一種過氧化物納米酶及其制備方法
【專利摘要】一種過氧化物納米酶及其制備方法，屬于納米生物技術(shù)領(lǐng)域。是以金納米粒子為載體，利用生物活性五肽(URGDC)進(jìn)行自組裝，五肽分子中巰基與金納米粒子配位共價(jià)偶聯(lián)，得到具有高GPx活性的過氧化物納米酶。此方法簡(jiǎn)便易于操作，并且具有良好的穩(wěn)定性。生物活性五肽的氨基酸序列為Sec?Arg?Gly?Asp?Cys(簡(jiǎn)稱URGDC)。其中Sec(U)中含有酶的活性中心；Arg?Gly?Asp(RGD)能促進(jìn)納米酶與底物的結(jié)合，Cys(C)側(cè)鏈中的巰基可以和金納米粒子共價(jià)連接。金納米粒子的應(yīng)用是作為一種載體固定生物活性五肽，促進(jìn)納米酶與底物的充分接觸，提高谷胱甘肽過氧化物酶的活力。
【專利說明】
-種過氧化物納米酶及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于納米生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及納米技術(shù)與人工模擬酶領(lǐng)域的交叉與結(jié) 合，通過納米技術(shù)模擬谷脫甘膚過氧化物酶(GPx)的性質(zhì)，制備一種高GPx活性的過氧化物 納米酶。
【背景技術(shù)】
[0002] 谷脫甘膚過氧化物酶(GPx)具有獨(dú)特的氧化還原特性，是生物體內(nèi)抗氧化酶的重 要成員之一。GPxW谷脫甘膚(G甜)為還原劑，分解體內(nèi)的各類氨過氧化物。它的主要生理機(jī) 能是保護(hù)血紅細(xì)胞和線粒體不被活性氧損傷，阻止體內(nèi)脂類過氧化反應(yīng)發(fā)生，在生物體抗 氧化方面發(fā)揮著極其重要的作用。
[0003] GPx能清除體內(nèi)活性氧，防止脂質(zhì)過氧化，因而具有治療由活性氧失衡而引起的各 種疾病，如白內(nèi)障、屯、腦血管病癥、各類炎癥、克山病等疾病的潛力，具有十分重要的藥用開 發(fā)前景。由于天然GPx的來源有限、穩(wěn)定性差等原因，致使它的藥用開發(fā)過程非常緩慢。因 此，對(duì)GPx進(jìn)行人工模擬，開發(fā)治療相關(guān)疾病的藥物越來越受到關(guān)注。Ebselen、環(huán)糊精等小 分子，W及半合成酶、抗體酶、生物印記酶等大分子模擬物已有研究，用來模擬谷脫甘膚過 氧化物酶，對(duì)設(shè)計(jì)和開發(fā)新的生物催化活性體系具有十分重要的意義，在醫(yī)藥、酶學(xué)方面具 有廣闊的應(yīng)用前景。
[0004] 納米材料具有特殊的表面、界面效應(yīng)，并且其尺寸與生物大分子的大小相當(dāng)。不僅 如此，金納米粒子還表現(xiàn)出良好的提高生物催化過程中電子的反轉(zhuǎn)速度特性，為利用納米 材料在生物催化體系中的應(yīng)用提供了重要的基礎(chǔ)。同時(shí)，金納米粒子所產(chǎn)生的表面等離子 體共振信號(hào)會(huì)隨著金納米粒子之間的距離發(fā)生改變而被用于生物傳感器件的開發(fā)。運(yùn)些特 征，為W金納米粒子為基礎(chǔ)構(gòu)建納米酶在生物傳感器領(lǐng)域中的應(yīng)用提供了保障。
[0005] 分子自組裝過程作為一種納米技術(shù)手段是構(gòu)建納米酶的一種有效方法，其過程簡(jiǎn) 便、易于操作。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所述一種過氧化物納米酶的構(gòu)建過程是W金納米粒子為載體，利用生物活 性五膚化RGDC)進(jìn)行自組裝，五膚分子中琉基與金納米粒子配位共價(jià)偶聯(lián)，得到具有高GPx 活性的過氧化物納米酶。此方法簡(jiǎn)便易于操作，并且具有良好的穩(wěn)定性。
[0007] 具體步驟如下：
[000引（1)利用巧樣酸鋼還原四氯金酸得到巧樣酸鋼包覆的金納米粒子溶膠(參考文獻(xiàn) J.曲ys.化em.C,2007,111,9172-9176)，然后將該金納米粒子溶液于8000~12000巧m離屯、 20~30min，沉淀再W高純水溶解并稀釋得到金納米粒子溶液，其最大等離子體共振吸收峰 (入。3、>52化111)處的吸光度值在0.8~1.0，制備得到金溶膠儲(chǔ)備液，儲(chǔ)備液的濃度為1.26~
[0009] (2)取ImL步驟（1)制備得到的金溶膠儲(chǔ)備液，用lOmM憐酸緩沖液PBS調(diào)節(jié)其pH = 8. ο~9.0,然后向其中加入6~30化、10-3Μ的生物活性五膚URGDC(購買于吉爾生化(上海)有 限公司，純度>98% )，搖勻后，4°C靜置20~30小時(shí)，即得到具有谷脫甘膚過氧化物酶活性的 過氧化物納米酶。
[0010] 生物活性五膚的氨基酸序列為Sec-Arg-Gly-Asp-切S(簡(jiǎn)稱URGDC)。其中Sec(U)中 含有酶的活性中屯、;Arg-Gly-Asp(RGD)能促進(jìn)納米酶與底物的結(jié)合，切s(C)側(cè)鏈中的琉基 可W和金納米粒子共價(jià)連接。
[0011] 金納米粒子的應(yīng)用是作為一種載體固定生物活性五膚，促進(jìn)納米酶與底物的充分 接觸，提高谷脫甘膚過氧化物酶的活力。
[0012]本發(fā)明具有W下特點(diǎn)：
[0013] (1)利用生物活性五膚(URGDC)修飾金屬納米材料表面進(jìn)行新型過氧化物人工模 擬酶的研究是本發(fā)明的特色之處。生物活性膚本身具有較低的GPx活性，而通過金納米粒子 的固定，納米酶較生物活性五膚的活力明顯提高，說明本發(fā)明中構(gòu)建納米酶的方法可行。
[0014] (2)納米酶的GPx活性是世界知名的小分子GPx模擬物化se len活性的5.1倍。
[0015] (3)納米酶構(gòu)建過程簡(jiǎn)便、易于操作。納米酶具有良好的水溶性，且所制備的納米 酶可W穩(wěn)定保存。
[0016] 本發(fā)明通過分子自組裝等納米技術(shù)手段利用金納米粒子成功的構(gòu)建了具有谷脫 甘膚過氧化物酶活性的納米酶。所構(gòu)建的納米酶性質(zhì)穩(wěn)定，并且該納米酶的活性較生物活 性五膚的活力顯著提高，具有良好的應(yīng)用前景。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 實(shí)施例1:金納米粒子的合成
[0018] 利用巧樣酸鋼還原四氯金酸得到巧樣酸鋼包覆的金納米粒子（參考文獻(xiàn) J.Phys.Chem.C 2007,111,9172-9176)。具體步驟如下，在100血雙口圓底燒瓶（中間的接口 用于連接回流冷凝管，側(cè)面的接口用于反應(yīng)過程中添加試劑）中，加入48.5mL高純水和 1.3mL四氯金酸溶液(0.01M)，在磁力攬拌下(轉(zhuǎn)速800巧m)加熱至沸騰、回流。通過側(cè)面的接 口，迅速加入0.2mL巧樣酸鋼溶液(0.2M)，繼續(xù)加熱lOmin，停止加熱并持續(xù)攬拌至自然冷 卻，其最大等離子體共振吸收峰在520nm。然后將該金納米粒子溶液于8,00化pm離屯、30min， 沉淀再W高純水溶解并稀釋至金納米粒子溶液在520nm處的吸光度值為0.9,制得金納米粒 子儲(chǔ)備液，儲(chǔ)備液的濃度為1.41nM。
[0019] 實(shí)施例2:納米酶的制備
[0020] 取2mL金納米粒子儲(chǔ)備液，加入510化憐酸緩沖液（10mM，pH 8)，搖勻后快速加入40 化URGDC溶液(0.15mM)(購買于吉爾生化(上海)有限公司，純度〉98%)，立即搖勻，4°C靜置 24小時(shí)，即得到具有谷脫甘膚過氧化物酶活性的過氧化物納米酶，在4°C保存。
[0021 ] 實(shí)施例3:納米酶的GPx活性
[0022]根據(jù) Wilson 方法(J. Am. Chem.Soc. 1989,111,5936-5939)測(cè)量生物活性五膚和納 米酶的GPx活力（反應(yīng)方程式下式所示），酶活力定義為37°C下，每分鐘氧化lymoL NADra所 需酶的量為一個(gè)活力單位(U)，酶的比活力定義為lynK)L的酶所具有的酶的活力單位數(shù)，表 示為U/皿oL。反應(yīng)在37°C、pH 7.0條件下，測(cè)得納米酶的GPx活力為5.05U/皿oL和生物活性 五膚URGDC的GPx活力為0.36U/皿oL。經(jīng)典商業(yè)化模擬物化selen的GPx活力為0.99U/皿oL (參考文獻(xiàn)Adv.化armacol. 1997，38，2229-2246)。因此，所制備的納米酶的活力高于生物活 性五膚和化selen酶模擬物的酶活力，具有高GPx酶活性。
[0023]
[0024] 實(shí)施例4:納米酶的穩(wěn)定性
[0025] 納米酶具有很好的穩(wěn)定性，該酶在pH 7.0、5mM憐酸緩沖溶液中Ξ個(gè)月活力保持 90%W 上。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種過氧化物納米酶的制備方法，其步驟如下： (1) 利用檸檬酸鈉還原四氯金酸得到檸檬酸鈉包覆的金納米粒子溶膠，然后將該金納 米粒子溶液于8000~12000rpm離心20~30min，沉淀再以高純水溶解并稀釋得到金納米粒 子溶液，其最大等離子體共振吸收峰λ ΜΧ~520nm處的吸光度值在0.8~1.0，制備得到金溶 膠儲(chǔ)備液，儲(chǔ)備液的濃度為1.26~1.57nM; (2) 取lmL步驟（1)制備得到的金溶膠儲(chǔ)備液，用10mM磷酸緩沖液roS調(diào)節(jié)其pH = 8.0~ 9.0，然后向其中加入6~30yL、10-3M的生物活性五肽URGDC，搖勻后，4°C靜置20~30小時(shí)，即 得到具有谷胱甘肽過氧化物酶活性的過氧化物納米酶。2. -種過氧化物納米酶，其特征在于:是由權(quán)利要求1所述的方法制備得到。
【文檔編號(hào)】C12N11/14GK106011125SQ201610403772
【公開日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年6月8日
【發(fā)明人】郭軼, 徐力, 沈娜, 李慧, 郝翠婷
【申請(qǐng)人】吉林大學(xué)