專利名稱：結(jié)合藻紅膽素PEB的藻藍(lán)蛋白a亞基類熒光蛋白及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種結(jié)合藻紅膽素PEB的藻藍(lán)蛋白alpha亞基類熒光蛋白及其應(yīng)用， 屬于生物技術(shù)中色素蛋白質(zhì)材料領(lǐng)域，具體涉及結(jié)合藻紅膽素PEB的藻藍(lán)蛋白alpha亞基 類熒光蛋白、其與鏈霉親和素形成的融合蛋白及其突變體，以及利用此融合蛋白檢測可溶 性抗原或抗體的檢測方法。
背景技術(shù)：
藻膽蛋白(phycobiliprotein)是藍(lán)藻和紅藻光合作用捕光復(fù)合物的功能組分。 根據(jù)其吸收光譜和熒光光譜特征，藻膽蛋白可以分為藻紅蛋白(phycoerythrin，簡稱CPE)、 藻紅藍(lán)蛋白(phycoerythrocyanin，簡稱PEC)、藻藍(lán)蛋白(phycocyanin，簡稱CPC)和變藻 藍(lán)蛋白(allophycocyanin，簡稱APC) 。 CPE、PEC、CPC和APC含alpha和beta亞基，每個亞 基中藻膽色素(phycobilin)通過硫醚鍵與藻膽蛋白脫輔基蛋白(apo-phycobiliprotein) 半胱氨酸殘基的巰基共價結(jié)合，其種類及其與脫輔基蛋白的相互作用決定藻膽蛋白的光譜 性質(zhì)。藻膽色素與脫輔基蛋白共價結(jié)合形成特定的構(gòu)象，使得CPE主要吸收約560nm的可 見光，發(fā)射約580nm的熒光；PEC吸收約570nm的可見光，發(fā)射約630nm的熒光；CPC吸收約 620nm的可見光，發(fā)射約640nm的熒光；APC吸收約650 660nm的可見光，發(fā)射約660 670nm的熒光。CPE結(jié)合的輔基色素為藻紅膽素(phycoerythrobilin，簡稱PEB) ;PEC的 alpha亞基結(jié)合的輔基色素為藻紫膽素(phycoviolobilin，簡稱PVB) ;PEC的beta亞基結(jié) 合的輔基色素為藻藍(lán)膽素(phycocyanobilin，簡稱PCB) ;CPC和APC結(jié)合的輔基色素都為 藻藍(lán)膽素PCB。 可以從藻類中提取得到藻藍(lán)蛋白，并分離出其alpha和beta亞基，alpha亞基 的85位半胱氨酸殘基通過硫醚健共價結(jié)合藻藍(lán)膽素PCB， beta亞基82位和153位半胱 氨酸殘基分別通過硫醚健共價結(jié)合藻藍(lán)膽素PCB;也可以通過基因工程利用大腸桿菌進(jìn) 行生產(chǎn)。CPC的alpha亞基可以通過大腸桿菌基因工程菌來生產(chǎn)(Tooley AJ， Cai YA， Glazer AN. Biosynthesis ofa fluorescent cyanobacterial C_phycocyanin bolo—alpha subunit in a heterologous host[J].Proc NatlAcad Sci USA，2001，98(19) :10560 10565)。我們發(fā)現(xiàn)，利用基因工程，不僅可以得到藻藍(lán)蛋白alpha亞基85位結(jié)合藻藍(lán)膽素 PCB的熒光蛋白(其光譜圖如圖l所示)，同時還可以對其肽鏈氨基酸進(jìn)行突變、進(jìn)行有益 的標(biāo)記，更重要的是，我們可以得到一種結(jié)合藻紅膽素PEB而不是結(jié)合藻藍(lán)膽素PCB的熒光 藻藍(lán)蛋白alpha亞基(如圖2所示)。這種結(jié)合了 PEB的藻藍(lán)蛋白alpha亞基熒光蛋白，由 于結(jié)合了新的色素PEB，其熒光特性與天然的結(jié)合PCB的藻藍(lán)蛋白alpha亞基熒光蛋白有明 顯區(qū)別。 鏈霉親和素可以跟生物素特異結(jié)合，通過鏈霉親和素_生物素系統(tǒng)，可以實現(xiàn)信 號放大作用，提高檢測靈敏度。目前鏈霉親和素_生物素系統(tǒng)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物學(xué)檢測 和醫(yī)療檢測等領(lǐng)域。目前主要是通過化學(xué)交聯(lián)實現(xiàn)鏈霉親和素對目標(biāo)的標(biāo)記。本發(fā)明通 過基因工程技術(shù)，把鏈霉親和素基因和藻藍(lán)蛋白亞基脫輔基蛋白基因拼接后克隆于表達(dá)載體，可以在大腸桿菌內(nèi)表達(dá)得到鏈霉親和素和藻藍(lán)蛋白亞基脫輔基蛋白的融合蛋白，直接 實現(xiàn)鏈霉親和素和藻藍(lán)蛋白亞基脫輔基蛋白的連接；通過藻膽蛋白alpha裂合酶能催化藻 紅膽素與藻藍(lán)蛋白亞基脫輔基蛋白及其同源蛋白質(zhì)共價結(jié)合，從而生成具有優(yōu)良熒光性質(zhì) 的鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合PEB的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)(其光譜如圖3所示)。此蛋白可 直接應(yīng)用于免疫熒光檢測等領(lǐng)域。 免疫熒光技術(shù)(Immunofluorescence technique)又稱熒光抗體技術(shù)，是標(biāo)記免疫 技術(shù)中發(fā)展最早的一種免疫熒光技術(shù)(Immunofluorescence technique)又稱熒光抗體技 術(shù)，是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展最早的一種。它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建 立起來的一項技術(shù)。很早以來就有一些學(xué)者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合，利用抗 原抗體反應(yīng)進(jìn)行組織或細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。Coons等于1941年首次采用熒光素進(jìn)行標(biāo) 記而獲得成功。 用熒光抗體示蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法稱熒光抗體法；用已知的熒光抗原標(biāo)記物 示蹤或檢查相應(yīng)抗體的方法稱熒光抗原法。這兩種方法總稱免疫熒光技術(shù)，因為熒光色素 不但能與抗體球蛋白結(jié)合，用于檢測或定位各種抗原，也可以與其他蛋白質(zhì)結(jié)合，用于檢測 或定位抗體，但是在實際工作中熒光抗原技術(shù)很少應(yīng)用，所以人們習(xí)慣稱為熒光抗體技術(shù)， 或稱為免疫熒光技術(shù)。以熒光抗體方法較常用。 該技術(shù)的主要特點(diǎn)是特異性強(qiáng)、敏感性高、速度快。主要缺點(diǎn)是非特異性染色 問題尚未完全解決，技術(shù)程序也還比較復(fù)雜。同時，由于一般熒光測定中的本底較高等問 題，熒光免疫技術(shù)用于定量測定有一定困難。 藻膽蛋白性質(zhì)穩(wěn)定，其熒光性質(zhì)受到環(huán)境影響較小，適合作為熒光探針使用。本發(fā) 明中的藻膽蛋白已經(jīng)直接標(biāo)記有鏈霉親和素，利用間接檢測法，通過生物素_鏈霉親和素 系統(tǒng)，利用鏈霉親和素標(biāo)記的熒光藻膽蛋白與生物素標(biāo)記的抗抗體結(jié)合，從而實現(xiàn)對抗原 的檢測。生物素-鏈霉親和素提高了檢測的靈敏度，同時由于抗抗體的通用性，使本檢測方 法可以方便的用于各種抗原的檢測；熒光藻膽蛋白具有優(yōu)良的熒光性質(zhì)，較高的熒光效率、 較大波長的熒光發(fā)射峰，可以提高檢測靈敏度，減少本底熒光的影響。本方法有利于熒光藻 膽蛋白在免疫檢測中應(yīng)用的推廣。 藻膽蛋白目前正逐漸在各種領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，特別是在免疫熒光檢測方面有很 大的開發(fā)利用前景。通過改造后具有較高熒光效率、帶有可利用標(biāo)記的藻膽蛋白，會大大提 升其在免疫熒光檢測中的應(yīng)用價值，這為藻膽蛋白在醫(yī)藥和生物工程領(lǐng)域的應(yīng)用奠定了基 礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一類結(jié)合藻紅膽素PEB的藻藍(lán)蛋白alpha亞基及其與鏈霉 親和素形成的融合蛋白的氨基酸序列，并標(biāo)明其色素結(jié)合位點(diǎn)，同時提供利用鏈霉親和素 標(biāo)記的熒光藻膽蛋白檢測可溶性抗原或抗體的免疫檢測方法。這類鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合 藻紅膽素PEB的藻藍(lán)蛋白alpha亞基具有與天然藻類中存在的藻藍(lán)蛋白alpha亞基不同的 結(jié)構(gòu)，并且其熒光光譜性質(zhì)也有極大區(qū)別，同時，提供了此類帶有鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合藻 紅膽素PEB的藻藍(lán)蛋白alpha亞基用于檢測可溶性抗原的方法它是利用抗體與抗原特異 性反應(yīng)、鏈霉親和素可以與生物素特異結(jié)合的原理，利用鏈霉親和素標(biāo)記的熒光藻膽蛋白檢測可溶性抗原或抗體。 為了解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是 將藻藍(lán)蛋白alpha亞基編碼基因克隆于表達(dá)質(zhì)粒，利用藻藍(lán)蛋白alpha裂合酶表 達(dá)質(zhì)粒以及藻紅膽素PEB合成酶質(zhì)粒，可以在大腸桿菌中合成結(jié)合PEB的藻藍(lán)蛋白alpha 亞基類熒光蛋白，并且標(biāo)明了其色素結(jié)合位點(diǎn)，該類蛋白質(zhì)序列N端具有His-tag標(biāo)記，但 是His-tag標(biāo)記不限于N端。將藻藍(lán)蛋白alpha亞基編碼基因克隆于表達(dá)質(zhì)粒，利用基因工 程方法將其突變，可表達(dá)得到藻藍(lán)蛋白alpha亞基突變體，對除結(jié)合色素的133位外的所有 位點(diǎn)進(jìn)行突變一般不會對蛋白性質(zhì)有較大的影響，屬于同類蛋白，對此蛋白進(jìn)行部分缺失， 對蛋白性質(zhì)無較大影響，也屬于同類蛋白。 所述的結(jié)合藻紅膽素PEB的藻藍(lán)蛋白alpha亞基類熒光蛋白的蛋白質(zhì)氨基酸序列 為序列1 : 序列1 :(第133位半胱氨酸C為藻紅膽素PEB的結(jié)合位點(diǎn))
所述的結(jié)合藻紅膽素PEB是指藻紅膽素PEB通過硫醚鍵結(jié)合在133位，相當(dāng)于原 始藻藍(lán)蛋白alpha亞基的85位。 將鏈霉親和素編碼基因和藻藍(lán)蛋白alpha亞基編碼基因拼接后克隆于表達(dá)質(zhì)粒， 利用藻藍(lán)蛋白alpha裂合酶表達(dá)質(zhì)粒以及藻紅膽素PEB合成酶質(zhì)粒，可以在大腸桿菌中合 成結(jié)合PEB的藻藍(lán)蛋白alpha亞基類熒光蛋白，并且標(biāo)明了其色素結(jié)合位點(diǎn)。
—種鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合藻紅膽素PEB的藻藍(lán)蛋白alpha亞基類熒光蛋白，鏈 霉親和素在CpcA的N端，但是不限于在N端。 鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合藻紅膽素PEB是指藻紅膽素PEB通過硫醚鍵結(jié)合在261 位，相當(dāng)于原始藻藍(lán)蛋白alpha亞基的85位。 所述的鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合藻紅膽素PEB的藻藍(lán)蛋白alpha亞基類熒光蛋白氨 基酸序列為序列2 : 序列2 :(第261位半胱氨酸C為藻紅膽素PEB的結(jié)合位點(diǎn))
LSPSWYVEALKHIKANHGLSGQAANEANTYIDYAINALS 所述的鏈霉親和素標(biāo)記的熒光藻膽蛋白為鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合藻紅膽素PEB 的藻藍(lán)蛋白alpha亞基類蛋白。 結(jié)合藻紅膽素PEB的藻藍(lán)蛋白alpha亞基類熒光蛋白的應(yīng)用利用鏈霉親和素標(biāo) 記的熒光藻膽蛋白檢測可溶性抗原或抗體的免疫檢測。 本發(fā)明提供的利用鏈霉親和素標(biāo)記的熒光藻膽蛋白檢測可溶性抗原或抗體的方 法，其步驟如下 (1)將可與固相結(jié)合并能識別抗原的第一抗體包被固相上，封閉液封閉未結(jié)合抗體部分，備用； (2)將待測抗原、識別抗原的第二抗體、識別第二抗體的標(biāo)記生物素的抗抗體、標(biāo)
記鏈霉素親和素的熒光藻膽蛋白按一定步驟加入固相中，充分反應(yīng)； (3)利用微孔板熒光檢測儀或其它相應(yīng)的儀器檢測熒光，分析結(jié)果。 本發(fā)明的有益效果是結(jié)合PEB的藻藍(lán)蛋白alpha亞基由于具有His-tag標(biāo)記，便
于提純，且由于此蛋白是單一亞基構(gòu)成，比具多個亞基的天然藻藍(lán)蛋白更具均一性；相比具
有與結(jié)合PCB的藻藍(lán)蛋白alpha亞基完全不同的光譜性質(zhì)，其熒光效率高，用于免疫檢測中
有更好的靈敏度；與鏈霉親和素形成融合蛋白后，實現(xiàn)了鏈霉親和素直接標(biāo)記，可以直接用
于免疫檢測中，不需要利用化學(xué)方法等進(jìn)行鏈霉親和素標(biāo)記。


圖1 :85位半胱氨酸殘基結(jié)合PCB的藻藍(lán)蛋白alpha亞基熒光蛋白的吸收和熒光 光譜圖，其中實線為吸收光譜，虛線為熒光光譜； 圖2 :85位半胱氨酸殘基結(jié)合PEB的藻藍(lán)蛋白alpha亞基熒光蛋白的吸收和熒光 光譜圖，其中實線為吸收光譜，虛線為熒光光譜； 圖3 :鏈霉親和素標(biāo)記的85位半胱氨酸殘基結(jié)合PEB的藻藍(lán)蛋白alpha亞基熒光
蛋白的吸收和熒光光譜圖，其中實線為吸收光譜，虛線為熒光光譜。 蛋白質(zhì)氨基酸序列附件 序列1 :(第133位半胱氨酸C為藻紅膽素PEB的結(jié)合位點(diǎn))
LSPSWYVEALKHIKANHGLSGQAANEANTYIDYAINALS
具體實施例方式
下面結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳述，但這些實施例僅用于說明本發(fā)
明，并不限制本發(fā)明的范圍。
實施例1 蛋白質(zhì)氨基酸序列如序列1所示，將藻藍(lán)蛋白alpha亞基編碼基因克隆于表達(dá)質(zhì) 粒，表達(dá)得到藻藍(lán)蛋白alpha亞基，其N端帶有His-tag標(biāo)記，這不僅有利于對其進(jìn)行提純， 還有助于提高其溶解性。藻紅膽素通過硫醚健結(jié)合在第133位(相當(dāng)于原始藻藍(lán)蛋白alpha 亞基第85位)半胱氨酸殘基上。其光譜如圖2所示，吸收峰為555nm，熒光發(fā)射峰為569nm。
實施例2 蛋白質(zhì)氨基酸序列如序列2所示，將鏈霉親和素編碼基因和藻藍(lán)蛋白alpha亞基編碼基因拼接后克隆于表達(dá)質(zhì)粒，表達(dá)得到的鏈霉親和素和藻藍(lán)蛋白alpha亞基的融合蛋 白，直接實現(xiàn)鏈霉親和素對藻藍(lán)蛋白alpha亞基的標(biāo)記；且N端帶有His-tag標(biāo)記，這不僅 有利于對其進(jìn)行提純，還有助于提高其溶解性。藻紅膽素通過硫醚健結(jié)合在第261位(相 當(dāng)于原始藻藍(lán)蛋白alpha亞基第85位)半胱氨酸殘基上。其光譜如圖3所示，吸收峰為 555nm，熒光發(fā)射峰為569nm。
實施例3 (D將癌胚抗原CEA的小鼠單克隆抗體用包被緩沖液(0. 05M、 pH9. 6碳酸鹽緩沖 液)稀釋到2 ii g/mL，取150 ii L加入黑色96孔酶標(biāo)板，4t:包被12至20小時；倒去包被用 的抗體，用洗滌緩沖液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標(biāo)板，洗滌4 次，甩干液體；每孔加入封閉緩沖液(含1%牛血清蛋白的含0. 05% Tween-20的pH7. 2的 PBS緩沖液)300 ii L， 37。C封閉30分鐘；倒去封閉液，用洗滌緩沖液(含0. 05% T獄n-20的 pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標(biāo)板，洗滌4次，甩干液體，備用； (2)取癌胚抗原CEA，用稀釋緩沖液(含0. 1%牛血清蛋白的含0. 05% Tween-20 的pH7. 2的PBS緩沖液)稀釋到50ng/mL，取150 y L加入到步驟(1)準(zhǔn)備好的酶標(biāo)板微孔 中，做九個平行樣，另取三孔直接加入稀釋緩沖液作為空白對照，37t:孵育1.5小時，倒去 液體，用洗滌緩沖液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標(biāo)板，洗滌4次， 甩干液體，備用； (3)每三個平行樣為一組，分以下三種步驟完成 第一種①取癌胚抗原CEA的兔多克隆抗體，用稀釋緩沖液(含O. 1%牛血清蛋白 的含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)稀釋至2 y g/mL，取150 y L加入到步驟(2) 準(zhǔn)備好的酶標(biāo)板微孔中，做三個平行樣以及空白對照；37t:孵育1. 5小時，倒去液體，用洗 滌緩沖液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標(biāo)板，洗滌4次，甩干液體， 備用；②取生物素標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白抗體，用稀釋緩沖液(含O. 1%牛血清蛋白的含 0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)稀釋至10 y g/mL，取150 y L加入到步驟①準(zhǔn)備 好的酶標(biāo)板微孔中，做三個平行樣以及空白對照；37t:孵育1. 5小時，倒去液體，用洗滌緩 沖液(含0. 05 % Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標(biāo)板，洗滌4次，甩干液體，備 用；③取標(biāo)記鏈霉親和素的結(jié)合PEB的藻藍(lán)蛋白alpha亞基熒光蛋白，用pH7. 2的0. 05M磷 酸鉀、0. 5M NaCl緩沖液稀釋至10 y g/mL，取150 y L加入到步驟②準(zhǔn)備的平行樣及空白對 照孔中，37t:孵育0. 5小時； 第二種①取癌胚抗原CEA的兔多克隆抗體，用稀釋緩沖液(含O. 1%牛血清蛋白 的含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)稀釋至2 y g/mL，取150 y L加入到步驟(2) 準(zhǔn)備好的酶標(biāo)板微孔中，做三個平行樣以及空白對照；37t:孵育1. 5小時，倒去液體，用洗 滌緩沖液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標(biāo)板，洗滌4次，甩干液體， 備用；②取生物素標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白抗體和標(biāo)記鏈霉親和素的結(jié)合PEB的藻藍(lán)蛋白 alpha亞基熒光蛋白混合加入稀釋緩沖液(含0. 1%牛血清蛋白的含0. 05% Tween-20的 pH7. 2的PBS緩沖液)中，兩個組分的終濃度分別都是10 ii g/mL，取上述溶液150 y L加入 到步驟①準(zhǔn)備的平行樣及空白對照孔中，37t:孵育1. 5小時； 第三種取癌胚抗原CEA的兔多克隆抗體、生物素標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白抗體 和標(biāo)記鏈霉親和素的結(jié)合PEB的藻藍(lán)蛋白alpha亞基熒光蛋白混合加入稀釋緩沖液(含
70. 1%牛血清蛋白的含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)中，癌胚抗原CEA的兔多克 隆抗體終濃度為2 g/mL，另外兩個組分的終濃度分別都是10 g/mL ;取上述溶液150 y L 加入到步驟①準(zhǔn)備的平行樣及空白對照孔中，37t:孵育1. 5小時； (4)把步驟(3)所得酶標(biāo)板倒去液體，用pH7. 2的0. 05M磷酸鉀、0. 5M NaCl緩沖 液洗滌酶標(biāo)板，洗滌4次，甩干液體后，每孔加入150 ii L pH7. 2的O. 05M磷酸鉀、0. 5M NaCl
緩沖液，置于微孔板熒光檢測儀中檢測熒光值。
實施例4 (1)將癌胚抗原CEA的小鼠單克隆抗體用包被緩沖液(0. 05M、 pH9. 6碳酸鹽緩沖 液)稀釋到2 ii g/mL，取150 ii L加入黑色96孔酶標(biāo)板，兩組平行樣分別fC和37。C包被12 至20小時；倒去包被用的抗體，用洗滌緩沖液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖 液)洗滌酶標(biāo)板，洗滌4次，甩干液體；每孔加入封閉緩沖液(含1%牛血清蛋白的含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)300 y L， 37。C封閉30分鐘；倒去封閉液，用洗滌緩沖液 (含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標(biāo)板，洗滌4次，甩干液體，備用； [OO53] (2)取癌胚抗原CEA，用稀釋緩沖液(含0. 1%牛血清蛋白的含0. 05% Tween-20 的pH7. 2的PBS緩沖液)稀釋到50ng/mL，取150 y L加入到步驟(1)準(zhǔn)備好的酶標(biāo)板微孔 中，做六個平行樣，另取兩孔直接加入稀釋緩沖液作為空白對照，37t:孵育1.5小時，倒去 液體，用洗滌緩沖液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標(biāo)板，洗滌4次， 甩干液體，備用； (3)每一組平行樣分別按以下步驟完成 ①取癌胚抗原CEA的兔多克隆抗體，用稀釋緩沖液(含0. 1 %牛血清蛋白的含 0. 05 % Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)稀釋至2 y g/mL，取150 y L加入到步驟(2)準(zhǔn) 備好的酶標(biāo)板微孔中，做三個平行樣以及空白對照；37t:孵育1. 5小時，倒去液體，用洗滌 緩沖液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標(biāo)板，洗滌4次，甩干液體， 備用；②取生物素標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白抗體和標(biāo)記鏈霉親和素的結(jié)合PEB的藻藍(lán)蛋白 alpha亞基熒光蛋白混合加入稀釋緩沖液(含0. 1%牛血清蛋白的含0. 05% Tween-20的 pH7. 2的PBS緩沖液)中，兩個組分的終濃度分別都是10 g/mL，取上述溶液150 y L加入 到步驟①準(zhǔn)備的平行樣及空白對照孔中，37t:孵育1. 5小時； (4)把步驟(3)所得酶標(biāo)板倒去液體，用pH7. 2的0. 05M磷酸鉀、0. 5M NaCl緩沖 液洗滌酶標(biāo)板，洗滌4次，甩干液體后，每孔加入150 ii L pH7. 2的0. 05M磷酸鉀、0. 5M NaCl
緩沖液，置于微孔板熒光檢測儀中檢測熒光值。
實施例5 (1)將癌胚抗原CEA的小鼠單克隆抗體用包被緩沖液(0. 05M、 pH9. 6碳酸鹽緩沖 液)稀釋到2 ii g/mL，取150 ii L加入黑色96孔酶標(biāo)板，4t:包被12至20小時；倒去包被用 的抗體，用洗滌緩沖液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標(biāo)板，洗滌4 次，甩干液體；每孔加入封閉緩沖液(含1%牛血清蛋白的含0. 05% Tween-20的pH7. 2的 PBS緩沖液)300 ii L， 37。C封閉30分鐘；倒去封閉液，用洗滌緩沖液(含0. 05% Tween-20的 pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標(biāo)板，洗滌4次，甩干液體，備用； (2)取癌胚抗原CEA，用稀釋緩沖液(含O. 1 %牛血清蛋白的含0. 05% Tween-20的 pH7. 2的PBS緩沖液)稀釋到50ng/mL，取150 y L加入到步驟(1)準(zhǔn)備好的酶標(biāo)板微孔中，
8做二十七個平行樣，另取九孔直接加入稀釋緩沖液作為空白對照，37t:孵育1. 5小時，倒去 液體，用洗滌緩沖液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標(biāo)板，洗滌4次， 甩干液體，備用； (3)每一組平行樣分別按以下步驟完成 ①取癌胚抗原CEA的兔多克隆抗體，用稀釋緩沖液(含O. 1%牛血清蛋白的含 0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)稀釋至2 y g/mL，取150 y L加入到步驟(2)準(zhǔn)備 好的酶標(biāo)板微孔中，做三個平行樣以及空白對照；37t:孵育1. 5小時，倒去液體，用洗滌緩 沖液(含0. 05 % Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標(biāo)板，洗滌4次，甩干液體，備用； ②取生物素標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白抗體和標(biāo)記鏈霉親和素的結(jié)合PEB的藻藍(lán)蛋白alpha 亞基熒光蛋白混合加入稀釋緩沖液(含0. 1%牛血清蛋白的含0. 05% Tween-20的pH7. 2 的PBS緩沖液)中，兩個組分的終濃度分別為:5 ii g/mL、5 ii g/mL， 5 y g/mL、 10 y g/mL， 5 y g/
mL、20 li g/mL，10 u g/mL、5 u g/mL，10 u g/mL、10 u g/mL，10 u g/mL、20 u g/mL， 20 u g/mL、 5 ii g/mL， 20 ii g/mL、 10 y g/mL， 20 y g/mL、20 y g/mL，取上述溶液150 y L分別加入到步驟① 準(zhǔn)備的平行樣及空白對照孔中，每一種濃度對應(yīng)一組平行樣，37t:孵育1. 5小時；
(4)把步驟(3)所得酶標(biāo)板倒去液體，用pH7. 2的0. 05M磷酸鉀、0. 5M NaCl緩沖 液洗滌酶標(biāo)板，洗滌4次，甩干液體后，每孔加入150 ii L pH7. 2的O. 05M磷酸鉀、0. 5M NaCl
緩沖液，置于微孔板熒光檢測儀中檢測熒光值。
實施例6 (1)將癌胚抗原CEA的小鼠單克隆抗體用包被緩沖液(0. 05M、 pH9. 6碳酸鹽緩沖 液)稀釋到2 ii g/mL，取150 ii L加入黑色96孔酶標(biāo)板，4t:包被12至20小時；倒去包被用 的抗體，用洗滌緩沖液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標(biāo)板，洗滌4 次，甩干液體；每孔加入封閉緩沖液(含1%牛血清蛋白的含0. 05% Tween-20的pH7. 2的 PBS緩沖液)300 ii L， 37。C封閉30分鐘；倒去封閉液，用洗滌緩沖液(含0. 05 % Tween-20的 pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標(biāo)板，洗滌4次，甩干液體，備用； (2)取癌胚抗原CEA，用稀釋緩沖液(含O. 1 %牛血清蛋白的含0. 05% Tween-20 的pH7. 2的PBS緩沖液)稀釋到50ng/mL，取150 y L加入到步驟(1)準(zhǔn)備好的酶標(biāo)板微孔 中，做六個平行樣，另取二孔直接加入稀釋緩沖液作為空白對照，37t:孵育1.5小時，倒去 液體，用洗滌緩沖液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標(biāo)板，洗滌4次， 甩干液體，備用； (3)每一組平行樣分別按以下步驟完成 ①取癌胚抗原CEA的兔多克隆抗體，用稀釋緩沖液(含0. 1 %牛血清蛋白的含 0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)稀釋至2 y g/mL，取150 y L加入到步驟(2)準(zhǔn)備 好的酶標(biāo)板微孔中，做三個平行樣以及空白對照；37t:孵育1. 5小時，倒去液體，用洗滌緩 沖液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標(biāo)板，洗滌4次，甩干液體，備 用； ②取生物素標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白抗體和標(biāo)記鏈霉親和素的結(jié)合PEB的藻藍(lán) 蛋白alpha亞基熒光蛋白混合加入稀釋緩沖液(含O. 1%牛血清蛋白的含0. 05% Tween-20 的pH7. 2的PBS緩沖液或pH7. 2的0. 05M磷酸鉀、0. 5M NaCl緩沖液)中，兩個組分的終濃 度分別為生物素標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白抗體20ii g/mL、標(biāo)記鏈霉親和素的結(jié)合PEB的藻藍(lán)蛋白alpha亞基熒光蛋白10 g/mL，取上述溶液150 y L分別加入到步驟①準(zhǔn)備的平行 樣及空白對照孔中，每一種溶液對應(yīng)一組平行樣，37t:孵育1. 5小時； (4)把步驟(3)所得酶標(biāo)板倒去液體，用pH7. 2的0. 05M磷酸鉀、0. 5M NaCl緩沖 液洗滌酶標(biāo)板，洗滌4次，甩干液體后，每孔加入150 ii L pH7. 2的O. 05M磷酸鉀、0. 5M NaCl
緩沖液，置于微孔板熒光檢測儀中檢測熒光值。
實施例7 (1)將癌胚抗原CEA的小鼠單克隆抗體用包被緩沖液(0. 05M、 pH9. 6碳酸鹽緩沖 液)稀釋到2 ii g/mL，取150 ii L加入黑色96孔酶標(biāo)板，4t:包被12至20小時；倒去包被用 的抗體，用洗滌緩沖液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標(biāo)板，洗滌4 次，甩干液體；每孔加入封閉緩沖液(含1%牛血清蛋白的含0. 05% Tween-20的pH7. 2的 PBS緩沖液)300 ii L， 37。C封閉30分鐘；倒去封閉液，用洗滌緩沖液(含0. 05% Tween-20的 pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標(biāo)板，洗滌4次，甩干液體，備用； (2)取癌胚抗原CEA，用稀釋緩沖液(含O. 1 %牛血清蛋白的含0. 05% Tween-20 的pH7. 2的PBS緩沖液)稀釋到50ng/mL，取150 y L加入到步驟(1)準(zhǔn)備好的酶標(biāo)板微孔 中，做九個平行樣，另取三孔直接加入稀釋緩沖液作為空白對照，37t:孵育1.5小時，倒去 液體，用洗滌緩沖液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標(biāo)板，洗滌4次， 甩干液體，備用； (3)每一組平行樣分別按以下步驟完成 ①取癌胚抗原CEA的兔多克隆抗體，用稀釋緩沖液(含0. 1 %牛血清蛋白的含 0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)稀釋至2 y g/mL，取150 y L加入到步驟(2)準(zhǔn)備 好的酶標(biāo)板微孔中，做三個平行樣以及空白對照；37t:孵育1. 5小時，倒去液體，用洗滌緩 沖液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標(biāo)板，洗滌4次，甩干液體，備 用； ②取生物素標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白抗體和標(biāo)記鏈霉親和素的結(jié)合PEB的藻藍(lán) 蛋白alpha亞基熒光蛋白混合加入稀釋緩沖液(含O. 1%牛血清蛋白的含0. 05% Tween-20 的pH7.2的PBS緩沖液)中，兩個組分的終濃度分別為生物素標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白抗 體20iig/mL、標(biāo)記鏈霉親和素的結(jié)合PEB的藻藍(lán)蛋白alpha亞基熒光蛋白10iig/mL，取上 述溶液150iiL分別加入到步驟①準(zhǔn)備的平行樣及空白對照孔中，三組平行樣分別37t:孵 育0. 5小時、1小時、1. 5小時； (4)把步驟(3)所得酶標(biāo)板倒去液體，用pH7. 2的0. 05M磷酸鉀、0. 5M NaCl緩沖 液洗滌酶標(biāo)板，洗滌4次，甩干液體后，每孔加入150 ii L pH7. 2的O. 05M磷酸鉀、0. 5M NaCl
緩沖液，置于微孔板熒光檢測儀中檢測熒光值。
實施例8 (1)將癌胚抗原CEA的小鼠單克隆抗體用包被緩沖液(0. 05M、 pH9. 6碳酸鹽緩沖 液)稀釋到2 ii g/mL，取150 ii L加入黑色96孔酶標(biāo)板，4t:包被12至20小時；倒去包被用 的抗體，用洗滌緩沖液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標(biāo)板，洗滌4 次，甩干液體；每孔加入封閉緩沖液(含1%牛血清蛋白的含0. 05% Tween-20的pH7. 2的 PBS緩沖液)300 ii L， 37。C封閉30分鐘；倒去封閉液，用洗滌緩沖液(含0. 05% Tween-20的 pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標(biāo)板，洗滌4次，甩干液體，備用；
(2)取癌胚抗原CEA，用稀釋緩沖液(含O. 1 %牛血清蛋白的含0. 05% Tween-20 的pH7. 2的PBS緩沖液)稀釋到50ng/mL、25ng/mL、12. 5ng/mL、6. 25ng/mL、3. 125ng/mL、 1. 562ng/mL、0. 781ng/mL、0. 390ng/mL，分別取150y L加入到步驟(1)準(zhǔn)備好的酶標(biāo)板微孔 中，每個濃度做二個平行樣，另取二孔直接加入稀釋緩沖液作為空白對照，37t:孵育1. 5小 時，倒去液體，用洗滌緩沖液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標(biāo)板，洗 滌4次，甩干液體，備用；
(3)按以下步驟完成 ①取癌胚抗原CEA的兔多克隆抗體，用稀釋緩沖液(含O. 1%牛血清蛋白的含 0. 05 % Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)稀釋至2 y g/mL，取150 y L加入到步驟(2)準(zhǔn) 備好的酶標(biāo)板微孔中，做三個平行樣以及空白對照；37t:孵育1. 5小時，倒去液體，用洗滌 緩沖液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標(biāo)板，洗滌4次，甩干液體， 備用；②取生物素標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白抗體和標(biāo)記鏈霉親和素的結(jié)合PEB的藻藍(lán)蛋白 alpha亞基熒光蛋白混合加入稀釋緩沖液(含0. 1%牛血清蛋白的含0. 05% Tween-20的 pH7. 2的PBS緩沖液)中，兩個組分的終濃度分別為生物素標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白抗體 20 ii g/mL、標(biāo)記鏈霉親和素的結(jié)合PEB的藻藍(lán)蛋白alpha亞基熒光蛋白10 y g/mL，取上述溶 液150 L分別加入到步驟①準(zhǔn)備的平行樣及空白對照孔中，37t:孵育1. 5小時；
(4)把步驟(3)所得酶標(biāo)板倒去液體，用pH7. 2的0. 05M磷酸鉀、0. 5M NaCl緩沖 液洗滌酶標(biāo)板，洗滌4次，甩干液體后，每孔加入150 ii L pH7. 2的0. 05M磷酸鉀、0. 5M NaCl 緩沖液，置于微孔板熒光檢測儀中檢測熒光值。 上述蛋白中，His-tag標(biāo)記和鏈霉親和素標(biāo)記所處的位置不限定位于蛋白N端， 位于別的位置只要不影響藻藍(lán)蛋白alpha亞基蛋白的活性也可以同樣實施本發(fā)明。同時， 除了 85位半胱氨酸外，對藻藍(lán)蛋白alpha亞基氨基酸序列進(jìn)行的其余突變，若對藻藍(lán)蛋白 alpha亞基蛋白熒光性質(zhì)無較大影B向，也可同樣實施本發(fā)明；對藻藍(lán)蛋白alpha亞基氨基酸 序列的N端或C端進(jìn)行部分缺失，也不會對藻藍(lán)蛋白alpha亞基蛋白熒光性質(zhì)產(chǎn)生較大影 響，也可同樣實施本發(fā)明。 上述檢測方法適用于利用各種不同抗體或抗原、不同固相載體、熒光檢測儀器來 檢測可溶性抗原或抗體。但由于可能涉及的抗體種類及其繁多，藻膽蛋白種類也較多，本 發(fā)明只選取癌胚抗原及其一種鼠源單克隆抗體和兔源多克隆抗體、鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合 PEB的藻藍(lán)蛋白alpha亞基為例，在以96孔板為固相載體，利用微孔板熒光檢測儀，對本發(fā) 明加以說明。本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員可以根據(jù)上述公開的內(nèi)容，材料其他材料和儀器，實施本 發(fā)明。
1權(quán)利要求
一種結(jié)合藻紅膽素PEB的藻藍(lán)蛋白alpha亞基類熒光蛋白，其特征在于將藻藍(lán)蛋白alpha亞基編碼基因克隆于表達(dá)質(zhì)粒，表達(dá)得到藻藍(lán)蛋白alpha亞基。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)合藻紅膽素PEB的藻藍(lán)蛋白alpha亞基類熒光蛋白，其特 征在于所述的蛋白質(zhì)的序列為序列1。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的結(jié)合藻紅膽素PEB的藻藍(lán)蛋白alpha亞基類熒光蛋白， 其特征在于所述的蛋白質(zhì)序列N端具有His-tag標(biāo)記，但是His-tag標(biāo)記不限于N端。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的結(jié)合藻紅膽素PEB的藻藍(lán)蛋白alpha亞基類熒光蛋 白，其特征在于所述的結(jié)合藻紅膽素PEB是指藻紅膽素PEB通過硫醚鍵結(jié)合在133位，相 當(dāng)于原始藻藍(lán)蛋白alpha亞基的85位。
5. —種結(jié)合藻紅膽素PEB的藻藍(lán)蛋白alpha亞基類熒光蛋白突變體，其特征在于將 藻藍(lán)蛋白alpha亞基編碼基因克隆于表達(dá)質(zhì)粒，利用基因工程方法將其突變，可表達(dá)得到 藻藍(lán)蛋白alpha亞基突變體，對除結(jié)合色素的133位外的所有位點(diǎn)進(jìn)行突變一般不會對蛋 白性質(zhì)有較大的影響，屬于同類蛋白，對此蛋白進(jìn)行部分缺失，對蛋白性質(zhì)無較大影響，也 屬于同類蛋白。
6. —種鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合藻紅膽素PEB的藻藍(lán)蛋白alpha亞基類熒光蛋白，其特 征在于將鏈霉親和素編碼基因和藻藍(lán)蛋白alpha亞基編碼基因拼接后克隆于表達(dá)質(zhì)粒， 表達(dá)得到鏈霉親和素和藻藍(lán)蛋白alpha亞基的融合蛋白。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合藻紅膽素PEB的藻藍(lán)蛋白alpha亞基 類熒光蛋白，其特征在于所述的蛋白質(zhì)的序列為序列2。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合藻紅膽素PEB的藻藍(lán)蛋白alpha 亞基類熒光蛋白，其特征在于鏈霉親和素在CpcA的N端，但是不限于在N端。
9. 根據(jù)權(quán)利要求6、7或8所述的鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合藻紅膽素PEB的藻藍(lán)蛋白 alpha亞基類熒光蛋白，其特征在于所述的結(jié)合藻紅膽素PEB是指藻紅膽素PEB通過硫醚 鍵結(jié)合在261位，相當(dāng)于原始藻藍(lán)蛋白alpha亞基的85位。
10. 結(jié)合藻紅膽素PEB的藻藍(lán)蛋白alpha亞基類熒光蛋白的應(yīng)用，其特征在于利用鏈 霉親和素標(biāo)記的結(jié)合藻紅膽素PEB的藻藍(lán)蛋白alpha亞基類熒光蛋白檢測可溶性抗原或抗 體的免疫檢測。
11. 根據(jù)權(quán)利要求IO所述的結(jié)合藻紅膽素PEB的藻藍(lán)蛋白alpha亞基類熒光蛋白的應(yīng) 用，其特征在于所述的免疫檢測包括以下步驟(1) 將可與固相結(jié)合并能識別抗原的第一抗體包被固相上，封閉液封閉未結(jié)合抗體部 分，備用；(2) 將待測抗原、識別抗原的第二抗體、識別第二抗體的標(biāo)記生物素的抗抗體、標(biāo)記鏈 霉素親和素的熒光藻膽蛋白按一定步驟加入固相中，充分反應(yīng)；(3) 利用微孔板熒光檢測儀或其它相應(yīng)的儀器檢測熒光，分析結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種結(jié)合藻紅膽素PEB的藻藍(lán)蛋白alpha亞基類熒光蛋白及其與鏈霉親和素形成的融合蛋白，其序列為序列1和序列2；并公開了融合鏈霉親和素的熒光蛋白直接用于熒光免疫檢測的方法；藻藍(lán)蛋白alpha亞基保守的半胱氨酸殘基通過硫醚鍵可以結(jié)合藻藍(lán)膽素PCB，通過基因工程發(fā)現(xiàn)，藻藍(lán)蛋白alpha亞基保守的半胱氨酸殘基通過硫醚鍵也可以結(jié)合藻紅膽素PEB，得到一類新型的熒光藻藍(lán)蛋白，這類蛋白的光譜性質(zhì)與結(jié)合PCB的藻藍(lán)蛋白alpha亞基熒光蛋白完全不同，有較高的熒光效率，同時由于帶有His-tag標(biāo)記，便于提純，還有助于改善其溶解性，與鏈霉親和素形成融合蛋白，可以直接用于免疫熒光檢測，有利于其在各個領(lǐng)域中的應(yīng)用。
文檔編號C12N15/63GK101759785SQ20081021965
公開日2010年6月30日 申請日期2008年12月4日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月4日
發(fā)明者佟順剛, 周明, 夏坤, 趙開弘 申請人:廣州天寶頌原生物科技開發(fā)有限公司;華中科技大學(xué)