生產(chǎn)亞麻酸的圓紅冬孢酵母及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種生產(chǎn)α?亞麻酸的圓紅冬孢酵母及其制備方法。本發(fā)明通過從多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)胞內(nèi)克隆得到活性較高的Δ15脫飽和酶基因，連接至經(jīng)過改造的植物雙元表達(dá)載體pCAMBIA1300，轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens LBA4404)胞內(nèi)并通過共培養(yǎng)將Δ15脫飽和酶基因結(jié)合至圓紅冬孢酵母的基因組上，實(shí)現(xiàn)多形漢遜酵母Δ15脫飽和酶在圓紅冬孢酵母胞內(nèi)的過表達(dá)，從而增加α?亞麻酸在圓紅冬孢酵母胞內(nèi)的產(chǎn)量。
【專利說明】
生產(chǎn)亞麻酸的圓紅冬抱酵母及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及α-亞麻酸的生產(chǎn)領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種生產(chǎn)α-亞麻酸的圓紅冬抱酵母及 其制備方法和生產(chǎn)α-亞麻酸的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] α-亞麻酸(Cis Δ 9,12,15,英文縮寫ALA)屬于ω-3系列多不飽和脂肪酸，為全順式 9,12,15-十八碳Ξ締酸，它在人體內(nèi)不能合成，必須從體外食物中獲取，多W不飽和甘油醋 的形式存在于亞麻巧、沙棘巧、大豆等植物中。α-亞麻酸在人體內(nèi)通過一系列的碳鏈延長和 脫飽和反應(yīng)能夠被轉(zhuǎn)化為機(jī)體必需的二十碳五締酸化ΡΑ)和二十二碳六締酸(DHA)，然而， 曰-亞麻酸比ΕΡΑ和DHA的作用更好并且更安全，它是構(gòu)成人體組織細(xì)胞的主要成分，如果人 體缺乏，便會引起機(jī)體脂質(zhì)體代謝素亂，會直接導(dǎo)致疲勞、健忘、視力減退、免疫力下降、動(dòng) 脈粥樣硬化等癥狀的發(fā)生。目前國內(nèi)外已有明確報(bào)道:如果嬰幼兒童或青少年缺乏α-亞麻 酸，會嚴(yán)重影響智力的正常發(fā)育。美國國家食品藥品監(jiān)督管理局的研究證明，缺乏α-亞麻酸 將導(dǎo)致兒童大腦及視網(wǎng)膜發(fā)育遲緩，營養(yǎng)吸收不均衡或者不能被有效吸收，同時(shí)會導(dǎo)致注 意力不集中和智力發(fā)育遲緩、弱視、多動(dòng)癥、肥胖、厭食W及免疫力低下等多種癥狀和疾病。 成年人缺乏α-亞麻酸，體內(nèi)的維生素、礦物質(zhì)、氨基酸、蛋白質(zhì)等物質(zhì)不能被有效吸收和利 用，甚至?xí)霈F(xiàn)代謝素亂癥狀。
[0003] 從自然界植物中提取α-亞麻酸的成本高且產(chǎn)率低，不適合工業(yè)化生產(chǎn)的需求。近 年來利用微生物生產(chǎn)多不飽和脂肪酸成為研究熱點(diǎn)。利用微生物生產(chǎn)多不飽和脂肪酸具有 簡單、過程可控、易放大、不受天氣環(huán)境影響等優(yōu)點(diǎn)。圓紅冬抱酵母（Rhodosporidium toruloides)是自然界中為數(shù)不多的可W合成多不飽和脂肪酸的酵母，運(yùn)種產(chǎn)油酵母具有 營養(yǎng)需求簡單、易進(jìn)行放大和高密度培養(yǎng)、遺傳背景比較清楚等優(yōu)勢。圓紅冬抱酵母胞內(nèi)可 W合成并積累α-亞麻酸，然而產(chǎn)量并不高，因而強(qiáng)化圓紅冬抱酵母生產(chǎn)α-亞麻酸具有重要 的研究和應(yīng)用價(jià)值。目前利用培養(yǎng)和發(fā)酵優(yōu)化的方法對于增加圓紅冬抱酵母生產(chǎn)α-亞麻酸 的效果并不理想，所W必須從基因水平強(qiáng)化圓紅冬抱酵母胞內(nèi)α-亞麻酸的代謝途徑，進(jìn)而 達(dá)到增加 α-亞麻酸產(chǎn)量的目的。然而，圓紅冬抱酵母屬于粘紅酵母菌，對于運(yùn)類酵母的遺傳 操作方法比較有限。
[0004] 另外，α-亞麻酸在圓紅冬抱酵母胞內(nèi)的合成途徑是先由硬脂酸經(jīng)過Δ 9脫飽和酶 (FAD9)催化生成油酸;再由Δ 12脫飽和酶(FAD12)催化油酸生成亞油酸;最后經(jīng)過Δ 15脫飽 和酶(FAD15)催化生成α-亞麻酸。在運(yùn)條合成途徑中Δ 15脫飽和酶是主要的限速酶，正是由 于圓紅冬胞酵母胞內(nèi)A 15脫飽和酶的低活性限制了α-亞麻酸的產(chǎn)量。但是如何增強(qiáng)Δ 15脫 飽和酶的活性，強(qiáng)化從亞油酸到α-亞麻酸的合成途徑，進(jìn)而增加圓紅冬胞酵母合成α-亞麻 酸的產(chǎn)量是長期W來一直面臨的重要難題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)無法大幅度提高圓紅冬抱酵母(Rhodosporidium toruloides ACCC 20%1)生產(chǎn)α-亞麻酸的問題，本申請的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，從多形漢遜酵母化ansenula polymor地a)胞內(nèi)克隆得到的Δ 15脫飽和酶基因在圓紅冬抱酵母表達(dá)時(shí)顯示出高活性，將 其連接至植物雙元表達(dá)載體pCAMBIAl 300，轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens LBA4404)胞內(nèi)，并通過共培養(yǎng)將Δ 15脫飽和酶基因轉(zhuǎn)化至圓紅冬抱酵母，實(shí) 現(xiàn)具有高活性的多形漢遜酵母A 15脫飽和酶在圓紅冬抱酵母胞內(nèi)的過表達(dá)，從而能夠強(qiáng)化 圓紅冬抱酵母生產(chǎn)α-亞麻酸的能力。具體地，本發(fā)明提供W下內(nèi)容。
[0006] 本發(fā)明的一方面，提供一種圓紅冬抱酵母菌株，其包含多形漢遜酵母Δ 15脫飽和 酶基因表達(dá)元件。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，多形漢遜酵母A 15脫飽和酶基因表達(dá)元件包含 SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3所示的核巧酸序列。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，本 發(fā)明的圓紅冬抱酵母菌株能夠過表達(dá)具有高活性的多形漢遜酵母Δ 15脫飽和酶。在另一優(yōu) 選實(shí)施方案中，本發(fā)明的圓紅冬抱酵母菌株具有強(qiáng)化α-亞麻酸生產(chǎn)的能力。
[0007] 本發(fā)明的另一方面，提供一種圓紅冬抱酵母菌株的制備方法，其包括:將表達(dá)多形 漢遜酵母Δ 15脫飽和酶的基因或其片段引入圓紅冬抱酵母菌株，從而強(qiáng)化所述圓紅冬抱酵 母菌株的α-亞麻酸生產(chǎn)能力。優(yōu)選地，所述表達(dá)多形漢遜酵母A 15脫飽和酶的基因具有SEQ ID NO:2所示的核巧酸序列。
[0008] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，圓紅冬抱酵母菌株的制備方法包括：
[0009] Δ 15脫飽和酶基因表達(dá)載體PCAMBIA-FAD15的構(gòu)建，其中所述PCAMBIA-FAD15包含 沈Q ID NO: 1、SEQ ID NO:2和沈Q ID NO:3所示的核巧酸序列；
[0010] 利用所述PCAMBIA-FAD15質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌；
[0011] 將所述轉(zhuǎn)化的根癌農(nóng)桿菌與所述圓紅冬抱酵母共培養(yǎng)，從而將Δ 15脫飽和酶基因 轉(zhuǎn)化至所述圓紅冬抱酵母的基因組。
[0012] 優(yōu)選地，所述PCAMBIA-FAD15進(jìn)一步包含潮霉素抗性基因化YGK)表達(dá)元件。優(yōu)選 地，所述潮霉素抗性基因表達(dá)元件由GTO基因的啟動(dòng)子、潮霉素抗性基因和CaMV終止子組 成。優(yōu)選地，所述潮霉素抗性基因具SEQ ID NO: 10所示的核巧酸序列。
[0013] 本發(fā)明的再一方面，提供一種生產(chǎn)α-亞麻酸的方法，其包括培養(yǎng)本發(fā)明所述的圓 紅冬抱酵母菌株的步驟。
[0014] 在優(yōu)選地實(shí)施方案中，生產(chǎn)α-亞麻酸的方法包括W下步驟：
[001引。利用YEPD培養(yǎng)基培養(yǎng)活化的圓紅冬抱酵母菌株；
[0016] 2)收集步驟1)培養(yǎng)而得到的圓紅冬抱酵母菌株，接種至補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行補(bǔ)料 發(fā)酵，所述補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)基含有碳源、氮源和無機(jī)鹽，補(bǔ)料發(fā)酵過程中，總碳氮比始終維持 在 100:0.7 ~1.5。
[0017] 活化的圓紅冬抱酵母菌株可W直接采用活化狀態(tài)的菌株，也可由保藏狀態(tài)的菌株 活化而來。
[001引所述YEPD培養(yǎng)基或稱為YPD培養(yǎng)基，即，酵母浸出粉腺葡萄糖培養(yǎng)基（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium),按照常規(guī)配方配置即可。優(yōu)選地，按照如下配方配 置:8~12g/L酵母粉，8~20g/L蛋白腺，15~25g/L葡萄糖，抑為5.8~6.0。若制固體培養(yǎng)基， 加入10~20g/L瓊脂粉，優(yōu)選為15g/L瓊脂粉。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，YEPD培養(yǎng)基 按照如下配方配置:lOg/L酵母粉，lOg/L蛋白腺，20g/L葡萄糖，pH=5.8~6.0。
[0019]步驟1)和步驟2)可W在發(fā)酵罐中進(jìn)行。步驟2)中，補(bǔ)料發(fā)酵是指，通過補(bǔ)料流加所 述碳源維持所需的碳氮比。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明所述的生產(chǎn)α-亞麻酸的方法，優(yōu)選地，步驟2)中，所述碳源為含有葡萄 糖和木糖的混合碳源，所述氮源為谷氨酸鋼或蛋白腺，所述無機(jī)鹽含有鐘元素、儀元素和憐 兀素。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明所述的生產(chǎn)α-亞麻酸的方法，優(yōu)選地，步驟2)中，碳源為含有15~25g/ L葡萄糖和25~35g/L木糖的混合碳源，氮源為5.8~6.5g/L的谷氨酸鋼或4.6~5.5g/L的蛋 白腺，所述無機(jī)鹽包括0.3~0.7wt %的K出P〇4、0.1~0.3wt %的K2冊〇4和0.3~0.7wt %的 MgClsnU上各成分的含量是指各成分在補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)基中的含量。補(bǔ)料發(fā)酵過程中，通過 流加所述碳源的水溶液（即，通過流加含有15~25g/L的葡萄糖和25~35g/L的木糖的混合 碳源水溶液），使總碳氮比始終維持在100:0.8~1.2。更優(yōu)選地，步驟2)中，碳源為含有18~ 22g/L葡萄糖和28~32g/L木糖的混合碳源，氮源為5.8~6.2g/L的谷氨酸鋼或4.6~5.2g/L 的蛋白腺，所述無機(jī)鹽包括0.4~0.6wt %的KH2PO4、0.1~0.%的K2HPO4和0.4~0.6wt % 的MgCl2,補(bǔ)料發(fā)酵過程中，通過流加所述混合碳源的水溶液（即，通過流加含有18~22g/L 的葡萄糖和28~32g/L的木糖的混合碳源水溶液），使總碳氮比始終維持在100:0.9~1.1。 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式，步驟2)中，碳源為含20g/L葡萄糖和30g/L木糖的混合碳 源，氮源為6.2g/L的谷氨酸鋼或4.6g/L的蛋白腺，所述無機(jī)鹽包括0.52wt %的KH2PO4、 0.16wt %的K2HPO4和0.48wt %的MgCl2，補(bǔ)料發(fā)酵過程中，通過流加所述碳源的水溶液（即， 通過流加含有18~22g/L的葡萄糖和28~32g/L的木糖的混合碳源水溶液），使總碳氮比始 終維持在100:1。
[0022] 根據(jù)本發(fā)明所述的生產(chǎn)α-亞麻酸的方法，優(yōu)選地，步驟1)中，圓紅冬抱酵母菌株在 YEPD培養(yǎng)基培養(yǎng)至0D6日日為10 W上。更優(yōu)選地，培養(yǎng)至0〇6日日為12~15。
[0023] 根據(jù)本發(fā)明所述的生產(chǎn)α-亞麻酸的方法，優(yōu)選地，步驟2)中，補(bǔ)料發(fā)酵的時(shí)間為80 ~15化。更優(yōu)選地，補(bǔ)料發(fā)酵的時(shí)間為100~14化。
[0024] 根據(jù)本發(fā)明所述的生產(chǎn)α-亞麻酸的方法，優(yōu)選地，步驟1)中，圓紅冬抱酵母菌株在 YEP的夜體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為28~30°C，180~23化pm，培養(yǎng)40~60h;步驟2)中，補(bǔ)料 發(fā)酵的時(shí)間為100~13化。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，步驟1)中，圓紅冬抱酵母在 YEPD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為30°C，200rpm，培養(yǎng)4她;步驟2)中，補(bǔ)料發(fā)酵的時(shí)間為 120h〇
[0025] 根據(jù)本發(fā)明所述的生產(chǎn)α-亞麻酸的方法，優(yōu)選地，步驟2)中，收集步驟1)培養(yǎng)而得 的圓紅冬抱酵母菌體的方法為：7000~9000巧m離屯、，收集菌體，用濃度為15~25mM，抑= 6.5~7的憐酸鹽緩沖液洗涂菌體，再次離屯、收集菌體。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式， 步驟2)中，收集步驟1)培養(yǎng)而得的圓紅冬抱酵母菌體的方法為:80(K)rpm離屯、，收集菌體，用 20mM，pH=6.8的憐酸鹽緩沖液洗涂菌體，再次離屯、收集菌體。
[0026] 根據(jù)本發(fā)明所述的生產(chǎn)α-亞麻酸的方法，優(yōu)選地，步驟2)得到的發(fā)酵液用有機(jī)溶 劑提取總油脂，所述有機(jī)溶劑可W為本領(lǐng)域采用的各種提取微生物總油脂的有機(jī)溶劑。優(yōu) 選地，所述有機(jī)溶劑為體積比為2~5:1的正己燒和乙醇，更優(yōu)選為體積比為2.5~3.5:1的 正己燒和乙醇。
[0027] 根據(jù)本發(fā)明所述的生產(chǎn)α-亞麻酸的方法，優(yōu)選地，提取總油脂的方法為：7000~ 90(K)rpm離屯、所得發(fā)酵液，用pH=6.5~7的憐酸鹽緩沖液洗涂離屯、的菌體，最后用濃度為5 ~7mol/L的鹽酸重懸，70~90°C水浴酸解30~lOOmin;加入所述有機(jī)溶劑萃取其中的油脂， 重復(fù)萃取3~5次，合并上清液，蒸發(fā)所述有機(jī)溶劑后即得含α-亞麻酸的總油脂。根據(jù)本發(fā)明 的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，提取總油脂的方法為:80(K)rpm離屯、所得發(fā)酵液，用抑=6.8的憐酸 鹽緩沖液洗涂離屯、的菌體，最后用6mol/L的鹽酸重懸，80°C水浴酸解40min;加入所述有機(jī) 溶劑萃取其中的油脂，重復(fù)萃取3次，合并上清液，蒸發(fā)所述有機(jī)溶劑后即得含α-亞麻酸的 總油脂。
[00%]圓紅冬抱酵母胞內(nèi)油脂積累量能夠達(dá)到細(xì)胞干重的60% W上，但是生產(chǎn)出來的油 脂一般用作生物柴油等能源用途。本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)方法強(qiáng)化了圓紅冬抱酵母胞內(nèi)油脂中 曰-亞麻酸的產(chǎn)量，可用于保健品，提升了圓紅冬抱酵母油脂的利用價(jià)值。此外，采用本發(fā)明 優(yōu)選的方案中，亦即W葡萄糖和木糖作為混合碳源、W谷氨酸鋼或蛋白腺為優(yōu)化氮源來發(fā) 酵圓紅冬抱酵母，并保持發(fā)酵過程的碳氮比，運(yùn)樣可W顯著增加圓紅冬抱酵母胞內(nèi)合成曰- 亞麻酸的量。
【附圖說明】
[0029] 圖1、pCAMBIA-FAD15表達(dá)載體的構(gòu)建過程示意圖。
[0030] 圖2、利用重疊延伸PCR的方法得到Δ 15脫飽和酶基因表達(dá)框(GPD啟動(dòng)子+FAD15+ GPD終止子）。其中，Μ是標(biāo)記物（marker) ; 1、2分別是Δ 15脫飽和酶融合基因表達(dá)框 (2678bp)〇
[0031 ]圖3利用重疊延伸PCR的方法得到潮霉素抗性基因表達(dá)框(GPD啟動(dòng)子+HYGK)。其中 Μ是標(biāo)記物(marker) ;1是潮霉素抗性基因 HYG^表達(dá)框(2111bp)。
[0032] 圖4表示α-亞麻酸產(chǎn)量的對比的數(shù)據(jù)。其中，圖4A表示野生型圓紅冬抱酵母的α-亞 麻酸的產(chǎn)量;圖4Β表示圓紅冬抱酵母胞內(nèi)強(qiáng)化Δ 15脫飽和酶的表達(dá)后α-亞麻酸的產(chǎn)量。
【具體實(shí)施方式】
[0033] 下面通過具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于 此。
[0034] 除非特別聲明，本發(fā)明的表示重量百分比wt%。本發(fā)明的"mM"表示mmol/L。本 發(fā)明實(shí)施例中未限定配方的YEPD培養(yǎng)基均按照如下配方配置：10g/L酵母粉，10g/L蛋白腺， 20g/L葡萄糖，P冊.8~6.0。
[0035] 本發(fā)明中，優(yōu)選采用PCAMBIA1300載體來構(gòu)建Δ 15脫飽和酶基因表達(dá)載體，因?yàn)槟?夠高效地轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌。但是由于PCAMBIA1300載體上攜帶的CaMV 35S啟動(dòng)子是在植物 細(xì)胞中行使功能而在圓紅冬抱酵母胞內(nèi)無法發(fā)揮作用，所W要對表達(dá)A 15脫飽和酶基因的 載體PCAMBIA1300進(jìn)行改造。為此，本發(fā)明人創(chuàng)造性地將圓紅冬抱酵母的保守基因 3-憐酸甘 油醒脫氨酶（glyceraldehyde-3-地OS地ate dehy化ogenase ,GPD)基因的啟動(dòng)子和終止子 序列與多形漢遜酵母A 15脫飽和酶的開放閱讀框連接在一起組成表達(dá)元件，然后將其連接 在PCAMBIA1300載體上的多克隆位點(diǎn)。結(jié)果表明運(yùn)樣的表達(dá)元件能夠在圓紅冬抱酵母胞內(nèi) 高效表達(dá)具有高活性的A 15脫飽和酶。
[0036] 優(yōu)選地，為了能夠使潮霉素抗性基因在圓紅冬抱酵母中表達(dá)，本發(fā)明人創(chuàng)造性地 構(gòu)建了潮霉素抗性基因表達(dá)元件，并將該表達(dá)元件與PCAMBIA1300載體連接。優(yōu)選地，將圓 紅冬抱酵母3-憐酸甘油醒脫氨酶（肖17。日^1(1日117(1日-3-地〇3地日10(1日117化〇肖日]1日3日，6?〇)基 因的啟動(dòng)子與潮霉素抗性基因開放閱讀框(SEQ ID NO: 10)連接在一起組成表達(dá)元件，終止 子可用PCAMBIA1300載體自身攜帶的CaMV終止子。
[0037]接下來，將Δ 15脫飽和酶FAD15表達(dá)元件和潮霉素抗性基因表達(dá)元件與 pCAMBIAl 300載體的連接。連接方法包括：
[003引 1)用EcoRI和BamHI雙酶切連接的方法將Δ 15脫飽和酶FAD15表達(dá)元件連接在 pCAMBIAl 300載體上；
[0039] 2)用趾〇1和Bstxl雙酶切將潮霉素抗性基因表達(dá)元件連接到PCAMBIA1300載體上。
[0040] 需要說明的是，對于連接步驟1)和2)的順序沒有特別限定，可優(yōu)先進(jìn)行步驟1)，然 后再進(jìn)行步驟2)，反之亦可?？蛇x地，可同時(shí)進(jìn)行步驟1)和2)。
[0041 ]優(yōu)選地，本發(fā)明的圓紅冬抱酵母的制備方法中，包括PCAMBIA-FAD15質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根癌 農(nóng)桿菌。優(yōu)選地，采用熱擊轉(zhuǎn)化E.coil T1感受態(tài)細(xì)胞，富集培養(yǎng)后提取PCAMBIA-FAD15質(zhì) 粒，然后進(jìn)行根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化。
[0042] 優(yōu)選地，本發(fā)明的圓紅冬抱酵母的制備方法中，包括根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化圓紅冬抱酵 母的步驟。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)化方法包括將兩種菌液混合，共培養(yǎng)從而進(jìn)行轉(zhuǎn)化的方法。
[0043] 優(yōu)選地，本發(fā)明的圓紅冬抱酵母的制備方法還包括根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化圓紅冬抱酵母 后得到的重組子的驗(yàn)證步驟。驗(yàn)證方法可采用本領(lǐng)域內(nèi)通常使用的任何方法，包括但不限 于，PCR擴(kuò)增驗(yàn)證法、酶切驗(yàn)證法、免疫驗(yàn)證法W及酶活性驗(yàn)證法等。從操作方法及成本節(jié)約 角度，優(yōu)選PCR擴(kuò)增驗(yàn)證法。具體地，提取共培養(yǎng)后的圓紅冬抱酵母的基因組，并通過PCR擴(kuò) 增來確認(rèn)圓紅冬抱酵母中是否存在多形漢遜酵母A 15脫飽和酶基因。
[0044] 實(shí)施例
[0045] 1.菌種與實(shí)驗(yàn)材料
[0046] 圓紅冬抱酵母（Rhodosporidium toruloides ACCC 20：341)和多形漢遜酵母 (Hansenula polymorpha)購自中國農(nóng)業(yè)生物菌種保藏管理中屯、，根癌農(nóng)桿菌 (Agrobacterium tumefaciens LBA4404)購自普如汀生物技術(shù)（北京）有限公司。質(zhì)粒、基因 組提取試劑盒購自TIANGEN公司，載體pCAMBIAl300購自Biovector公司，Easy P化DNA聚合 酶購自全氏金公司，尼龍膜Hybond-N+膜購自Amer sham公司。限制性內(nèi)切酶購自肥B公司?；?學(xué)試劑購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，均為分析純。
[0047] 2. Δ 15脫飽和酶基因表達(dá)載體PCAMBIA-FAD15的構(gòu)建：
[0048] 1)多形漢遜酵母菌株和圓紅冬抱酵母菌株分別接種在含YEPD培養(yǎng)基的50mLS角 瓶中過夜培養(yǎng)化，離屯、收集菌體，分別提取兩種菌的基因組；
[0049] 2)W多形漢遜酵母和圓紅冬抱酵母的基因組為模板，使用引物pGPD-F(SEQ ID N0:4)和pGPD-R(SEQ ID N0:5)、tGPD-F(SEQ ID N0:8)和tGPD-R(SEQ ID N0:9)、FAD15-F (沈Q ID N0:6)和FAD15-R(SEQ ID N0:7)分別克隆得到圓紅冬抱酵母GPD的啟動(dòng)子(SEQ ID N0:1)和終止子序列（SEQ ID N0:3)W及多形漢遜酵母Δ 15脫飽和酶的開放閱讀框(SEQ ID N0:2)；
[0050] 3)使用重疊延伸PCR的方法將上述Ξ段核巧酸序列進(jìn)行拼接，重疊延伸PCR的方法 為:先將GPD啟動(dòng)子和Δ15脫飽和酶互為模板和引物進(jìn)行擴(kuò)增，條件為94°C預(yù)變性5min，94 °C變性40s，60°C退火3〇3,72°(：延伸1111111，20個(gè)循環(huán)；然后將產(chǎn)物取出加入引物口6口0斗和 FAD15-R再次進(jìn)行上述條件的擴(kuò)增，35個(gè)循環(huán)，即將得至化PD啟動(dòng)子和Δ 15脫飽和酶基因兩 個(gè)片段的融合序列；
[0051 ] 4)再次使用步驟3)的方法，引物是pGPD-F和和tGPD-R，將第Ξ個(gè)片段GTO的終止子 序列連接到前述融合片段的下游，獲得A 15脫飽和酶基因表達(dá)框（參見圖2)。用EcoRI和 BamHI雙酶切連接的方法將Ξ段序列融合片段連接在PCAMBIA1300載體上。
[0052] 3.潮霉素抗性基因表達(dá)載體的構(gòu)建：
[0053] 1)將圓紅冬抱酵母3-憐酸甘油醒脫氨酶(GPD)基因的啟動(dòng)子與潮霉素抗性基因開 放閱讀框連接在一起組成表達(dá)元件，終止子使用PCAMBIA1300載體自身攜帶的CaMV終止子。 先W圓紅冬抱酵母的基因組和載體PCAMBIA1300為模板，用引物proGPD-F(SEQ ID NO: 11) 和口'〇6口0-3(569 10^:12)、而邑斗（569 10^:13)和而邑-1?(569 10^:14)分別擴(kuò)增出 GPD啟動(dòng)子和潮霉素抗性序列；
[0054] 2)潮霉素抗性基因表達(dá)元件的構(gòu)建使用重疊延伸PCR法:先將GTO啟動(dòng)子和潮霉素 抗性基因開放閱讀框互為模板和引物進(jìn)行擴(kuò)增，條件為94°C預(yù)變性5min，94°C變性40s，58 。(:退火20s，72°C延伸403,20個(gè)循環(huán);然后將產(chǎn)物取出加入引物口'〇6口0斗和曲邑-1?再次進(jìn)行 上述條件的擴(kuò)增，35個(gè)循環(huán)，即將得到GTO啟動(dòng)子和潮霉素抗性基因兩個(gè)片段的融合序列；
[0055] 3)與Δ 15脫飽和酶基因表達(dá)載體的構(gòu)建過程相似，GPD啟動(dòng)子和潮霉素抗性基因 重疊延伸的引物分別為proGPD-F和proGPD-R、Hyg-F和Hyg-R。經(jīng)過重疊延伸PCR的方法融合 成為潮霉素抗性基因 HYGK表達(dá)框。結(jié)果參見圖3。潮霉素抗性基因與PCAMBIA1300載體連接 的酶切位點(diǎn)為化〇1和Bstxl。
[0056] 4. PCAMBIA-FAD15質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌
[0057] 1)將構(gòu)建好的載體PCAMBIA-FAD15在42°C熱擊轉(zhuǎn)化E.coil T1感受態(tài)細(xì)胞，富集培 養(yǎng)后提取PCAMBIA-FAD15質(zhì)粒進(jìn)行根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化；
[005引2)首先進(jìn)行根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備:挑取單菌落，接種于5ml LB培養(yǎng)基中， 28°C、220巧m，過夜培養(yǎng)。將1:50的菌液接種到100ml LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至006日日=0.5左右。4 °(：、5000巧111、10111111，棄上清。用40111110%甘油重懸，冰浴30111111。4°(：、5000巧111、10111111，棄上 清。加入2ml 10%的甘油重懸，分裝成每管100μΙ。在超凈工作臺中，將感受態(tài)與pCAMBIA- FAD15質(zhì)粒混合液轉(zhuǎn)入到預(yù)冷的0.2cm電擊杯中，放入電轉(zhuǎn)儀進(jìn)行電轉(zhuǎn)化。電轉(zhuǎn)化條件為：電 壓2400V、電容25μΡ、電阻200Ω ;電擊后立即向電擊杯中加入90化1 LB培養(yǎng)基并置于冰中 2min。將菌液轉(zhuǎn)入到1.5ml ΕΡ管，28°C、150rpm解育化，涂布在含有50μg/ml卡納霉素的LB固 體培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng)2~3d。
[0059] 5.根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化圓紅冬抱酵母
[0060] 分別挑取根癌農(nóng)桿菌和圓紅冬抱酵母單菌落于50μg/ml含卡納霉素的LB培養(yǎng)基和 YPD培養(yǎng)基中，28 °C，220巧m培養(yǎng)24h。5000巧m，5min收集菌體，WIM培養(yǎng)基（50μg/ml卡納霉 素)重懸菌體，稀釋至〇〇6日日=0.2，繼續(xù)培養(yǎng)化，至0〇6日日=0.6。W1:5稀釋圓紅冬抱酵母于新 鮮YPD培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)化，收集菌體，再次用IM培養(yǎng)基重懸，稀釋至OD600 = 0.6。兩種菌液 各取50μ1混合，將全部菌液涂于帶有尼龍膜Hybond-N+膜(Amersham公司，美國）的IM平板 上，25 °C暗培養(yǎng)4她。將Hybond-N+膜轉(zhuǎn)移至YPD (l〇〇μg/ml頭抱霉素+200μg/ml潮霉素)上，30 °C培養(yǎng)2-3d。挑取初篩的轉(zhuǎn)化子，在新的YPD(15化g/ml頭抱霉素+300μg/ml潮霉素)上劃線， 培養(yǎng)2-3d，挑取轉(zhuǎn)化子，提取基因組進(jìn)行PCR驗(yàn)證重組子。
[0061 ] 通過PCR驗(yàn)證得到5株本發(fā)明的圓紅冬抱酵母菌株，分別命名為1號至5號。
[0062] (IM培養(yǎng)基成分：基本培養(yǎng)基（MM):化2冊〇4 2g/L，KH2P〇4 1.45g/L，MgS〇4 · 7出0 0.6g/L,化Cl 0.3g/L，CaCl2*2H2〇 O.Olg/L,Glucose 2g/L，F(xiàn)eS〇4 0.001g/L，ZnS〇4*7H2〇 0.005g/L，CuS〇4 · 5此0 0.005g/L,曲B03 0.005g/L，MnS〇4 ·此0 0.005g/L,化2M0O4 · 2此0 0.005g/l，NH4N〇3 0.5g/L)，2-嗎嘟乙橫酸(MES)40mM，乙酷下香酬(AS)200yM，甘油0.5% )。
[0063] 6.圓紅冬抱酵母總油脂的檢測
[0064] 取1號圓紅冬抱酵母W及野生型圓紅冬抱酵母各10ml(5ml測生物量，5ml提油脂）， 離屯、收集菌體。測生物量的菌放入65°C烘2~3d;提油脂的菌加入5ml濃鹽酸和0.5ml此0， 80°C水浴比，然后加入2ml正己燒和0.75ml無水乙醇，混合液來萃取其中的油脂，此步重復(fù)3 次，合并上清液，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將機(jī)溶劑蒸干即得微生物油脂，氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀條 件:安捷倫6890N-5975C，HP-INN0WAX極性毛細(xì)管柱，0.25μπι X 250皿X 30m;載氣:氮?dú)?載氣 流量：1.OmL/min，恒定流量;上樣分流比為20:1;進(jìn)樣量進(jìn)樣口和檢測器溫度為280°C ; 升溫程序：180 °C保持Imin，10°C/min升溫至220°C，2°C/min升溫至240°C，保持5min。260°C 后運(yùn)行3min，全掃描。
[0065] 檢測結(jié)果附圖4所示，野生型圓紅冬抱酵母在優(yōu)化條件下α-亞麻酸的產(chǎn)量為 5.05%，而經(jīng)過Δ 15脫飽和酶強(qiáng)化過表達(dá)的圓紅冬抱酵母α-亞麻酸的產(chǎn)量達(dá)到了8.9%。
[0066] 另外，發(fā)明人W上述同相的方法檢測了本申請2號-5號菌株的α-亞麻酸的產(chǎn)量。結(jié) 果如下表1所示。
[0067] 表 1 [006引
[0069] 通過上述實(shí)驗(yàn)說明，多形漢遜酵母Δ 15脫飽和酶在圓紅冬抱酵母胞內(nèi)的表達(dá)確實(shí) 有助于α-亞麻酸的產(chǎn)量的提高。
[0070] 本發(fā)明并不限于上述實(shí)施方式，在不背離本發(fā)明的實(shí)質(zhì)內(nèi)容的情況下，本領(lǐng)域技 術(shù)人員可W想到的任何變形、改進(jìn)、替換均落入本發(fā)明的范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種圓紅冬孢酵母菌株，其包含多形漢遜酵母△ 15脫飽和酶基因表達(dá)元件。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的圓紅冬孢酵母菌株，其中所述多形漢遜酵母△ 15脫飽和酶基 因表達(dá)元件包含SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3所示的核苷酸序列。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的圓紅冬孢酵母菌株，其中所述圓紅冬孢酵母菌株過表達(dá)具 有活性的多形漢遜酵母A 15脫飽和酶。4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的圓紅冬孢酵母菌株，其中所述圓紅冬孢酵母菌株具有強(qiáng)化 α-亞麻酸生產(chǎn)的能力。5. -種圓紅冬孢酵母菌株的制備方法，其包括:將SEQ ID Ν0:2所示的核苷酸序列引入 圓紅冬孢酵母菌株，從而使所述圓紅冬孢酵母菌株過表達(dá)具有活性的多形漢遜酵母△ 15脫 飽和酶。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其包括： A 15脫飽和酶基因表達(dá)載體的構(gòu)建，其中所述表達(dá)載體包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列； 利用所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌以形成轉(zhuǎn)化的根癌農(nóng)桿菌； 將所述轉(zhuǎn)化的根癌農(nóng)桿菌與所述圓紅冬孢酵母共培養(yǎng)，從而將A 15脫飽和酶基因轉(zhuǎn)化 至所述圓紅冬孢酵母。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述表達(dá)載體進(jìn)一步包含潮霉素抗性基因表達(dá)元 件。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述潮霉素抗性基因表達(dá)元件由GPD基因的啟動(dòng) 子、潮霉素抗性基因和CaMV終止子組成。9. 一種生產(chǎn)α-亞麻酸的方法，其包括培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的圓紅冬孢酵 母菌株的步驟。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其包括以下步驟： 1) 培養(yǎng)活化的圓紅冬孢酵母菌株； 2) 收集步驟1)培養(yǎng)而得到的圓紅冬孢酵母菌株，接種至補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行補(bǔ)料發(fā) 酵，所述補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)基含有碳源、氮源和無機(jī)鹽，補(bǔ)料發(fā)酵過程中，總碳氮比始終維持在 100:0.7~1.5 〇
【文檔編號】C12N15/81GK106010993SQ201610408364
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年6月12日
【發(fā)明人】祁峰, 黃建忠, 張明亮, 孫磊, 江賢章, 鄒麗梅
【申請人】福建師范大學(xué)