于:所述絲素蛋白 溶液的濃度范圍為3-6 %。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用絲素蛋白對(duì)DNA保存的方法，其特征在于:所述步驟S2中 的DNA溶液，與絲素蛋白溶液和TBE緩沖液混合后再添加至絲素蛋白涂層基底中。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用絲素蛋白對(duì)DNA保存的方法，其特征在于:所述步驟S1中 將絲素蛋白溶液添加至多孔基底中，然后干燥處理之后，還包括甲醇浸泡后干燥處理的步 驟，以得到絲素蛋白涂層基底。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用絲素蛋白對(duì)DNA保存的方法，其特征在于:所述抽提液為 超純水、Tr is-HCl緩沖液、或PBS緩沖液。8. -種利用絲素蛋白對(duì)DNA保存的試劑盒，其特征在于：包括絲素蛋白制劑和多孔基 底，所述絲素蛋白制劑包括絲素蛋白凍干粉、絲素蛋白溶液中的一種或多種，所述多孔基底 為不包含絲素蛋白的多孔基底、或經(jīng)過(guò)添加絲素蛋白溶液后干燥處理制得的絲素蛋白涂層 基底。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的利用絲素蛋白對(duì)DNA保存的試劑盒，其特征在于:還包括甲醇、 乙醇、丙醇或多元醇、或者所述多孔基底為經(jīng)過(guò)添加絲素蛋白溶液后干燥處理并經(jīng)甲醇、乙 醇、丙醇或多元醇浸泡后干燥處理的絲素蛋白涂層基底。10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的利用絲素蛋白對(duì)DNA保存的試劑盒，其特征在于:還包括TBE 緩沖液。
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK106047859SQ201610388202
【公開(kāi)日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年6月2日
【發(fā)明人】王曉沁, 劉雅文
【申請(qǐng)人】蘇州大學(xué)