一種柑桔流膠病的分離鑒定方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種柑桔枝干流膠病的分離鑒定方法，包括：選取采集的柑桔枝干，將枝干表面用75％酒精擦拭消毒、晾干，用消毒剪刀剪出枝干橫截面，選取部分顯褐色橫截面，表面消毒后，取柑桔枝干有流膠病和無(wú)流膠病交界處；將莖段放入選擇性培養(yǎng)基中，在10℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4?5天，挑取白色菌絲進(jìn)行純化、保存。本發(fā)明提供了一種柑桔流膠病的病原菌的分離、培養(yǎng)和鑒定方法，實(shí)現(xiàn)了柑桔流膠病的病原菌的體外分離和培養(yǎng)，并能實(shí)現(xiàn)柑桔流膠病的病原菌鑒定。
【專利說(shuō)明】
-種巧枯流膠病的分離鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于植物病原菌分離技術(shù)領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種相枯流膠病的分離鑒定方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 相枯流膠病主要發(fā)生在主干上，其次為主枝，小枝上也可發(fā)生。病斑不定型，病部 皮層變褐色，水潰狀，并開(kāi)裂和流膠。病樹(shù)果實(shí)小，提前轉(zhuǎn)黃，味酸。W高溫多雨的季節(jié)發(fā)病 較重，菌核引起的流膠W冬季為重。果園長(zhǎng)期積水、±壤黏重、樹(shù)冠郁閉有利其發(fā)生。
[0003] 現(xiàn)有的相枯流膠病病原菌分離困難。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種相枯流膠病的分離鑒定方法，旨在解決因相橘流膠病 病部濕度大，在病部極易附著大量的腐生菌，在進(jìn)行一般組織分離時(shí)，由于其主要病原菌寄 生疫霉的生長(zhǎng)速度較慢，而雜菌生長(zhǎng)速度較快，加上病原菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分的選擇性，使其極難 分離出來(lái)的問(wèn)題。
[0005] 本發(fā)明是運(yùn)樣實(shí)現(xiàn)的，一種相枯流膠病的分離鑒定方法，所述相枯流膠病的分離 鑒定方法包括W下步驟：
[0006] 步驟一，選取采集的相枯枝干，將枝干表面用75%酒精擦拭消毒、驚干，用消毒剪 刀剪出枝干橫截面，選取部分顯褐色橫截面，表面消毒后，取相枯枝干有流膠病和無(wú)流膠病 交界處；
[0007] 步驟二，將莖段放入選擇性培養(yǎng)基中（燕麥片28g，瓊脂24g，水1000ml，混合煮沸， 分裝Ξ角瓶中滅菌，冷卻至45°C，加氨節(jié)青霉素，利福平，多菌靈)培養(yǎng)基利用，在10°C光照 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4-5天，挑取白色菌絲進(jìn)行純化、保存。
[000引進(jìn)一步，所述步驟二之后對(duì)病原菌的電子顯微鏡檢測(cè)和病原菌的PCR鑒定。
[0009] 進(jìn)一步，所述選擇性培養(yǎng)基的制備方法包括:燕麥片28g，瓊脂24g，水1000ml，混合 煮沸，分裝Ξ角瓶中滅菌，冷卻至45°C，利用氨節(jié)青霉素抑制細(xì)菌雜菌生長(zhǎng)，加250mg，利用 利福平防雜菌污染，加 lOmg，利用多菌靈防止霉菌污染，加 lOOmg。
[0010] 進(jìn)一步，所述病原菌的PCR鑒定方法包括：
[0011] 通過(guò)氯仿/異戊醇法抽提菌株的基因組DNA，用口Sl/ItTS4兩個(gè)通用引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，得到rDNA片段，產(chǎn)物經(jīng)回收并測(cè)序，將所得到的序列登錄到網(wǎng)站進(jìn)行BLAST比對(duì)，該菌 株rDNA為寄生疫霉;另外一株菌為厚垣鑲刀菌，可參與侵染。
[0012] 本發(fā)明提供的相枯流膠病的分離鑒定方法，可W最大程度上減小枝干流膠病部周 邊腐生菌造成的分離困難;提供了一種相枯流膠病的病原菌的分離、培養(yǎng)和鑒定方法，實(shí)現(xiàn) 了相枯流膠病的病原菌的體外分離和培養(yǎng)，并能實(shí)現(xiàn)相枯流膠病的病原菌鑒定。
【附圖說(shuō)明】
[0013] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的相枯流膠病的分離鑒定方法流程圖。
【具體實(shí)施方式】
[0014] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，W下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明 進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用W解釋本發(fā)明，并不用于 限定本發(fā)明。
[0015] 下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用原理作詳細(xì)的描述。
[0016] 如圖1所示，本發(fā)明實(shí)施例的相枯流膠病的分離鑒定方法包括W下步驟：
[0017] S101:選取采集到的相枯枝干，將枝干表面用75%酒精擦拭消毒、驚干，用消毒剪 刀剪出枝干橫截面，選取部分顯褐色橫截面，表面消毒后，取相枯枝干有流膠病和無(wú)流膠病 交界處；
[0018] S102:將莖段放入選擇性培養(yǎng)基中，在1(TC光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4-5天，挑取白色菌 絲進(jìn)行純化、保存；
[0019] S103:病原菌的電子顯微鏡檢測(cè)和病原菌的PCR鑒定。
[0020] 所述選擇性培養(yǎng)基的制備方法包括:燕麥片28g，瓊脂24g，水1000ml，混合煮沸，分 裝Ξ角瓶中滅菌，冷卻至45°C，利用氨節(jié)青霉素抑制細(xì)菌雜菌生長(zhǎng)，加250mg，利用利福平防 雜困括染，加 lOmg，利用多困靈防止霉困括染，加 lOOmg。
[0021] 病原菌的PCR鑒定方法包括：
[0022] 通過(guò)氯仿/異戊醇法抽提菌株的基因組DNA，用口Sl/ItTS4兩個(gè)通用引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，得到rDNA片段，產(chǎn)物經(jīng)回收并測(cè)序，將所得到的序列登錄到網(wǎng)站進(jìn)行BLAST比對(duì)，該菌 株rDNA ITS核巧酸序列比對(duì)結(jié)果為SEQ ID N0:1;

[0027] 為厚垣鑲刀菌，可參與侵染，引起流膠病。
[0028] 菌絲塊接種離體冰糖澄葉片
[0029] 用ImL移液器吸頭將寄生疫霉菌固體培養(yǎng)基打孔，形成大小一致的菌絲塊，用牙簽 將菌絲塊接種在展開(kāi)的冰糖澄葉片或莖桿上，滴加適量的滅菌蒸饋水，W使菌絲塊緊密貼 附在葉子過(guò)莖桿表明，葉柄或莖桿基部用濕潤(rùn)的脫脂棉包裹，將葉片或莖桿放于底部鋪有 濾紙的托盤中，用保鮮膜封好保濕，25°C度培養(yǎng)，4天左右可有明顯癥狀。同時(shí)分離出來(lái)的厚 垣鑲刀菌，可參與復(fù)合侵染，引起離體葉片及莖桿發(fā)病。
[0030] W上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用W限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精 神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種柑桔流膠病的分離鑒定方法，其特征在于，所述柑桔流膠病的分離鑒定方法包 括以下步驟： 步驟一，選取采集的柑桔枝干，將枝干表面用75%酒精擦拭消毒、晾干，用消毒剪刀剪 出枝干橫截面，選取部分顯褐色橫截面，表面消毒后，取柑桔枝干有流膠病和無(wú)流膠病交界 處； 步驟二，將莖段放入選擇性培養(yǎng)基中，在l〇°C光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4-5天，挑取白色菌絲 進(jìn)行純化、保存。2. 如權(quán)利要求1所述的柑桔流膠病的分離鑒定方法，其特征在于，所述步驟二之后對(duì)病 原菌的電子顯微鏡檢測(cè)和病原菌的PCR鑒定。3. 如權(quán)利要求1所述的柑桔流膠病的分離鑒定方法，其特征在于，所述選擇性培養(yǎng)基的 制備方法包括:燕麥片28g，瓊脂24g，水1000ml，混合煮沸，分裝三角瓶中滅菌，冷卻至45 °C， 利用氨芐青霉素抑制細(xì)菌雜菌生長(zhǎng)，加250mg，利用利福平防雜菌污染，加10mg，利用多菌靈 防止霉菌污染，加 l〇〇mg。4. 如權(quán)利要求1所述的柑桔流膠病的分離鑒定方法，其特征在于，所述病原菌的PCR鑒 定方法包括： 通過(guò)氯仿/異戊醇法抽提菌株的基因組DNA，用ITSl/ItTS4兩個(gè)通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 得到rDNA片段，產(chǎn)物經(jīng)回收并測(cè)序，將所得到的序列登錄到網(wǎng)站進(jìn)行BLAST比對(duì)，該菌株 rDNA為寄生疫霉;另外一株菌為厚垣鐮刀菌，可參與侵染。
【文檔編號(hào)】C12Q1/04GK106010986SQ201610589196
【公開(kāi)日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年7月25日
【發(fā)明人】姚廷山, 胡軍華, 肖田
【申請(qǐng)人】西南大學(xué)