專利名稱：一種絲素蛋白納米球的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種有機(jī)高分子納米球的制備方法，特別涉及一種用蠶絲絲素蛋白為原料制備納米顆粒的制備方法，屬生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
近年來，隨著生物技術(shù)和基因工程的發(fā)展，越來越多的生物活性物質(zhì)如蛋白質(zhì)、酶有望用于疾病治療。然而，由于蛋白質(zhì)、多肽類藥物口服后在腸道中易降解，靜脈注射體內(nèi)循環(huán)時間短、生物半衰期短，大大制約了其應(yīng)用。為解決這些問題，出現(xiàn)了各種蛋白質(zhì)類藥物劑型，包括水凝膠、納米球、微球、脂質(zhì)復(fù)合物的脂質(zhì)體、固體脂質(zhì)納米粒、油包水型乳劑等。以生物可降解材料制備微球?yàn)檩d體，將生物活性物質(zhì)固定化后，轉(zhuǎn)運(yùn)到特定部位，以預(yù)定的速率和劑量發(fā)揮作用。與其他緩控釋系統(tǒng)相比，微球具有制備較簡單、穩(wěn)定性好、成本低等特點(diǎn)，已成為近年來研究的熱點(diǎn)。蠶絲蛋白是由蠶絹絲腺內(nèi)壁上的內(nèi)皮細(xì)胞分泌的高純度蛋白質(zhì)，由乙氨酸、丙氨酸、絲氨酸等20種氨基酸組成，具有良好的生物相容性和優(yōu)良的理化性能且可被生物降解。在非紡織領(lǐng)域，家蠶絲素纖維已長期用作外科手術(shù)縫合線。近年來，將絲素蛋白應(yīng)用于人工皮膚、人工血管、人工骨、藥物緩釋載體以及酶固定材料的大量研究結(jié)果表明，絲素蛋白材料無毒性、無刺激作用，無免疫原性，是一種應(yīng)用前景廣闊的生物材料。將絲素蛋白制備成微球用以生物活性物質(zhì)的裝載，緩釋給藥前景廣闊。本發(fā)明之前中國發(fā)明專利(CN1243059C)中，公開了一種納米絲素顆粒的制造方法。通過向絲素蛋白溶液中加入甲醇、乙醇等變性劑，使絲素蛋白變性沉淀，得到納米絲素蛋白微文獻(xiàn)"The preparation of regenerated silk fibroin microspheres" ([J] Soft Matter, 2007, 3，910 - 915)中報道了絲素蛋白納米微球的制備方法，同樣使用了乙酉享變t生齊LU 文獻(xiàn)"SiIk nanospheres and microspheres from silk/pva blend films for drug delivery" ([J]Biomaterials, 31 (2010) 1025 - 1035)利用 PVA/絲素相分離技術(shù)制備幾百納米到幾十微米的絲素蛋白微球，需要溶解去除PVA以及仍然需要變性劑甲酉享使絲素蛋白不溶于水。文獻(xiàn)"SiIk microspheres for encapsulation and controlled release" (Journal of Controlled Release 117 (2007) 360 - 370)利用 DOPC 形成乳液， 同樣需要變性劑甲醇使絲素蛋白不溶于水。中國發(fā)明專利(CN201244277B)采用水/油/ 水型的復(fù)乳技術(shù)制備結(jié)晶性絲素微粒，該微球平均直徑為5. 84 86. 27微米；由于制備過程中的微球粘連，造成顆粒較大，無法達(dá)到納米級，此外，也需要加入變性劑。上述文獻(xiàn)所公開的技術(shù)方案中，都需要使用變性劑以使絲素蛋白不溶于水，由于變性劑的使用，可能造成生物相容性的降低以及其他生物活性分子的失活，因此難以用于生物活性分子的裝載。JC "Simple preparation and characteristics of silk fibroin microsphere" ([J]European Polymer Journal 39 (2003) 1195 - 1199)報道了采用噴霧干燥法制備平均直徑2微米的絲素蛋白微球，該微球形狀不規(guī)則，經(jīng)歷了 85°C較高溫度的處理，也可能造成生物分子的活性的損失。中國發(fā)明專利(CN 10197M81A)中，公開了一種絲素蛋白微載體及其制備方法，其制備的絲素蛋白微球直徑在100 500 μπι，未達(dá)到納米級，并且使用了化學(xué)交聯(lián)劑EDC來交聯(lián)絲素蛋白以使其不溶于水，可能造成生物分子的活性損失。中國發(fā)明專利(CN1293952A)中，公開了殼聚糖與絲心蛋白共混制備微球的方法， 同樣使用了化學(xué)交聯(lián)劑戊二醛，而戊二醛的交聯(lián)作用，也可能造成生物分子的活性損失。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種工藝簡單、產(chǎn)量較高，且產(chǎn)品直徑小、粒徑分布均勻、分散性好、不容易粘連、具有生物相容性的絲素蛋白納米球的制備方法。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是提供一種絲素蛋白納米球的制備方法，將蠶絲進(jìn)行脫膠、溶解、透析處理后得到濃度為1 10 Wt %的絲素蛋白溶液，再進(jìn)行如下步驟的加工
(1)以環(huán)己烷為溶劑，加入乳化劑司班，司班加入量為環(huán)己烷的0.01 5wt %，攪拌溶解后得到環(huán)己烷/司班混合溶液；
(2)在絲素蛋白溶液中加入多元醇，多元醇加入量為絲素蛋白質(zhì)量的1 60wt %，得到絲素蛋白/多元醇混合溶液；
(3)在攪拌和超聲波震蕩條件下，將絲素蛋白/多元醇混合溶液逐滴滴加到環(huán)己烷/司班混合溶液中，滴加完畢后，繼續(xù)處理10 IOOmin ；
(4)在攪拌和超聲波震蕩條件下，加入高吸水性樹脂，原位吸水干燥固化；
(5)過濾去除吸過水的高吸水性樹脂；
(6)離心分離，上層環(huán)己烷回收利用，得到下層絲素蛋白納米顆粒；
(7)對絲素蛋白納米顆粒進(jìn)行水洗，再經(jīng)超聲波分散，離心去除水洗液，得到下層固體； 重復(fù)本步驟3 5次；
(8)在下層固體中加入純水，進(jìn)行超聲波分散，得到絲素蛋白納米球的分散液；或進(jìn)行冷凍干燥，得到粉末狀的絲素蛋白納米球，所述絲素蛋白納米球的直徑為10 lOOOnm。上述的多元醇類為乙二醇、1，3-丙二醇、2，3-丙二醇、1，4- 丁二醇、1，2_ 丁二醇、 1，3- 丁二醇、2，3- 丁二醇、一縮二乙二醇、二縮三乙二醇、丙三醇、1，2，4- 丁三醇、赤蘚糖醇、蘇阿糖醇、季戊四醇、環(huán)戊五醇、木糖醇、來蘇糖醇、核糖醇、阿拉伯糖醇、環(huán)己六醇、山梨醇、阿洛糖醇、阿卓糖醇、葡萄糖醇、甘露醇、古洛糖醇、艾杜糖醇、半乳糖醇、太羅糖醇或果糖醇中的一種，或它們中的幾種。上述步驟(4)中的高吸水性樹脂的總加入量為絲素蛋白溶液質(zhì)量的1 50 wt %， 分成2 10次分別加入。本發(fā)明采用超聲波反相微乳液原位干燥法，制備絲素蛋白納米球。利用反相乳液法使絲素蛋白溶液分散成納米液滴，通過超聲波以及加入多元醇的方法，促使納米液滴中的絲素蛋白形成不溶于水的結(jié)構(gòu)，然后加入高吸水性樹脂，利用其超強(qiáng)吸水能力原位干燥絲素蛋白納米液滴，使絲素蛋白在微乳液的狀態(tài)下干燥固化，避免其后的干燥過程中的納米顆粒的相互連接。本發(fā)明技術(shù)方案依據(jù)的主要原理如下
1、絲素蛋白超細(xì)納米微乳液的形成技術(shù)利用攪拌使絲素蛋白溶液在低粘度有機(jī)相中，在表面活性劑作用下分散成微乳液，再利用超聲波震蕩使之分散成超細(xì)納米微乳液。2、絲素蛋白超聲波原位促凝技術(shù)的原理是利用超聲波空化產(chǎn)生高剪切應(yīng)力，從
4而使絲素蛋白在剪切作用下相互聚集成不溶于水的規(guī)整結(jié)構(gòu)。3、多元醇致使絲素蛋白不溶化技術(shù)的原理是利用多元醇與絲素蛋白之間的氫鍵結(jié)合，促使絲素蛋白相互靠攏聚集，降低絲素蛋白的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，使絲素蛋白鏈段容易運(yùn)動，以形成規(guī)整的熱力學(xué)穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。4、高吸水樹脂原位固化技術(shù)的原理是利用高吸水性樹脂的高滲透壓吸走絲素蛋白溶液中低滲透壓的水，從而使絲素蛋白逐漸脫水收縮成型，形成圓形的納米顆粒。納米顆粒的成形與吸水收縮過程有關(guān)，因此需要有一個合適的高吸水樹脂加入速度才能得到圓形的納米顆粒，加入速度過快則納米顆粒收縮不均勻，得到不規(guī)則的納米球；加入速度過慢則造成納米顆粒收縮時的粘度增加，相互粘連成大顆粒絲素蛋白球。由于采用了上述技術(shù)方案，與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明具有以下顯著的優(yōu)點(diǎn)
1、本發(fā)明提供的超聲波反相微乳液原位干燥法制備絲素蛋白納米球，工藝簡單、微球產(chǎn)量較高、粒徑分布均勻并且尺寸可控，方便選擇最適合的微球大小用于載藥等應(yīng)用，制備過程為常溫常壓的溫和過程，避免了化學(xué)交聯(lián)劑或者甲醇、乙醇等變性劑的使用，能夠保持絲素蛋白的生物相容性，是一種制備絲素蛋白納米微球的新方法。2、采用密度低、粘度小的環(huán)己烷作為有機(jī)相制備反相乳液，避免采用石蠟或者植物油類粘度大的有機(jī)相，使攪拌時容易形成更小直徑的微乳液，從而獲得納米級的絲素蛋白微球。3、采用促使絲素蛋白結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變的無毒多元醇類，避免采用有毒的化學(xué)交聯(lián)劑，或者甲醇、乙醇等蛋白質(zhì)變性劑，能夠保持絲素蛋白的生物相容性。4、采用超聲波震蕩促凝的方法，使絲素蛋白發(fā)生物理交聯(lián)，形成不溶于水的納米顆粒，避免了有毒化學(xué)交聯(lián)劑或者化學(xué)變性劑的使用。5、采用高吸水性樹脂，在微乳液的狀態(tài)下原位干燥，從而能夠保持絲素蛋白在微乳液的納米狀態(tài)，避免其后干燥過程中的相互粘連。6、按本發(fā)明技術(shù)方案制備的絲素蛋白納米球，具有良好的生物相容性，對人體無毒、無害、無免疫原性。這種不溶于水的納米絲素蛋白顆粒由于粒徑小，分散性好，可制成各種化妝品、護(hù)膚品、防曬膏等；由于制備過程采用常溫常壓、無化學(xué)交聯(lián)劑的溫和技術(shù)，可以作為具有生物活性物質(zhì)的載體，裝載酶、核酸、多肽、蛋白質(zhì)藥物等；同時，由于絲素蛋白納米球直徑小，不粘連，可以在血液中自由運(yùn)行，因此，可作為針劑在疾病診斷和治療中發(fā)揮獨(dú)特作用。


圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的絲素蛋白納米球的電子顯微鏡照片圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明技術(shù)方案做進(jìn)一步描述。實(shí)施例1
將100 g家蠶生絲放入5 L質(zhì)量濃度為0.05%的Na2CO3水溶液中，于98-100°C處理 30min,重復(fù)3次，使蠶絲脫膠，充分洗滌干燥后得到純絲素纖維。將純絲素纖維加入三元溶液中(由CaCl2/水/乙醇摩爾比為1 8 2配成)溶液中，在70°C攪拌溶解成絲素蛋白混合溶液。將所得到的絲素混合溶液裝入透析袋中，用去離子水透析4天，以除去CaCl2、乙醇等雜質(zhì)，得到純絲素蛋白溶液。以環(huán)己烷為溶劑，加入乳化劑司班，司班加入量為環(huán)己烷的l%wt，攪拌溶解得到環(huán)
己烷/司班混合溶液。調(diào)節(jié)絲素溶液的質(zhì)量濃度為3%，將絲素質(zhì)量10%的多元醇乙二醇均勻加入絲素溶液中。將絲素蛋白/多元醇混合溶液逐滴滴加入環(huán)己烷/司班混合溶液中，同時開啟超聲波震蕩和攪拌，直到滴加完畢后，繼續(xù)保持?jǐn)嚢韬统暡?0min。分5次加入高吸水性樹脂，總加入量為絲素蛋白溶液的30%/wt，每次加入1/5量， 保持?jǐn)嚢韬统暡?0min，原位吸水干燥固化。過濾去除吸過水的高吸水性樹脂。離心分離，上層環(huán)己烷回收利用，得到的下層絲素蛋白納米顆粒加入水洗，超聲波分散，離心去除水洗液，反復(fù)水洗4遍。水洗后的下層固體加入純水，超聲波分散，得到絲素蛋白納米的分散液。水洗后的下層固體冷凍干燥，得到絲素蛋白納米粉末。經(jīng)電鏡觀察檢測，該絲素蛋白納米球呈圓形，不粘連，直徑分布在10 80nm，平均直徑為60nm，不溶于水。實(shí)施例2
將0. 1公斤生絲放入3升質(zhì)量濃度為0. 15%的碳酸鈉水溶液中，于98 100°C處理2 小時，使生絲脫膠，充分洗滌后得到純絲素纖維。將晾干后的純絲素纖維，用1升濃度為9. 0 摩爾/升的溴化鋰溶液，在60士5°C下加熱溶解得到絲素蛋白混合溶液。用纖維素膜為透析材料，將所得的絲素蛋白混合溶液用去離子水透析3天，去除溴化鋰等雜質(zhì)，得到純絲素蛋白溶液。以環(huán)己烷為溶劑，加入乳化劑司班，司班加入量為環(huán)己烷的0. 75%wt，攪拌溶解得到環(huán)己烷/司班混合溶液。調(diào)節(jié)絲素溶液濃度為3%，將絲素質(zhì)量30%的丙三醇均勻加入絲素溶液中。將絲素蛋白/多元醇混合溶液逐滴滴加入環(huán)己烷/司班混合溶液中，同時開啟超聲波震蕩和攪拌，直到滴加完全后，繼續(xù)保持?jǐn)嚢韬统暡?0min。分4次加入高吸水性樹脂，加入總量為絲素蛋白溶液的20%/wt，每次加入1/4量， 保持?jǐn)嚢韬统暡?0min，原位吸水干燥固化。過濾去除吸過水的高吸水性樹脂。離心分離，上層環(huán)己烷回收利用，得到的下層絲素蛋白納米顆粒加入水洗，超聲波分散，離心去除水洗液，反復(fù)水洗4遍。水洗后的下層固體加入純水，超聲波分散，得到絲素蛋白納米分散液。水洗后的下層固體冷凍干燥，得到絲素蛋白納米粉末。該絲素蛋白納米球不溶于水。參見附圖1，它是本實(shí)施例提供的絲素蛋白納米球的電子顯微鏡圖；由圖1可以看到，該絲素蛋白納米球呈圓形，不粘連，直徑分布在30 200nm，平均直徑為llOnm。實(shí)施例3將200克廢蠶絲放入8升質(zhì)量濃度為0. 05%的碳酸鈉水溶液中，于98 100°C處理 0. 5小時脫膠，重復(fù)處理3次，充分洗滌后得到純絲素。將晾干后的純絲素用1升摩爾比為 1 8 :2的氯化鈣、水、乙醇溶液，在75 士 5°C下加熱溶解得到絲素蛋白混合溶液。用纖維素膜為透析材料，將所得的絲素蛋白混合溶液用去離子水透析3天，得到純的絲素蛋白溶液。以80ml環(huán)己烷為溶劑，加入乳化劑司班0. 4克，攪拌溶解得到環(huán)己烷/司班混合溶液。調(diào)節(jié)絲素溶液濃度為3. 2%，將絲素質(zhì)量30%的丙三醇均勻加入絲素溶液中。將絲素蛋白/多元醇混合溶液逐滴滴加入環(huán)己烷/司班混合溶液中，同時開啟超聲波震蕩和攪拌，直到滴加完全后，繼續(xù)保持?jǐn)嚢韬统暡?0min。分4次加入總量為0. 01克的高吸水性樹脂，每次加入1/4量(0. 0025克)，保持?jǐn)嚢韬统暡?0min，原位吸水干燥固化。過濾去除吸過水的高吸水性樹脂。離心分離，上層環(huán)己烷回收利用，得到的下層絲素蛋白納米顆粒加入水洗，超聲波分散，離心去除水洗液，反復(fù)水洗5遍。水洗后的下層固體加入純水，超聲波分散，得到絲素蛋白納米的分散液。水洗后的下層固體冷凍干燥，得到絲素蛋白納米粉末。經(jīng)激光粒度儀檢測，該絲素蛋白納米球直徑分布在100 200nm，平均直徑為 130nm，不溶于水。實(shí)施例4
將0. 5公斤繭殼放入25升質(zhì)量濃度為0. 5%的中性皂溶液中，于98 100°C處理2小時，使繭殼脫膠，充分洗滌后得到純絲素。將晾干后的純絲素，用2. 5升9. 2摩爾/升的溴化鋰水溶液，在60士2°C攪拌溶解成絲素蛋白混合溶液。用纖維素膜為透析材料，將所得的絲素蛋白混合溶液用去離子水透析，去除溴化鋰等雜質(zhì)，得到純的絲素蛋白溶液。以80ml環(huán)己烷為溶劑，加入乳化劑司班0. 6克，攪拌溶解得到環(huán)己烷/司班混合溶液。調(diào)節(jié)絲素溶液濃度為5. 7%，將絲素質(zhì)量30%的丁二醇均勻加入絲素溶液中。將絲素蛋白/多元醇混合溶液逐滴滴加入環(huán)己烷/司班混合溶液中，同時開啟超聲波震蕩和攪拌，直到滴加完全后，繼續(xù)保持?jǐn)嚢韬统暡?0min。分4次加入總量0. 02克的高吸水性樹脂，每次加入1/4量(0. 005克)，保持?jǐn)嚢韬统暡?0min，原位吸水干燥固化。過濾去除吸過水的高吸水性樹脂。離心分離，上層環(huán)己烷回收利用，得到的下層絲素蛋白納米顆粒加入水洗，超聲波分散，離心去除水洗液，反復(fù)水洗4遍。水洗后的下層固體加入純水，超聲波分散，得到絲素蛋白納米分散液。水洗后的下層固體冷凍干燥得到絲素蛋白納米粉末。經(jīng)激光粒度儀檢測，該絲素蛋白納米球直徑分布在10 200nm，平均直徑為60nm， 不溶于水。
權(quán)利要求
1.一種絲素蛋白納米球的制備方法，將蠶絲進(jìn)行脫膠、溶解、透析處理后得到濃度為 1 10 wt %的絲素蛋白溶液，其特征在于，再進(jìn)行如下步驟的加工(1)以環(huán)己烷為溶劑，加入乳化劑司班，司班加入量為環(huán)己烷的0.01 5wt %，攪拌溶解后得到環(huán)己烷/司班混合溶液；(2)在絲素蛋白溶液中加入多元醇，多元醇加入量為絲素蛋白質(zhì)量的1 60wt %，得到絲素蛋白/多元醇混合溶液；(3)在攪拌和超聲波震蕩條件下，將絲素蛋白/多元醇混合溶液逐滴滴加到環(huán)己烷/司班混合溶液中，滴加完畢后，繼續(xù)處理10 IOOmin ；(4)在攪拌和超聲波震蕩條件下，加入高吸水性樹脂，原位吸水干燥固化；(5)過濾去除吸過水的高吸水性樹脂；(6)離心分離，上層環(huán)己烷回收利用，得到下層絲素蛋白納米顆粒；(7)對絲素蛋白納米顆粒進(jìn)行水洗，再經(jīng)超聲波分散，離心去除水洗液，得到下層固體； 重復(fù)本步驟3 5次；(8)在下層固體中加入純水，進(jìn)行超聲波分散，得到絲素蛋白納米球的分散液；或進(jìn)行冷凍干燥，得到粉末狀的絲素蛋白納米球，所述絲素蛋白納米球的直徑為10 lOOOnm。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種絲素蛋白納米球的制備方法，其特征在于，所述的多元醇類為乙二醇、1，3-丙二醇、2，3-丙二醇、1，4-丁二醇、1，2-丁二醇、1，3-丁二醇、2，3-丁二醇、一縮二乙二醇、二縮三乙二醇、丙三醇、1，2，4-丁三醇、赤蘚糖醇、蘇阿糖醇、季戊四醇、環(huán)戊五醇、木糖醇、來蘇糖醇、核糖醇、阿拉伯糖醇、環(huán)己六醇、山梨醇、阿洛糖醇、阿卓糖醇、葡萄糖醇、甘露醇、古洛糖醇、艾杜糖醇、半乳糖醇、太羅糖醇或果糖醇中的一種，或它們中的幾種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種絲素蛋白納米球的制備方法，其特征在于，步驟中的高吸水性樹脂的總加入量為絲素蛋白溶液質(zhì)量的1 50 wt %，分成2 10次分別加入。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種絲素蛋白納米球的制備方法，利用反相乳液法使絲素蛋白溶液分散成納米液滴，在超聲波震蕩下加入多元醇，促使納米液滴中的絲素蛋白形成不溶于水的結(jié)構(gòu)，再加入高吸水性樹脂，使絲素蛋白在微乳液的狀態(tài)下干燥固化，得到不溶于水的納米絲素蛋白球。由于絲素蛋白納米球具有良好的生物相容性，對人體無毒、無害、無免疫原性，且制備過程采用常溫常壓、無化學(xué)交聯(lián)劑的溫和技術(shù)，因此，產(chǎn)品可作為具有生物活性物質(zhì)的載體，裝載酶、核酸、多肽、蛋白質(zhì)藥物等；所得到的絲素蛋白球粒徑小，分散性好，不粘連，可制成各種化妝品、護(hù)膚品、防曬膏等；它顆粒小，能在血液中自由運(yùn)行，可作為針劑在疾病診斷和治療等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。
文檔編號A61K9/14GK102417733SQ20111035710
公開日2012年4月18日 申請日期2011年11月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月11日
發(fā)明者盧神州, 呂強(qiáng), 張岑岑, 李明忠, 邢鐵玲 申請人:蘇州大學(xué)