專利名稱：：一種裂殖弧菌及利用其生產(chǎn)dha油脂的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種海洋真菌裂殖弧菌及利用其高密度發(fā)酵生產(chǎn)DHA油脂的方法，屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：二十二碳六烯酸(DHA)是一種重要的omega-3長鏈多不飽和脂肪酸，具有促進(jìn)腦細(xì)胞發(fā)育，降血脂，保護(hù)視力，抗癌，提高免疫力等重要生理功能，廣泛應(yīng)用在嬰幼兒食品及醫(yī)藥行業(yè)。傳統(tǒng)的DHA生產(chǎn)原料主要來源于魚油，但魚的種類、季節(jié)、地理位置等因素的差異造成了油含量和油中不飽和脂肪酸含量的不穩(wěn)定；魚油提取獲得的DHA膽固醇含量高，且含有大量的EPA(Eicosapetaenoicacid,22:5)及多種礦物質(zhì)；再加上魚油來源日漸緊缺，難以實(shí)現(xiàn)此種高價值產(chǎn)品在食品和醫(yī)藥行業(yè)中的廣泛應(yīng)用。為滿足DHA不斷增長的市場需求、克服從傳統(tǒng)魚油提取DHA的不足，近年來，科學(xué)工作者開展了利用海洋微生物發(fā)酵生產(chǎn)DHA的研究。常用的微生物包括隱甲藻、破囊弧菌、裂殖弧菌等，本發(fā)明所采用的菌種為裂殖弧菌。裂殖弧菌(Sc//zoc/^n'wm為一種海洋真菌，屬于真菌中的Chromophyta界，Heterokonta門，Thraustochytriales目，Thraustochytriaceae禾斗，Schizochytrium屬。裂殖弧菌具有較強(qiáng)的積累多不飽和脂肪酸的特性，且不飽和脂肪酸成分集中，主要為DHA和DPA，其他不飽和脂肪酸含量低。該菌使用安全，是DHA生產(chǎn)的優(yōu)良菌種，引起國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。目前國內(nèi)對DHA油脂制備的專利主要集中在以下幾方面(1)魚油來源的DHA油脂制備；(2)微生物來源的DHA油脂制備；(3)油脂的提取，純化及微膠囊化；(4)DHA油脂的應(yīng)用。其中，有四篇與本發(fā)明相關(guān)，CN200610125476.3所采用的菌種為隱甲藻，生物量為20-40g/L，胞內(nèi)含油量為20-50%;CN00135338.1，CN200410075426.X，CN200610028869.2均采用裂殖弧菌為生產(chǎn)菌，工藝和發(fā)酵方法較為傳統(tǒng)，僅為簡單的培養(yǎng)方法和培養(yǎng)條件的優(yōu)化，沒有詳細(xì)研究直接影響生物量積累的關(guān)鍵因素，導(dǎo)致生物量均不高，最高為42.5g/L，并沒有實(shí)現(xiàn)真正意義上的高密度發(fā)酵。低的生產(chǎn)效率增加了生產(chǎn)成本，致使微生物來源的DHA難以與魚油來源的DHA油脂形成明顯的價格優(yōu)勢。而DHA油脂為胞內(nèi)產(chǎn)物，生物量是高產(chǎn)的關(guān)鍵。因此，獲得DHA的高產(chǎn)菌株，并結(jié)業(yè)化推廣的關(guān)鍵所在。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種自主篩選的、能高產(chǎn)DHA的裂殖弧菌。本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題是提供上述裂殖弧菌高密度發(fā)酵生產(chǎn)DHA油脂的方法。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下一種高產(chǎn)DHA的生產(chǎn)菌是從東海海域收集的腐葉上采用松花粉垂釣法分離得到，編號為HX-308。通過培養(yǎng)、提取油脂并對其脂肪酸成分進(jìn)行檢測(如圖3)。從結(jié)果中可以看出其主要的長鏈多不飽和脂肪酸為二十二碳五烯酸(DPA)和二十二碳六烯酸(DHA)，其中DHA占總脂肪酸的含量在40%左右。飽和脂肪酸占總脂肪酸30%以下，主要為十四垸酸和十六烷酸。因此，該菌脂肪酸組成簡單，DHA含量高，具有很好的DHA生產(chǎn)能力。形態(tài)學(xué)驗(yàn)證在光學(xué)顯微鏡下觀察HX-308的形態(tài)及結(jié)構(gòu)，菌體為圓球形或橢球形，直徑在515微米，胞內(nèi)有明顯的顆粒狀物質(zhì)，細(xì)胞主要釆用分裂方式進(jìn)行繁殖。生長性能判定采用天然海水培養(yǎng)該菌，會出現(xiàn)側(cè)生不等長的雙鞭毛，一根細(xì)長，呈彎曲狀，另一根較短。在營養(yǎng)豐富的自配人工海水培養(yǎng)基培養(yǎng)該菌，采用分裂方式生長，不會出現(xiàn)鞭毛。細(xì)胞生長前期分裂旺盛，呈現(xiàn)二分裂、四分裂或八分裂的細(xì)胞，呈菊花狀，連在一起；中期細(xì)胞逐漸分裂開來，有各自的輪廓，但仍粘連在一起；中后期，細(xì)胞大量繁殖，細(xì)胞數(shù)目增多，呈聚集狀態(tài)(如圖l);后期，細(xì)胞增長不明顯，轉(zhuǎn)向油脂積累，但培養(yǎng)時間過長，細(xì)胞部分自溶。固體培養(yǎng)時，在自配ME固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，一般涂布后一天就有小圓粒狀的菌落出現(xiàn)，開始很小，乳白色；隨后菌落逐漸變大，顏色變深，逐漸變黃，估計(jì)后期有油脂的積累。根據(jù)上述脂肪酸組分分布情況，鞭毛結(jié)構(gòu)等形態(tài)學(xué)特征，判定其為破囊弧菌科微生物。據(jù)TheBiologyofFree-livingHetertrophiclagellaters,艮道[S.T.Moss,OxfordUniversityPress(1991)]，破囊弧菌科微生物主要包括八個屬(Labyrinthuloides,Aplanochytrium,Althornia,Japonochytrium,Ulkenia,Transtochytrium,Schizochytrium,Corallochytrium)，其中Labyrinthuloides細(xì)胞為橢圓形；Aplanochytrium采用靜態(tài)孢子繁殖；Althornia細(xì)胞并不呈聚集狀態(tài)；Japonochytrium細(xì)胞在胞外有隆起；Ulkenia從游動孢子囊中釋放孢子；Transtochytrium采用孢子繁殖；Corallochytrium不形成孢子，僅有一根鞭毛，以上描述與HX-308特性不符，而Schizochytrium的顯著特性是以二分裂方式繁殖，且大量繁殖后多個細(xì)胞積聚并形成孢子囊，與本菌HX-308生長特性相似，因此判斷該菌為裂殖弧菌屬，命名為Sc/^oc/^n'www.HX-308。為進(jìn)一步對所獲得的菌株進(jìn)行鑒定，借用分子生物學(xué)手段對其18sRNA序列進(jìn)行比對。發(fā)現(xiàn)本菌與Sc/z/zoc/^n'ww印.的18SRNA序列存在99%的同源性，因此判定本菌株屬于裂殖弧菌，命名為SW^oc&WKm取HX-308。目前該菌株保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC)，保藏單位地址武》又市，武漢大學(xué)，登記入冊的編號是CCTCCNo:M209059，保藏日期是2009年3月26日。以此菌作為生產(chǎn)菌株。利用上述裂殖弧菌生產(chǎn)DHA油脂的方法，以CCTCCNo:M209059菌株為出發(fā)菌株，在液體培養(yǎng)基中高密度發(fā)酵獲得菌體細(xì)胞，收集細(xì)胞經(jīng)破碎、萃取、精制獲得富含DHA的油脂。其中，所述的高密度發(fā)酵方法包括如下步驟(1)將保存在甘油管的菌株接入裝有50mL種子培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，在203(TC的搖床中，以150200rpm的轉(zhuǎn)速，培養(yǎng)24~48h，獲得一級種子；(2)將一級種子接入裝有100mL種子培養(yǎng)基的500mL搖瓶中，接種量210%(v/v)在203(TC的搖床中，以150200rpm的轉(zhuǎn)速，培養(yǎng)2448h，獲得二級種子；(3)將二級種子接入裝有種子培養(yǎng)基的一級種子罐中，接種量2~10%(v/v)，通氣量0.22vvm，攪拌轉(zhuǎn)速100200rpm，罐溫2030。C，培養(yǎng)24~48h，得到一級種子液；(4)將步驟(3)得到的一級種子液接入裝有種子培養(yǎng)基的二級種子罐中，接禾中量2~10%(v/v)，通氣量0.22wm，攪拌轉(zhuǎn)速100~200rpm，罐溫2030。C，培養(yǎng)24~48h，得到二級種子液；(5)步驟(4)得到的二級種子液接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，接種量210%(v/v),通氣量0.22vvm，攪拌轉(zhuǎn)速100200rpm，罐溫203(TC，加入消泡劑，發(fā)酵生產(chǎn)DHA油脂。上述種子和發(fā)酵培養(yǎng)基中，總滲透壓維持在10002000mOsm七"；其中，種子培養(yǎng)基C含量在1030g/L;發(fā)酵培養(yǎng)基C含量在2060g/L，N含量2.12.5g/L，S含量23g/L，P含量0.41.5g/L。上述培養(yǎng)基中，C源為葡萄糖、甘油或果糖，優(yōu)選葡萄糖；N源采用有機(jī)氮源禾口無機(jī)氮源，優(yōu)選酵母膏、牛肉膏、玉米衆(zhòng)、硝酸銨、硫酸銨或硝酸鉀，P源為磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀，s源為硫酸鎂或硫酸銨。步驟(5)中，所述的消泡劑優(yōu)選為siliconeSE-2，使用量為0.3g/L。步驟(5)中，發(fā)酵生產(chǎn)DHA油脂采用間歇式發(fā)酵或補(bǔ)料式發(fā)酵方法。其中，所述的破碎、萃取方法，采用如下三種方法之一(I)收集發(fā)酵獲得的菌體細(xì)胞，6(TC烘干，碾碎，用有機(jī)溶劑浸提12~18h,得到富含DHA的毛油；(II)收集發(fā)酵獲得的菌體細(xì)胞，采用破壁酶破碎細(xì)胞，再用有機(jī)溶劑浸提48h，得到富含DHA的毛油；方法II會少量的提取出脂溶性蛋白；(III)收集發(fā)酵獲得的菌體細(xì)胞，堿性環(huán)境下(pH10~12)使用均質(zhì)機(jī)機(jī)械破碎，破碎的細(xì)胞再用有機(jī)溶劑浸提4~8h，得到富含DHA的毛油。上述有機(jī)溶劑為正己垸、石油醚、乙醇和乙醚中的任意一種或幾種的混合。優(yōu)選正己垸和乙醇的混合液體，體積比為l:0.5~2。方法(II)中，所述的破壁酶為纖維素酶、蝸牛酶、溶菌酶中的一種或幾種的組合，添加量為2~8g/L。三種方法均可以有效的提取菌體中的油脂，本發(fā)明優(yōu)選的提取方法為方法(III)。其中，所述的精制方法包括脫膠、堿煉、脫色和脫臭工序中的任意一種或幾種的組合，以去除DHA毛油中的膠質(zhì)物質(zhì)，色素和腥臭氣味，獲得DHA的精油。本發(fā)明所采取的工藝方法同樣適用于其他裂殖弧菌屬的其他菌株，包括iSc/H'zocA[^n'wws;.ATCC18915，5t/z/zocA[yfr7'wwaggrega/^wATCC28209，5b/H'zoc/^fr/w/wsp.ATCC20888，5t/n'zoc/;[Kn'wws/.ATCC20889，/Sc/w'zoc/^fr/ww//wac/ww/wSR21,77w^wWoc/23;/riwmATCC28211,Sc/zfeoc/y^7.wwwa"groveiG13,77^aw5foc;/2>^7."mATCC18907，最適的菌種為CCTCCNo:M209059。有益效果本發(fā)明從自主篩選的菌株CCTCCNo:M209059出發(fā)，在詳細(xì)研究菌種生長特性基礎(chǔ)上，采用滲透壓平衡和元素供應(yīng)角度優(yōu)化微生物的培養(yǎng)方法，進(jìn)而提供了一種高密度發(fā)酵生產(chǎn)DHA的方法，并適合大規(guī)模生產(chǎn)，最終細(xì)胞干重達(dá)到70g/L，油脂含量達(dá)31.5g/L，DHA占總脂肪酸含量高于35%。同時，本發(fā)明還提供了一種從海洋微生物中提取微生物油脂和精制的方法，提取收率在90-95%左右，精制收率為75-85%，所獲得的DHA精油各項(xiàng)指標(biāo)符合食品添加劑標(biāo)準(zhǔn)，且含有生物活性物質(zhì)角鯊烯，且整套工藝簡單，操作方便，生物量和DHA含量較高，降低了發(fā)酵成本，適合工業(yè)化生產(chǎn)。圖1為本發(fā)明的裂殖弧菌HX-308菌體形態(tài)圖。圖2為油脂中角鯊烯質(zhì)譜圖。圖3為油脂中各脂肪酸組分GC分析結(jié)果。具體實(shí)施例方式根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結(jié)果僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。實(shí)施例l:菌株基本生長性能考察。對篩選獲得的菌株CCTCCNo:M20卯59進(jìn)行基本性能考察，包括不同液體培養(yǎng)基培養(yǎng)(見表l)、不同固體培養(yǎng)基培養(yǎng)(見表2)。表1不同液體培養(yǎng)基下裂殖弧菌培養(yǎng)形態(tài)及發(fā)酵結(jié)果培養(yǎng)基l培養(yǎng)基2培養(yǎng)基3培養(yǎng)基4i首養(yǎng)基5大部分細(xì)胞呈圓細(xì)胞呈不規(guī)細(xì)胞靜止不形，少量細(xì)胞變性，則球形，胞內(nèi)細(xì)胞靜止不細(xì)胞靜止不動，細(xì)胞分裂1呈不規(guī)則的橢圓形態(tài)狀，胞內(nèi)顆粒明顯，顆粒不明顯，動，不規(guī)則圓動，細(xì)胞聚集旺盛，呈現(xiàn)二出現(xiàn)游動孢形，無游動孢出現(xiàn)大的包分裂、四分出現(xiàn)游動孢子側(cè)生子側(cè)生不等子囊裂、甚至八分不等長的雙鞭毛。長雙鞭毛。裂狀態(tài)。生物量12.91g/L14.3g/L17.12g/L16.47g/L23.54g/L備注培養(yǎng)基1-4利用天然海水進(jìn)行培養(yǎng)，鹽濃度分別為(15，30，45，60g/L)，培養(yǎng)基中還包括40g/L葡萄糖，4g/L酵母膏。培養(yǎng)基5為自配的人工海水培養(yǎng)基，其中包括葡萄糖40g/L，酵母膏3g/L、KH2P044g/L、NaCl15g/L、MgS04'7H205g/L、KCl2g/L、MgCl23g/L,FeCl3.6H2O0.1g/L、谷氨酸鈉10g/L。總滲透壓為1092mOsm'L—、_表2不同固體培養(yǎng)基裂殖弧菌的培養(yǎng)特性__PDAGYP_LB_MLH_^_外基本不少量生菌落粘性較菌落呈白色，顆粒較小菌落呈乳黃色，后期黃觀長長大色加深鏡-細(xì)胞破細(xì)胞破爛細(xì)胞較小，呈圓形，部細(xì)胞呈規(guī)則圓形^_§_分變形_備注PDA、GYP、LB、MLH為微生物培養(yǎng)中常用的培養(yǎng)基，其成分略。ME:自配人工海水培養(yǎng)基在培養(yǎng)基5基礎(chǔ)上添加1.5-2%的瓊脂。有上述試驗(yàn)結(jié)果得出，當(dāng)種子處于靜止?fàn)顟B(tài)并采用分裂方式繁殖時，活力較高；且采用固體培養(yǎng)時優(yōu)選MLH或ME培養(yǎng)基。實(shí)施例2:裂殖弧菌滲透壓耐受性研究。裂殖弧菌為一種海洋真菌，較其他微生物有較強(qiáng)的抗?jié)B透壓能力，本實(shí)施例在初糖濃度100g/L基礎(chǔ)上，改變自配人工海水的濃度，選取滲透壓1208.56，1715.46，2729.26，3743.06，4756.86mOsnrL"五個梯度實(shí)驗(yàn)。裂殖弧菌在液體培養(yǎng)中主要有兩種存在形式，游動的細(xì)胞和靜止的包囊。前期菌體為了繁殖，鞭毛退化，被包囊包被，細(xì)胞在包囊中分裂繁殖；后期包囊破裂，細(xì)胞釋放，細(xì)胞呈現(xiàn)游動或者靜止兩種狀態(tài)，游動的細(xì)胞有鞭毛產(chǎn)生。在前兩個梯度中，裂殖弧菌分裂旺盛，細(xì)胞生長較快，在第二個梯度生物量達(dá)到最高；隨著滲透壓的升高，細(xì)胞個體變小，呈單個分散狀態(tài)，細(xì)胞生長被抑制，分裂周期延長，細(xì)胞密度較低；在第四個梯度中，裂殖弧菌基本呈現(xiàn)單個分散狀，大部分細(xì)胞處于游動狀態(tài)，細(xì)胞的游動消耗大量的能量，減少了菌體自身物質(zhì)的合成，對脂肪酸的積累不利；滲透壓進(jìn)一步提高，細(xì)胞呈現(xiàn)大包囊狀態(tài)，厚的包囊壁是細(xì)胞很難釋放，延緩了細(xì)胞的生長，結(jié)果如表3。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>實(shí)施例3:氮、磷、硫元素供應(yīng)對裂殖弧菌生物量及DHA油脂含量的影響。在250ml帶凹槽的搖瓶中，保持實(shí)施例2中最適滲透壓(1715.46mOsm丄")條件下，優(yōu)化氮、磷、硫等元素的供應(yīng)，考察其對生物量及油脂含量的影響。氮源選用酵母膏和銨鹽，保持酵母膏濃度不變，改變銨鹽濃度，選取最終氮濃度為0.8742，1.2985，1.7227，2.1470，2.517g/L五個梯度實(shí)驗(yàn)，比較其對生物量和脂肪酸含量的影響，結(jié)果見表4。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>氮源濃度與脂肪酸積累密切相關(guān)。充足的氮源能保證細(xì)胞生長的快速進(jìn)行，而脂肪酸積累是在氮源受限制的條件下發(fā)生的，因此合適的初始氮濃度決定了裂殖弧菌體內(nèi)脂肪酸含量。由表4結(jié)果可知，隨氮源濃度的增加，裂殖弧菌生物量逐漸上升，而脂肪酸占生物量百分比呈上升后下降趨勢，在氮源濃度為1.2985g/L時最高為32.88%，而脂肪酸含量在氮源濃度為2.1470g/L條件下最高?？梢姷垂?yīng)在2.1~2.5g/L之間利于生物以硫酸鹽為硫元素的供應(yīng)源，選取硫元素0.667，1.334，2.001，2.668，3.335g/L五個梯度，比較其對生物量和油含量的影響，結(jié)果如表5。表5不同硫元素濃度下生物量和脂肪酸含量比較硫元素梯度油脂含量DHA占總脂肪酸含0.66716.21.234.30%1.33427.24.833.50%2.00152.610.341.43%2.66856.817.136.44%3.33554.215.322.75%硫是細(xì)胞組成中不可缺少的的元素之一，其中半胱氨酸、蛋氨酸、同型半胱氨酸和?；撬岬劝被岷鸵恍┏Ｒ姷拿妇辛蛟?，硫元素是否充足供應(yīng)直接影響細(xì)胞的生長和生物量。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，隨著硫元素濃度的增高，生物量和油脂含量均有明顯提升，脂肪酸占生物量的比例變化不大。在硫濃度為2.668g/L時，生物量達(dá)56.8g/L，油脂含量為17.1g/L，再增加硫元素的供應(yīng)，生物量和油含量變化不大，因此選用，硫元素的供應(yīng)濃度為2~3g/L。表6不同磷元素濃度下生物量和脂肪酸含量比較磷元素梯度生物量油脂含量DHA占總脂肪酸0.45652.616.230.79%0.91252.619.236.50%1.36856.612.832.61%1.82459.510.331.31%2.2860.87.228.8線2.73659.86.225.36%以KH2P04為磷元素的供應(yīng)源，選取2，4，6，8，10，15g/L(相當(dāng)于磷元素濃度0.456,0.912，1.368，1.824，2.28，2.736g/L)六個梯度，比較其對生物量和脂肪酸含量的影響，結(jié)果如表6。磷是微生物生長的限制因子之一，無機(jī)磷參與胞內(nèi)多種初級^f戈i射反應(yīng)，控制菌體的DNA，RNA和蛋白質(zhì)的合成，同時也控制糖代謝，細(xì)胞呼吸和胞內(nèi)的ATP水平。由圖中數(shù)據(jù)可知，隨著磷濃度的升高，生物量不斷增加，在磷濃度為2.28g/L條件下，生物量達(dá)到最高為60.8g/L，隨即降低，而脂肪酸含量前期上升，在磷含量繼續(xù)升高條件下，呈現(xiàn)下降趨勢。這可能是因?yàn)殡S著無機(jī)磷濃度的增加，磷酸戊糖途，5的代謝活性降低，糖酵解途徑的活性大幅度提高。糖酵解途徑的暢通進(jìn)行保證菌體的正常生長，而磷酸戊糖途徑是提供NADPH的主要途徑，NADPH的供應(yīng)與脂肪酸的^R累密切相關(guān)，在磷濃度過高條件下，磷酸戊糖途徑的降低抑制了菌體油脂的積累。因lt匕，為保證脂肪酸占總生物量高的比例，選取磷濃度為0.41.5g/L。實(shí)施例4:裂殖弧菌的間歇式發(fā)酵(1)將保存在甘油管的CCTCCNo:M209059接入裝有50mL種子培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，在25。C的搖床中，以180rpm的轉(zhuǎn)速，培養(yǎng)30h，獲得一級種子；(2)將一級種子接入裝有100mL種子培養(yǎng)基的500mL搖瓶中，接種量5%(v/v)在25'C的搖床中，以180rpm的轉(zhuǎn)速，培養(yǎng)30h，獲得二級種子；G)將二級種子接入裝有70L種子培養(yǎng)基的100L—級種子罐中，接種量5%(v/v)，通氣量lwm，攪拌轉(zhuǎn)速120rpm，罐溫25。C，培養(yǎng)25h，得到一級種子液；(4)將步驟(3)得到的一級種子液接入裝有1000L種子培養(yǎng)基的1.5mS二級種子罐中，接種量7。/。(v/v)，通氣量lvvm，攪拌轉(zhuǎn)速120rpm，罐溫25'C，培養(yǎng)30h，得到二級種子液；(5)步驟(4)得到的二級種子液接入裝有5mS發(fā)酵培養(yǎng)基的7i^發(fā)酵罐中，接種量7%(v/v)，通氣量lvvm，攪拌轉(zhuǎn)速120rpm，罐溫25。C，加入消泡劑siliconeSE-2(使用量為0.3g/L)，發(fā)酵生產(chǎn)3天，得DHA油脂。發(fā)酵結(jié)果見表9。培養(yǎng)基配方見表7、8:表7種子培養(yǎng)基配方物質(zhì)濃度(g/L)物質(zhì)濃度(g/L)MgCl23CaCl2.2H201KH2P044酵母膏2谷氨酸鈉10KC12(續(xù)表7)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>實(shí)施例5:流加模式裂殖弧菌的高密度發(fā)酵。如實(shí)施例4方法(1)-(4)種子培養(yǎng)，將得到的二級種子液接入裝有51113發(fā)酵培養(yǎng)基的71113發(fā)酵罐中，接種量7。/。(v/v)，通氣量lvvm，攪拌轉(zhuǎn)速120rpm，罐溫30'C，加入消泡劑siliconeSE-2(使用量為0.3g/L)，采用流加發(fā)酵模式，在葡萄糖濃度降低至1020g/L左右時，流加500g/L的葡萄糖液，至糖濃度為50~100/L，發(fā)酵生產(chǎn)5天，得DHA油脂。發(fā)酵結(jié)果見表IO。培養(yǎng)基配方同實(shí)施例7。表10流加發(fā)酵數(shù)據(jù)表<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>可見，后期補(bǔ)糖，油脂含量得到了較大提升。發(fā)酵過程可分為菌體生長和油脂積累階段，前期營養(yǎng)物質(zhì)豐富，菌體大量合成細(xì)胞，生物量獲得大的積累，后期氮源被消耗，給微生物創(chuàng)造一個高的碳氮比環(huán)境，油脂大量積累，本發(fā)酵工藝成功實(shí)現(xiàn)了微藻高密度培養(yǎng)和油脂高效積累。表11裂殖弧菌HX-308胞內(nèi)脂肪酸分布情況脂肪酸成分占總脂肪酸含量(％)C14:05.85C15:00.51C16:024.15C16:l1.83C17:00.87C18:03.31C18:l4.34C22:518.01C22:641.13胞內(nèi)脂肪酸分布見表ll，可以看出DHA和DPA是裂殖弧菌胞內(nèi)主要的多不飽和脂肪酸，DHA含量在40%左右，其他不飽和脂肪酸主要為短鏈的飽和脂肪酸包括十四垸酸、軟脂酸、硬脂酸和少量的但不飽和脂肪酸，基本不含EPA。其中十四垸酸含量在5%左右，降低了其對人體健康的負(fù)面影響。對胞內(nèi)其他成分分析，發(fā)現(xiàn)除脂肪酸外，還含有較多的角鯊烯(見圖2)和類胡蘿卜素。其中角鯊烯是一種無毒性的具有防病治病作用的海洋生物活性物質(zhì)，而類胡蘿卜素可以防止不飽和脂肪酸的氧化。這兩種物質(zhì)在其他文獻(xiàn)中未見報(bào)道，其存在提高了本發(fā)明DHA油脂的營養(yǎng)性和特殊性。實(shí)施例6:油脂的提取及精制。按照本專利提供的培養(yǎng)方法進(jìn)行71113罐發(fā)酵，收獲藻體。將發(fā)酵液倒入溶劑罐中，添加50kgCaCl2，使細(xì)胞絮凝沉淀，靜置后，將上層溶液放出；用離心機(jī)將上述獲得的菌體離心，實(shí)現(xiàn)進(jìn)一步的固液分離。用NaOH配制pH為12的水溶液，將上步得到的菌體倒入pH12的水溶液中，再送入膠體磨中，將物料磨成小顆粒狀，送入均質(zhì)機(jī)中高壓破碎，獲得破碎的菌體。將其倒入萃取罐，按照水物料正己烷=1:1:6的比例進(jìn)行萃取，攪拌30min左右，停止攪拌，靜置分層。取上層溶液通過減壓蒸發(fā)器將正己烷蒸出，回收溶劑，獲得DHA粗油165kg。DHA毛油加入磷酸脫膠，NaOH堿煉脫酸，中和油脂中游離的脂肪酸，采用活性炭和白土脫色除去油脂中的色素及其他雜質(zhì)，采用過飽和蒸汽除去油脂中的臭味，獲得較高品質(zhì)的DHA精油144kg。按照上述檢測方法分析發(fā)酵液生物量、油含量、DHA含量，該實(shí)驗(yàn)具體實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見表12。表12DHA精油的檢測結(jié)果7m3罐數(shù)據(jù)生物量粗油含量精油油含量精制收率355kg165kg144kg87%實(shí)施例7:油脂品質(zhì)測定。根據(jù)GB/T5009.76-2003《食品添加劑中砷的測定》、GB/T5009.75-2003《食品添加劑中鉛的測定》、ENISO660-1999《動植物油脂酸價和酸度的測定》、GB/T4789.2-2003《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測定》、GB/T4789.3-2003《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸桿菌群測定》、GB/T4789.4-2003《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門氏菌測定》、GB/T4789.5-2003《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)志賀氏菌測定》所提供的方法對所獲得的精油進(jìn)行品質(zhì)測定，結(jié)果見表13，各項(xiàng)指標(biāo)均達(dá)到技術(shù)要求。表13DHA精油的品質(zhì)測定結(jié)果檢驗(yàn)項(xiàng)目單位技術(shù)要求檢驗(yàn)結(jié)果砷(以As計(jì))mg/Kg0.02鉛(以Pb計(jì))mg/Kg50.50.05酸價(以KOH計(jì))mg/Kg1菌落總數(shù)cfU/g一<10大腸桿菌MPN/100g—<30沙門氏菌一—未檢出志賀氏菌——未檢出權(quán)利要求1、一種裂殖弧菌，其分類命名為裂殖弧菌(Schizochytriumsp.)，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏編號為CCTCCNoM209059。2、一種利用權(quán)利要求1所述的裂殖弧菌生產(chǎn)DHA油脂的方法，其特征在于以CCTCCNo:M209059菌株為出發(fā)菌株，在液體培養(yǎng)基中高密度發(fā)酵獲得菌體細(xì)胞，收集細(xì)胞經(jīng)破碎、萃取、精制獲得富含DHA的油脂。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用裂殖弧菌生產(chǎn)DHA油脂的方法，其特征在于所述的高密度發(fā)酵方法包括如下步驟(1)將保存在甘油管的菌株接入裝有50mL種子培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，在203(TC的搖床中，以150~200rpm的轉(zhuǎn)速，培養(yǎng)24~48h，獲得一級種子；(2)將一級種子接入裝有l(wèi)OOmL種子培養(yǎng)基的500mL搖瓶中，接種量2~10%(v/v)在2030'C的搖床中，以150-200卬m的轉(zhuǎn)速，培養(yǎng)24~48h，獲得二級種子；(3)將二級種子接入裝有種子培養(yǎng)基的一級種子罐中，接種量2~10%(v/v)，通氣量0.22wm，攪拌轉(zhuǎn)速100200rpm，罐溫203(TC，培養(yǎng)24~48h，得到一級種子液；(4)將步驟(3)得到的一級種子液接入裝有種子培養(yǎng)基的二級種子罐中，接種量2~10%(v/v)，通氣量0.22vvm，攪拌轉(zhuǎn)速100200rpm，罐溫2030。C，培養(yǎng)24~48h，得到二級種子液；(5)步驟(4)得到的二級種子液接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，接種量2~10%(v/v)，通氣量0.22vvm，攪拌轉(zhuǎn)速100200rpm，罐溫2030'C，加入消泡劑，發(fā)酵生產(chǎn)DHA油脂。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的利用裂殖弧菌生產(chǎn)DHA油脂的方法，其特征在于所述的培養(yǎng)基，總滲透壓維持在10002000mOsm丄"；其中，種子培養(yǎng)基C含量在10~30g/L;發(fā)酵培養(yǎng)基C含量在20~60g/L，N含量2.1~2.5g/L，S含量2~3g/L，P含量0.4~1.5g/L。5、根據(jù)權(quán)利要求24中任意一項(xiàng)所述的利用裂殖弧菌生產(chǎn)DHA油脂的方法，其特征在于培養(yǎng)基中，C源為葡萄糖、甘油或果糖；N源為酵母膏、牛肉膏、玉米漿、硝酸銨、硫酸銨或硝酸鉀，P源為磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀，S源為硫酸鎂或硫酸銨。6、根據(jù)權(quán)利要求3所述的利用裂殖弧菌生產(chǎn)DHA油脂的方法，其特征在于步驟(5)中，所述的消泡劑為siliconeSE-2，使用量為0.3g/L。7、根據(jù)權(quán)利要求3所述的利用裂殖弧菌生產(chǎn)DHA油脂的方法，其特征在于步驟(5)中，發(fā)酵生產(chǎn)DHA油脂釆用間歇式發(fā)酵或補(bǔ)料式發(fā)酵方法。8、根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用裂殖弧菌生產(chǎn)DHA油脂的方法，其特征在于所述的破碎、萃取方法，采用如下三種方法之一(I)收集發(fā)酵獲得的菌體細(xì)胞，6(TC烘干，碾碎，用有機(jī)溶劑浸提1218h，得到富含DHA的毛油；(II)收集發(fā)酵獲得的菌體細(xì)胞，采用破壁酶破碎細(xì)胞，再用有機(jī)溶劑浸提48h，得到富含DHA的毛油；(m)收集發(fā)酵獲得的菌體細(xì)胞，堿性環(huán)境下使用均質(zhì)機(jī)機(jī)械破碎，破碎的細(xì)胞再用有機(jī)溶劑浸提4~8h，得到富含DHA的毛油。9、根據(jù)權(quán)利要求8所述的利用裂殖弧菌生產(chǎn)DHA油脂的方法，其特征在于所述的有機(jī)溶劑為正己烷、石油醚、乙醇和乙醚中的任意一種或幾種的混合。10、根據(jù)權(quán)利要求8所述的利用裂殖弧菌生產(chǎn)DHA油脂的方法，其特征在于方法(II)中所述的破壁酶為纖維素酶、蝸牛酶、溶菌酶中的一種或幾種的組合，添加量為2-8g/L。11、根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用裂殖弧菌生產(chǎn)DHA油脂的方法，其特征在于所述的精制方法包括脫膠、堿煉、脫色和脫臭工序中的任意一種或幾種的組合。全文摘要本發(fā)明公開了一種裂殖弧菌，其分類命名為裂殖弧菌(Schizochytriumsp.)，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏編號為CCTCCNo.M209059。本發(fā)明還公開了利用上述裂殖弧菌生產(chǎn)DHA油脂的方法。本發(fā)明從滲透壓和元素供應(yīng)角度優(yōu)化菌株發(fā)酵培養(yǎng)基，并結(jié)合流加策略，實(shí)現(xiàn)微藻的高密度發(fā)酵，最終細(xì)胞干重達(dá)到70g/L，油脂含量達(dá)31.5g/L，DHA占總脂肪酸含量高于35％。通過本發(fā)明方法所獲得的DHA精油各項(xiàng)指標(biāo)符合食品添加劑標(biāo)準(zhǔn)，且含有生物活性物質(zhì)角鯊烯，整套工藝簡單，操作方便，生物量和DHA含量較高，降低了發(fā)酵成本，適合工業(yè)化生產(chǎn)。文檔編號C12P7/64GK101575584SQ200910033869公開日2009年11月11日申請日期2009年6月18日優(yōu)先權(quán)日2009年6月18日發(fā)明者任路靜,娟李,肖愛華,金立晶,和黃申請人:南京工業(yè)大學(xué)