一種柑桔黃龍病防控藥劑的快速篩選方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)領(lǐng)域中化學(xué)防治藥劑的篩選技術(shù)，具體公開(kāi)了一種柑桔黃龍病防控藥劑的快速篩選方法。所述柑桔黃龍病防控藥劑快速篩選方法的初步評(píng)價(jià)材料為帶菌柑桔木虱，并采用RT-qPCR實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)所述黃龍病病菌在帶菌柑桔木虱體內(nèi)的消長(zhǎng)程度來(lái)評(píng)價(jià)藥效。本發(fā)明創(chuàng)造性地利用帶菌柑桔木虱作為抗黃龍病病菌化學(xué)藥劑的篩選材料，可以在短時(shí)間內(nèi)對(duì)大量潛在的柑桔黃龍病防控藥劑進(jìn)行快速篩選與評(píng)價(jià)，解決了目前抗黃龍病病菌化學(xué)藥劑篩選周期過(guò)長(zhǎng)，缺乏一套準(zhǔn)確、有效的評(píng)價(jià)體系等不足。
【專利說(shuō)明】一種柑桔黃龍病防控藥劑的快速篩選方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)領(lǐng)域中化學(xué)防治藥劑的篩選技術(shù)，更具體的，涉及一種柑桔黃龍病防控藥劑的快速篩選方法。

【背景技術(shù)】
[0002]柑桔黃龍病在我國(guó)發(fā)生歷史悠久，危害日益嚴(yán)重。有資料記載的是Reinking于1919年在我國(guó)廣東潮汕地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)柑桔黃龍病。到20世紀(jì)80年代中期，柑桔黃龍病已在我國(guó)廣東、廣西、福建、海南和臺(tái)灣的柑桔產(chǎn)區(qū)廣泛蔓延，并在浙江、貴州、湖南等地部分柑桔產(chǎn)區(qū)相繼發(fā)生。我國(guó)有柑桔栽培的19個(gè)省、區(qū)已有11個(gè)遭受危害，受害面積占柑桔總栽培面積的80%以上，總產(chǎn)量的85%左右(范國(guó)成等，2009)。然而，鑒于黃龍病病菌((CandidatusLiberibacter asiaticus’ ,簡(jiǎn)稱Las)難培養(yǎng)的特性,與其相關(guān)的化學(xué)藥劑篩選工作至今依然進(jìn)展緩慢。
[0003]針對(duì)柑桔黃龍病化學(xué)防治而開(kāi)展的抗黃龍病病菌化學(xué)藥劑篩選實(shí)驗(yàn)。目前,在國(guó)內(nèi)外也均有所進(jìn)展。但是，早期的篩選方法一般以針對(duì)發(fā)病植物本身的癥狀變化為主，往往缺乏一套準(zhǔn)確、有效的評(píng)價(jià)體系，且還存在篩選周期較長(zhǎng)(一般需要1-3年甚至更長(zhǎng)時(shí)間的連續(xù)監(jiān)測(cè))，易受外界環(huán)境影響等不足。如:樹干注射法、韌皮部敷藥法、葉面噴霧法和土壤澆灌法等。直到近年來(lái)，鑒于柑桔黃龍病的危害形勢(shì)日愈嚴(yán)峻，而現(xiàn)階段黃龍病病菌一直未能成功進(jìn)行分離培養(yǎng)，才使得更多的學(xué)者致力于使用柑桔黃龍病的其他病害源作為其防治藥劑的篩選評(píng)價(jià)體系。如Muqing Zhang( 2010，2011)等利用已感染黃龍病的長(zhǎng)春花枝條在藥劑處理后的成活率來(lái)評(píng)價(jià)藥效，構(gòu)建了基于長(zhǎng)春花的黃龍病化學(xué)防治藥劑初篩體系。該初篩體系雖已大大縮短了篩選時(shí)間，但仍需至少60-90 d才能獲得初步的篩選結(jié)果?？偠灾?，目前抗黃龍病病菌化學(xué)藥劑篩選周期過(guò)長(zhǎng)，并且缺乏一套準(zhǔn)確、有效的評(píng)價(jià)體系。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種柑桔黃龍病防控藥劑的快速篩選方法。本發(fā)明創(chuàng)造性地利用帶菌柑桔木虱作為抗黃龍病病菌化學(xué)藥劑的篩選材料，可以在短時(shí)間內(nèi)對(duì)柑桔黃龍病防控藥劑進(jìn)行快速篩選與評(píng)價(jià)，解決了目前抗黃龍病病菌化學(xué)藥劑篩選周期過(guò)長(zhǎng)，缺乏一套準(zhǔn)確、有效的評(píng)價(jià)體系等不足。
[0005]本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)。
[0006]—種柑桔黃龍病防控藥劑的快速篩選方法，所述柑桔黃龍病防控藥劑的初步評(píng)價(jià)材料為帶菌柑桔木虱，并采用RT-qPCR實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)所述黃龍病病菌在帶菌柑桔木虱體內(nèi)的消長(zhǎng)程度來(lái)評(píng)價(jià)藥效。
[0007]現(xiàn)有技術(shù)中構(gòu)建了基于長(zhǎng)春花的黃龍病化學(xué)防治藥劑初篩體系，利用PCR檢測(cè)技術(shù)，以化學(xué)藥劑處理后2飛個(gè)月長(zhǎng)春花的成活再生生物量及新生長(zhǎng)枝條的韌皮部桿菌的含量為指標(biāo)，篩選出抗韌皮部桿菌的藥物，篩選時(shí)間長(zhǎng)，可能存在篩選不準(zhǔn)確的情況。而本發(fā)明創(chuàng)造性地利用帶菌柑桔木虱作為抗黃龍病病菌化學(xué)藥劑的篩選材料，并采用RT-qPCR實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)所述黃龍病病菌在帶菌柑桔木虱體內(nèi)的消長(zhǎng)程度，僅需5天即可篩選出有效抗柑桔黃龍病病菌的化學(xué)藥劑，篩選時(shí)間短、準(zhǔn)確性高，提供了一種更為快速、有效的抗黃龍病病菌化學(xué)藥劑篩選方法，解決了目前抗黃龍病病菌化學(xué)藥劑篩選周期過(guò)長(zhǎng)，缺乏一套準(zhǔn)確、有效的評(píng)價(jià)體系等不足。
[0008]優(yōu)選的，所述方法包括如下步驟:
51.飼喂處理:帶菌柑桔木虱成蟲取食適量化學(xué)藥劑溶液后，再用健康的柑桔葉片飼養(yǎng);
52.藥效評(píng)價(jià):提取飼喂處理后的帶菌柑桔木虱總DNA，再通過(guò)RT-qPCR技術(shù)實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)黃龍病病菌在木虱體內(nèi)的消長(zhǎng)程度來(lái)初步評(píng)價(jià)藥效。
[0009]優(yōu)選的，所述化學(xué)藥劑溶液的濃度為1000 mg/L。
[0010]優(yōu)選的，所述化學(xué)藥劑的處理時(shí)間為24h。
[0011]優(yōu)選的，所述木虱成蟲經(jīng)過(guò)饑餓處理12h后再用于SI步驟。
[0012]優(yōu)選的，所述所述S2步驟中RT-qPCR實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)的檢測(cè)引物為HLBasf/HLBasr，其核苷酸序列分別如SEQ ID NO:1?2所示；探針為HLBp，其核苷酸序列如SEQ IDNO:3所示；
所述檢測(cè)反應(yīng)體系為2XTaqMan PCR Master Mix 10 μ L, 10 μπιοΙ/L的上下游引物和探針各0.4 μ L，DNA模板I μ L，再加滅菌ddH20至總體積20 μ L，反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性30 s后；95°C退火5 s，60°C延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)；在每個(gè)循環(huán)的退火和延伸階段同步實(shí)時(shí)采集熒光，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，換算出待測(cè)樣品中黃龍病病原的含量。
[0013]本發(fā)明通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)5d處理后，篩選出四環(huán)素類抗生素中的鹽酸四環(huán)素和鹽酸土霉素，氨基糖苷類抗生素中的硫酸慶大霉素和硫酸阿米卡星為有效抗柑桔黃龍病病菌的化學(xué)藥劑。
[0014]本發(fā)明還提供一種抗病菌化學(xué)藥劑的快速篩選方法的應(yīng)用，所述方法的評(píng)價(jià)材料為其病菌的病害源昆蟲，并采用RT-qPCR實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)所述病菌在帶菌昆蟲體內(nèi)的消長(zhǎng)程度來(lái)評(píng)價(jià)藥效，將所述方法應(yīng)用于刺吸式口器害蟲傳播的難培養(yǎng)病菌化學(xué)防治藥劑的篩選。
[0015]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于:
(I)本發(fā)明創(chuàng)造性地利用帶菌柑桔木虱作為抗黃龍病病菌化學(xué)藥劑的篩選材料，可以在短時(shí)間內(nèi)對(duì)柑桔黃龍病防控藥劑進(jìn)行快速篩選與評(píng)價(jià)，解決了目前抗黃龍病病菌化學(xué)藥劑篩選周期過(guò)長(zhǎng)，缺乏一套準(zhǔn)確、有效的評(píng)價(jià)體系等不足。
[0016](2)本發(fā)明采用帶菌柑桔木虱作為抗黃龍病病菌化學(xué)藥劑的初步評(píng)價(jià)材料，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(RT-qPCR)實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)黃龍病病菌在其體內(nèi)的消長(zhǎng)程度來(lái)評(píng)價(jià)藥效，僅需5天即可篩選出有效抗柑桔黃龍病病菌的化學(xué)藥劑，提供了一種更為快速、有效的抗黃龍病病菌化學(xué)藥劑篩選方法，篩選得到的高效柑桔黃龍病防控藥劑，既可作為生產(chǎn)上的柑桔黃龍病化學(xué)防治藥劑加以直接利用，還可為防治柑桔黃龍病新型藥劑的研究與開(kāi)發(fā)，及柑桔黃龍病病菌與寄主互作機(jī)理等研究工作提供理論參考。
[0017]

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
圖1為不同時(shí)間處理對(duì)柑桔木虱體內(nèi)黃龍病病菌濃度的影響。
[0018]圖2為四環(huán)素類抗生素對(duì)柑桔木虱體內(nèi)黃龍病病菌的抑菌活性測(cè)定結(jié)果。
[0019]圖3為氨基糖苷類抗生素對(duì)柑桔木虱體內(nèi)黃龍病病菌的抑菌活性測(cè)定結(jié)果。
[0020]圖4為β -內(nèi)酰胺類抗生素對(duì)柑桔木虱體內(nèi)黃龍病病菌的抑菌活性測(cè)定結(jié)果。
[0021]圖5為喹諾酮類抗菌藥及其他抗菌藥對(duì)柑桔木虱體內(nèi)黃龍病病菌的抑菌活性測(cè)定結(jié)果。
[0022]圖6為鹽酸四環(huán)素和鹽酸土霉素對(duì)柑桔木虱體內(nèi)黃龍病病菌的脫除效果。
[0023]圖注(圖1-3):CK表示空白對(duì)照組；*表示經(jīng)t檢驗(yàn)存在顯著差異Gd < 0.05) ;**表示經(jīng)t檢驗(yàn)存在極其顯著差異Gd < 0.01)o
[0024]

【具體實(shí)施方式】
下面結(jié)合說(shuō)明書附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何形式的限定。除非特別說(shuō)明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本【技術(shù)領(lǐng)域】常規(guī)試齊U、方法和設(shè)備。
[0025]本發(fā)明【具體實(shí)施方式】主要應(yīng)用于抗黃龍病病菌化學(xué)藥劑的快速篩選，并且適當(dāng)?shù)母淖児┰嚴(yán)ハx、化學(xué)藥劑種類以及飼喂裝置，本發(fā)明所述方法還可以應(yīng)用于其他刺吸式口器害蟲傳播的難培養(yǎng)病菌化學(xué)防治藥劑的篩選。
[0026]實(shí)施例1抗黃龍病病菌化學(xué)藥劑的快速篩選過(guò)程
取15頭饑餓12 h后的帶菌柑桔木虱，用3 mL 1000 mg/L的供試化學(xué)藥劑溶液飼喂24h，再用健康柑桔葉片飼養(yǎng)。飼養(yǎng)條件:溫度為26-28°C，相對(duì)濕度為60%-75%，光周期L:D=14: 10 h。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，每隔24 h檢查一次健康柑桔葉片的保濕情況，并同時(shí)加入適量的相應(yīng)化學(xué)藥劑溶液進(jìn)行保濕處理，以防止健康柑桔葉片過(guò)度脫水而導(dǎo)致帶菌柑桔木虱無(wú)法正常取食。以不添加任何化學(xué)藥劑的雙蒸水為空白對(duì)照，每次處理均設(shè)置3個(gè)重復(fù)?；瘜W(xué)藥劑飼喂處理完成后，采用OMEGA?公司購(gòu)買的E.Z.N.A.? Insect DNA Kit試劑盒(D0926-01)提取帶菌柑桔木虱總DNA，再利用RT-qPCR技術(shù)實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)黃龍病病菌在其體內(nèi)的消長(zhǎng)程度來(lái)初步評(píng)價(jià)藥效。
[0027]Las 的 RT-qPCR 檢測(cè)參照 Li 等(2006)報(bào)道的引物 HLBasf/HLBasr (5 ^-TCG AGCGCGTATGCAATACG-3’/5 ‘-GCGTTATCCCGTAGAAAAAGGTAG-3’)，其核苷酸序列分別如 SEQ IDNO:1,SEQ ID NO:2 所示；探針 HLBp (5 ‘-FAM-AGACGGGTGAGTAACGCG-BHQ-3’)，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示探針及引物均由大連寶生物工程有限公司合成。RT-qPCR反應(yīng)體系%:2 X TaqMan PCR Master Mix 10 μ L, 10 μ mol/L 的上下游引物和探針各 0.4 μ L，DNA模板I μ L，再加滅菌ddH20至總體積20 μ L。每輪反應(yīng)均設(shè)置7個(gè)梯度的標(biāo)準(zhǔn)品(Α4質(zhì)粒)作為外參繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，ddH20為空白對(duì)照，健康柑桔DNA樣品為陰性對(duì)照，且實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上。反應(yīng)在CFX96 Touch ?熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)上進(jìn)行，反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性30 s后，40個(gè)循環(huán)(95°C退火5 s;60°C，延伸30 S)，在每個(gè)循環(huán)的退火和延伸階段同步實(shí)時(shí)采集熒光。程序設(shè)置及結(jié)果讀取均使用B1-Rad CFX Manger 2.1軟件。根據(jù)A4質(zhì)粒外參的標(biāo)準(zhǔn)曲線，換算出待測(cè)樣品中黃龍病病原的含量。
[0028]實(shí)施例2不同時(shí)間處理對(duì)柑桔木虱體內(nèi)黃龍病病菌濃度的影響
研究鹽酸四環(huán)素的不同處理時(shí)間對(duì)帶菌柑桔木虱體內(nèi)黃龍病病菌的抑菌效果的影響。當(dāng)帶菌柑桔木虱取食含有鹽酸四環(huán)素的化學(xué)藥劑溶液24 h后，再用健康柑桔葉片分別飼養(yǎng)
1、3、5、7和9 d，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1，柑桔木虱體內(nèi)黃龍病病菌濃度的抑制率分別為:14.19%、25.54%,59.17%、68.88%和89.10% ;而空白對(duì)照組柑桔木虱體內(nèi)黃龍病病菌的濃度則分別上升了 -1.55%,25.51%,29.21%,39.89%和37.86%。且經(jīng)3 d處理后，處理組柑桔木虱體內(nèi)黃龍病病菌濃度的抑制率與空白對(duì)照組之間存在顯著性差異(P〈0.05);經(jīng)5、7和9 d處理后，處理組柑桔木虱體內(nèi)黃龍病病菌濃度的抑制率與空白對(duì)照組之間存在極顯著性差異(P〈0.01)。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)柑桔木虱體內(nèi)黃龍病病菌濃度的變化在3 d和5 d處理處最為明顯。因此，初步選定5 d為其最佳處理天數(shù)。其后，其他所有化學(xué)藥劑溶液均按5 d處理。
[0029]實(shí)施例3四環(huán)素類抗生素對(duì)帶菌柑桔木虱體內(nèi)黃龍病病菌的抑菌活性的影響研究四環(huán)素類抗生素對(duì)柑桔木虱體內(nèi)黃龍病病菌的抑菌活性的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。
當(dāng)帶菌柑桔木虱取食含有鹽酸米諾霉素的化學(xué)藥劑溶液24 h后，再用健康柑桔葉片飼養(yǎng)5 d，其體內(nèi)黃龍病病菌濃度的抑制率為5.58%，與處理前無(wú)顯著性差異；當(dāng)帶菌柑桔木虱取食分別含有鹽酸四環(huán)素或鹽酸土霉素的化學(xué)藥劑溶液后，其體內(nèi)黃龍病病菌濃度的抑制率分別為59.17%和49.70%，且與處理前存在極顯著性差異(P〈0.01)。但是，當(dāng)帶菌柑桔木虱取食含有鹽酸多西環(huán)素的化學(xué)藥劑溶液后，其體內(nèi)黃龍病病菌濃度卻上升了 34.90%。這表明，四環(huán)素類抗生素中的鹽酸四環(huán)素和鹽酸土霉素均能有效抑制黃龍病病菌在柑桔木虱體內(nèi)增殖，且能極顯著降低帶菌柑桔木虱體內(nèi)的黃龍病病菌濃度；鹽酸米諾霉素雖也能在一定程度上抑制黃龍病病菌在柑桔木虱體內(nèi)增殖，但其對(duì)帶菌柑桔木虱體內(nèi)黃龍病病菌濃度的降低作用并不明顯；而鹽酸多西環(huán)素不能有效抑制黃龍病病菌在柑桔木虱體內(nèi)的增殖。結(jié)果表明，鹽酸四環(huán)素和鹽酸土霉素為從本次篩選所用四環(huán)素類抗生素中篩選出的有效抗柑桔黃龍病病菌化學(xué)藥劑。
[0030]實(shí)施例4氨基糖苷類抗生素對(duì)柑桔木虱體內(nèi)黃龍病病菌的抑菌活性的影響研究氨基糖苷類抗生素對(duì)柑桔木虱體內(nèi)黃龍病病菌的抑菌活性的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖
3。當(dāng)帶菌柑桔木虱取食含有硫酸鏈霉素的化學(xué)藥劑溶液24 h后，再用健康柑桔葉片飼養(yǎng)5 d，其體內(nèi)黃龍病病菌濃度的抑制率為6.97% ;而取食含有硫酸卡那霉素的化學(xué)藥劑溶液后，其體內(nèi)黃龍病病菌的濃度則上升了 6.22%，但均與處理前無(wú)顯著性差異。當(dāng)帶菌柑桔木虱取食分別含有硫酸慶大霉素或硫酸阿米卡星的化學(xué)藥劑溶液后，其體內(nèi)黃龍病病菌濃度的抑制率分別為41.21%和42.69%，且與處理前存在極顯著性差異(P〈0.01)。這表明，氨基糖苷類抗生素中的硫酸慶大霉素和硫酸阿米卡星均能有效抑制黃龍病病菌在柑桔木虱體內(nèi)增殖，且能極顯著降低帶菌柑桔木虱體內(nèi)的黃龍病病菌濃度；而硫酸鏈霉素雖也能在一定程度上抑制黃龍病病菌在柑桔木虱體內(nèi)增殖，但其對(duì)帶菌柑桔木虱體內(nèi)黃龍病病菌濃度的降低作用并不明顯；而硫酸卡那霉素不能有效抑制黃龍病病菌在柑桔木虱體內(nèi)的增殖。結(jié)果表明，硫酸慶大霉素和硫酸阿米卡星為從本次篩選所用氨基糖苷類抗生素中篩選出的有效抗柑桔黃龍病病菌化學(xué)藥劑。
[0031]實(shí)施例5 內(nèi)酰胺類抗生素對(duì)柑桔木虱體內(nèi)黃龍病病菌的抑菌活性的影響研究β_內(nèi)酰胺類抗生素對(duì)柑桔木虱體內(nèi)黃龍病病菌的抑菌活性的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4。當(dāng)帶菌柑桔木虱取食分別含有氨芐西林或頭孢他啶的化學(xué)藥劑溶液24 h后，再用健康柑桔葉片分別飼養(yǎng)5 d，其體內(nèi)黃龍病病菌濃度的抑制率分別為7.40%和21.71%，但均與處理前無(wú)顯著性性差異；當(dāng)帶菌柑桔木虱取食含有青霉素G的化學(xué)藥劑溶液后，其體內(nèi)黃龍病病菌濃度卻上升了 39.60%。這表明，β-內(nèi)酰胺類抗生素中的氨芐西林和頭孢他啶雖能在一定程度上抑制黃龍病病菌在柑桔木虱體內(nèi)增殖，但對(duì)帶菌柑桔木虱體內(nèi)黃龍病病菌濃度的降低作用并不明顯；而青霉素G不能有效抑制黃龍病病菌在柑桔木虱體內(nèi)的增殖。結(jié)果表明，本次篩選尚未從本次篩選所用的β-內(nèi)酰胺類抗生素中，篩選出有效的抗柑桔黃龍病病菌化學(xué)藥劑。
[0032]實(shí)施例6喹諾酮類抗菌藥等對(duì)柑桔木虱體內(nèi)黃龍病病菌的抑菌活性的影響研究喹諾酮類抗菌藥等對(duì)柑桔木虱體內(nèi)黃龍病病菌的抑菌活性的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5。當(dāng)帶菌柑桔木虱取食分別含有鹽酸環(huán)丙沙星、培氟沙星、水溶性氯霉素或噻霉酮的化學(xué)藥劑溶液24 h后，再用健康柑桔葉片分別飼養(yǎng)5 d，其體內(nèi)黃龍病病菌濃度分別上升了12.37%,30.84%、13.02%和26.13%。這表明，喹諾酮類抗菌藥中的鹽酸環(huán)丙沙星、培氟沙星，氯霉素類抗生素中的水溶性氯霉素以及噻霉酮等均不能有效抑制黃龍病病菌在柑桔木虱體內(nèi)的增殖。結(jié)果表明，本次篩選尚未從本次篩選所用的喹諾酮類抗菌藥和氯霉素類抗生素中，篩選出有效抗柑桔黃龍病病菌化學(xué)藥劑。
[0033]實(shí)施例7鹽酸四環(huán)素和鹽酸土霉素對(duì)柑桔木虱體內(nèi)黃龍病病菌的脫除效果研究鹽酸四環(huán)素和鹽酸土霉素對(duì)柑桔木虱體內(nèi)黃龍病病菌的脫除效果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖
6。當(dāng)帶菌柑桔木虱取食含有鹽酸四環(huán)素的化學(xué)藥劑溶液24 h后，再用健康柑桔葉片分別飼養(yǎng)15 d (存活8頭)和20 d (存活3頭)，其體內(nèi)黃龍病病菌濃度的抑制率分別為98.36%和100.00% ;而帶菌柑桔木虱取食含有鹽酸土霉素的化學(xué)藥劑溶液24 h后，再用健康柑桔葉片分別飼養(yǎng)15 d (存活11頭)和20 d (存活5頭)，其體內(nèi)黃龍病病菌濃度的抑制率分別為95.87%和99.29%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步表明，帶菌柑桔木虱體內(nèi)的黃龍病病菌，可以通過(guò)長(zhǎng)時(shí)間取食含有鹽酸四環(huán)素或鹽酸土霉素的化學(xué)藥劑溶液而脫除。
【權(quán)利要求】
1.一種柑桔黃龍病防控藥劑的快速篩選方法,其特征在于，所述柑桔黃龍病防控藥劑快速篩選方法的初步評(píng)價(jià)材料為帶菌柑桔木虱，并采用奶-驢⑶實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)所述黃龍病病菌在帶菌柑桔木虱體內(nèi)的消長(zhǎng)程度來(lái)評(píng)價(jià)藥效。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步驟: 51.飼喂處理:帶菌柑桔木虱成蟲取食適量化學(xué)藥劑溶液后，再用健康的柑桔葉片飼養(yǎng)； 82.藥效評(píng)價(jià):提取飼喂處理后的帶菌柑桔木虱總0嫩，再通過(guò)奶-驢⑶技術(shù)實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)黃龍病病菌在木虱體內(nèi)的消長(zhǎng)程度來(lái)初步評(píng)價(jià)藥效。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述化學(xué)藥劑溶液的濃度為1000
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述化學(xué)藥劑的處理時(shí)間為2處。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述木虱成蟲經(jīng)過(guò)饑餓處理12卜后再用于81步驟。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述52步驟中奶-驢⑶實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)的檢測(cè)引物為'，其核苷酸序列分別如3即10勵(lì):廣2所示；探針為18？，其核苷酸序列如卿10勵(lì):3所示； 所述檢測(cè)反應(yīng)體系為2X1叫1冊(cè)？邙10 111,10 9 11101/1的上下游引物和探針各0.4 9匕0嫩模板1仏，再加滅菌況職至總體積20 9匕反應(yīng)條件為951預(yù)變性30 8后；951退火5 8，601延伸30 8，共40個(gè)循環(huán)；在每個(gè)循環(huán)的退火和延伸階段同步實(shí)時(shí)采集熒光，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，換算出待測(cè)樣品中黃龍病病原的含量。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104404158SQ201410744410
【公開(kāi)日】2015年3月11日 申請(qǐng)日期:2014年12月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月9日
【發(fā)明者】王華堂, 曾鑫年, 陳冬梅, 高傳賀, 孔凡超 申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)