專利名稱：生物素的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物素的生產(chǎn)方法以及該方法中所使用的微生物。
生物素是一種維生素，是人類、動物、蔬菜和某些種類的微生物所需要的。作為使用微生物生產(chǎn)生物素的方法，存在著使用微生物的多種已知方法，例如使用鏈霉菌屬或小單孢菌屬(JP-B 41-21756)、擲孢酵母菌屬(JP-B 42-3074)、芽孢桿菌屬(JP-A.56-160998)、埃希氏桿菌屬(JP-A 61-149091)、沙雷氏菌屬(JP-A 2-27980)和短桿菌屬(JP-A 3-240489)的方法。
不過，由于這些微生物產(chǎn)生生物素的產(chǎn)量低，這些常規(guī)方法并不總是令人滿意的。因此，需要開發(fā)一種使用高效率微生物生產(chǎn)生物素的方法，以適應(yīng)于工業(yè)規(guī)模的生物素生產(chǎn)。
在這些情形之下，本發(fā)明的發(fā)明人在自然界和保存在有利于微生物貯藏的典型培養(yǎng)物保藏所中廣泛尋找了具有增加的生物素生產(chǎn)能力的微生物。結(jié)果，他們發(fā)現(xiàn)斯芬克斯小桿菌屬的微生物可以在培養(yǎng)基中積累大量的生物素，，從而完成了本發(fā)明。
這樣，本發(fā)明提供了一種生物素的生產(chǎn)方法，其特征在于在適當?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)一種能產(chǎn)生生物素的斯芬克斯小桿菌屬的微生物和收集培養(yǎng)基中積累的生物素。本發(fā)明還提供了該方法中所使用的多種微生物。
本發(fā)明方法中所使用的微生物是斯芬克斯小桿菌屬的微生物，該屬具有產(chǎn)生生物素的能力，其例子有S.adhaeshiva、S.parapaucimobilis和S.paucimonilis。在這些微生物中，斯芬克斯小桿菌SC-42405是優(yōu)選的。通常，斯芬克斯小桿菌屬的微生物具有以下特點1.它們是革蘭氏陰性桿菌;
2.它們在觸酶試驗中呈陽性;
3.主要形成黃色菌落;
4.它們含有作為磷脂的斯芬克斯脂類;
5.類異戊二烯醌類型是Q10;
6.它們含有作為細菌脂肪酸的2-羥基酸類;
7.其DNA中G+C的摩爾百分比為60～70不等。
斯芬克斯小桿菌SC-42405是一種由發(fā)明人從日本大分縣的土壤中分離的細菌中分離出來的微生物，發(fā)現(xiàn)它能夠在培養(yǎng)基中積累大量的生物素。這種微生物已按照布達佩斯條約貯存在工業(yè)科學(xué)及技術(shù)機構(gòu)中的發(fā)酵研究所(更名為“國家生物科學(xué)和人類技術(shù)研究所”)中，保藏日為1992年9月3日，登記號碼為FERM BP-3995。
斯芬克斯小桿菌SC-42405的細菌學(xué)特征如下(a)形態(tài)學(xué)1.細胞形狀與大小形狀桿狀大小0.4-0.8μm×1.5～3.0μm2.多形性無3.游動性活潑、極性及圍毛性鞭毛4.孢子形成無5.革蘭氏染色陰性6.抗酸性無(b)生長性質(zhì)1.營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)圓，凸，黃色2.營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)平滑表面，略帶光澤，黃色3.營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)混濁生長4.營養(yǎng)肉湯明膠穿刺培養(yǎng)不液化5.石蕊牛乳無變化(c)生理學(xué)特性1.硝酸鹽還原作用(營養(yǎng)肉湯硝酸鹽培養(yǎng)基)-2.反硝化作用-3.MR試驗-4.VP試驗-
5.吲哚形成-6.硫化氫形成+7.淀粉水解作用-8.檸檬酸利用科澤氏培養(yǎng)基+克里斯坦森培養(yǎng)基+9.無機氮源利用銨鹽+硝酸鹽+10.色素形成細胞色素+(黃色)水溶性色素(金氏A型培養(yǎng)基)-水溶性色素(金氏B型培養(yǎng)基)-11.脲酶±12.氧化酶+13.觸酶+14.生長條件PH值5.1～7.9溫度10～33℃15.對氧氣的反應(yīng)略偏重需氧性16.氧化-發(fā)酵試驗發(fā)酵(弱)
17.來自糖的酸及氣體形成酸 氣體(1)L-阿拉伯糖: + -(2)D-木糖: + -(3)D-葡萄糖: ± -(4)D-甘露糖: ± -(5)D-果糖: + -(6)D-半乳糖: + -(7)麥芽糖: ± -(8)蔗糖: ± -(9)乳糖: ± -(10)海藻糖: - -(11)D-山梨糖醇: - -(12)D-甘露糖醇: - -(13)肌醇: - -(14)甘油: - -(15)淀粉: ± -(d)其它特性1.七葉苷水解作用+2.精氨酸水解作用-3.賴氨酸脫羧作用-
4，鳥氨酸脫羧作用-5.DNA酶-6.吐溫80水解作用-7.0/129敏感性-8.固氮酶-9.聚-β-羥基丁酸鹽的積累+10.DNA中G+C的摩爾百分比64.811.類異戊二烯醌的分子類型輔酶Q1012.斯芬克斯磷酯+13.全部細菌脂肪酸的組成C16∶0(13.1%)，C16∶1(11.2%)，C17∶1(1.1%)，C18∶1(51.8%)，2-OH-14∶0(14.1%)，2-OH-16∶0(4.5%)(d)項，10～13中所述的特性可由常規(guī)的化學(xué)分類程序加以確定，例如在“放線菌鑒定實驗”中所描述的，該書由日本放線菌研究學(xué)會編輯，1985年由日本放線菌學(xué)會秘書處出版。這種程序的典型實例如下所述。
1.DNA的G+C的摩爾百分比培養(yǎng)(100ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基在坂口瓶中在30℃下培養(yǎng)36小時)/……通過離心法來收集細菌細胞。
通過離心法用鹽水-乙二胺四乙酸(0.15M NaCl，0.1M乙二胺四乙酸，pH值8.0)沖洗兩次。
/……在18ml的鹽水-乙二胺四乙酸中懸浮細菌細胞。
細菌細胞的溶解〔溶菌酶處理(0.5mg/ml，37℃，處理1小時)，隨后加入十二烷基硫酸鈉(達到最終濃度為12%)，然后在60℃下加熱15分鐘〕。
/……混合物變成透明的，并因DNA增加了粘度。
/……冰冷卻。
加入EtOH達到最終濃度為67%。
/……棄去上清液。
溶解于20ml的SSC(0.15M NaCl，0.015M檸檬酸鈉，pH值7.0)中。
/在SCC(SSC飽和液)中加入等量苯酚，并震蕩塞封的瓶子。
/……離心(分離成三層，即水層、天然蛋白質(zhì)層和有機溶劑層)。
用吸管吸出水層。
/……加入SSC，再次震蕩、離心分離并除去水層。
/……冰冷卻。
/……在4℃下以12，000轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心10分鐘，將上清液傾倒在大燒杯中以保持1cm的厚度。
DNA繞數(shù)/……將95%的冷EtOH以兩倍體積加入水中，用玻璃棒攪拌燒杯中的內(nèi)容物。當濃度達到約30%EtOH時，DNA開始在玻璃棒上旋繞。使旋繞在玻璃棒上的DNA在含80%EtOH的試管中靜置片刻(除去苯酚)，隨后用95%的EtOH進行同樣處理。在空氣中蒸發(fā)EtOH并將DNA加入0.1X SSC中。在冰箱中放置過夜后，得到基本均勻的溶液。
/……適度離心以去除混濁。
RNA酶處理(加入RNA酶A＊至50μg/ml，在37℃下處理1小時)。
/…＊在80℃下處理1-2mg/ml SCC10分鐘(DNA酶失活)。
/……加入1/10量的10X SSC并冷卻。
當加入EtOH時DNA在玻璃棒上旋繞(如果是純DNA，它變成透明的)。
/……將DNA加入0.1X SSC中并在冰箱中靜置過夜(如果第二天仍然混濁，則重復(fù)離心、RNA酶處理和旋繞)。
/……使A260達到10～20。
將100μl純DNA/0.1X SSC溶液加入微離心管中。
/……在100℃下保持5分鐘，隨后進行冰冷卻。
/←100μl 0.1mg/ml核酸酶P1(Yamasa Shoyu有限公司)，40mM NaAc和2mMZnSO4(pH5.3)。
50℃下反應(yīng)1小時。
1←100μl堿性磷酸酶(BAP，Takara Shuzo有限公司)/(在0.1M Tris-HCl中2.4U/ml，pH8.1)在37℃下反應(yīng)1小時。
/HPLC分析柱Gμ C18+μBondasphere C18(3.9mmφ×150mm)，流動相0.2M NH4H2PO4/MeOH(100∶8)，流速0.9ml/分，檢測紫外260nm，樣品注入5μL(4-7μL)2.類異戊二烯醌的分子類型100mg凍干的細菌細胞(在營養(yǎng)肉湯中制成液體培養(yǎng)物)/……在攪拌條件下用20mL的CHCl3-MeOH(2∶1)萃取過液。
硅膠薄層色譜分析/……用苯展開色譜并確定哪些是泛醌或甲基萘醌類(當用苯展開色譜時，如Rf＝0.3，是泛醌，如Rf＝0.7，是甲基萘醌類)。
刮下硅膠薄層色譜中的產(chǎn)物并純化/用苯來展開泛醌，而用正己烷-苯-CHCl3(5∶2∶1)來展開甲基萘醌類。
用丙酮從硅膠上洗脫去除
/……配制100μl丙酮溶液。
反相HPLC分析柱YMC-Pack AM-303(4.6mmφ×250mm)，洗脫2-PrOH-MeOH(25∶75)，流速1.0mL/分，檢測270nm。
3.斯芬克斯磷脂的存在0.5g濕細菌細胞/……用5mL CHCl3-MeOH(2∶1)萃取磷脂。
將CHCl3層分離成兩部分并加入88μl的6N KOH。
/……40℃下水解1小時。
/……用乙酸中和。
/……干燥。
薄層色譜分析(色譜展開之后，顯色是由鉬試劑引起的)4.全部細菌脂肪酸的組成(1)全部細菌脂肪酸的分析程序25mg凍干的細菌細胞(于30℃下，在營養(yǎng)肉湯中制成液體培養(yǎng)物)//←2mL 5%的無水HCl-MeOH(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)
/……在沸水中保持3小時。
放置使樣品冷卻/←1mL水/←3mL正己烷萃取脂肪酸甲基酯(震蕩10分鐘)/……用移液管移出正己烷層/……加入3mL水并震蕩(酸去除)/……去除正乙烷層并用無水Na2SO4脫水。
/……干燥。
溶解于200μL CH3CN中。
/氣相色譜分析柱10%DEGS鉻目砂W80/100(AW-DMCS)，3mmφ×5.2m，載體40mL/分N2，注入溫度220℃，柱溫180℃，檢測FID。
(2)鑒定不飽和脂肪酸甲酯的程序全部細菌脂肪酸甲酯樣品20μl/……干燥。
溶解于200μl乙醚中。
1←在乙醚中加入5μl 2%的Br2。
/……封蓋并在室溫下靜置30分鐘。
通入氮氣而蒸發(fā)溶劑和殘留的Br2。
/……溶解于60μl的CH3CN中。
氣相色譜分析〔同(1)項中所述的方法〕(3)鑒定羥基脂肪酸甲酯的程序全部細菌脂肪酸甲酯樣品20μl/……應(yīng)用于硅膠薄層色譜。
色譜展開(正己烷-乙醚，85∶15)/……噴霧0.02%(W/V)的2′，7′-二氯熒光素-乙醇溶液。
刮下顯色的斑點。
/如Rf＝0.2，斑點是3-羥基脂肪酸甲酯。
/如Rf＝0.3，斑點是2-羥基脂肪酸甲酯。
/如Rf＝0.8，斑點是非極性脂肪酸甲酯。
用乙醚萃取，隨后干燥并溶于20μl的CH3CN中。
/氣相色譜〔同(1)項所述方法〕
(4)鑒定環(huán)化脂肪酸甲酯的程序全部細菌脂肪酸甲酯樣品20μl/……干燥。
100℃下在2mL 5%的無水HCl-MeOH中加熱1小時。
/如(1)項所述方法萃取脂肪酸甲酯并溶于20μl CH3CN中。
/氣相色譜分析〔同(1)項中所述方法〕將上述特點與下列資料中公開的數(shù)據(jù)進行比較“Bergey's Manual of Systematic Bacteriology”(1984)，Yabuuchi et al.，Microbiol.Immunol.，34，99-119(1990)，Validation list No.34，Int.J.Syst，Bacteriol.，40，320-321(1990)，本發(fā)明的發(fā)明人所發(fā)現(xiàn)的細菌菌株被鑒定為斯芬克斯小桿菌屬的微生物并定名為斯芬克斯小桿菌SC-42405。應(yīng)該注意是，尚不知道任何具有產(chǎn)生生物素能力的斯芬克斯小桿菌屬的微生物。在這方面，斯芬克斯小桿菌SC-42405被認為是一種新菌株。此外，這個菌株的任何變種(即斯芬克斯小桿菌SC-42405的任何突變體)、任何細胞融合菌株或任何重組菌株也可用于本發(fā)明的方法。
本發(fā)明方法中所用的微生物培養(yǎng)物可以在多種類型的培養(yǎng)基中制備，這些培養(yǎng)基含有碳源和氮源、有機和/或無機鹽等等，所有這些都廣泛應(yīng)用于制備普通細菌培養(yǎng)物中。
碳源的例子為葡萄糖、麥芽糖、甘油、淀粉、糊精、蔗糖、動植物油和糖蜜。
氮源的例子為天然有機氮源，例如肉湯、胨、酵母膏、麥芽汁、大豆粉、玉米漿、棉籽粉、干酵母和酪蛋白氨基酸;其它有機或無機氮源例如氨、氯化銨、硝酸鈉、硝酸銨、硫酸銨、乙酸銨和尿素。天然有機氮源也可以用作碳源。
有機和無機鹽的例子為氯化物、硫酸鹽、乙酸鹽、碳酸鹽和磷酸鹽，如鉀、鈉、鎂、鐵、錳、鈷和鋅等元素的上述鹽。具體的例子是氯化鉀、氯化鈉、硫酸鎂、硫酸亞鐵、硫酸錳、氯化鈷、硫酸鋅、硫酸銅、乙酸鈉、碳酸鈣、碳酸鈉、磷酸一氫鉀、磷酸二氫鉀、磷酸一氫鈉和磷酸二氫鈉。
本發(fā)明方法中所使用的微生物具有在多種培養(yǎng)基中產(chǎn)生生物素的優(yōu)良能力，這對于工業(yè)規(guī)模的生產(chǎn)是很有利的。為了增強本發(fā)明方法中所使用的微生物產(chǎn)生生物素的能力，可以在培養(yǎng)基中加入氨基酸(如丙氨酸)或脂肪酸(如庚二酸)。例如，這些化合物的用量可以是每1000mL培養(yǎng)基中約1mg到約5mg。
按照普通細菌所使用的常規(guī)程序制備本發(fā)明方法中所用的微生物培養(yǎng)物，可以是固體培養(yǎng)，也可以是液體培養(yǎng)，如使用試管、往復(fù)式搖動器或旋轉(zhuǎn)式搖動器的震蕩培養(yǎng)，和使用罐式發(fā)酵器或發(fā)酵罐的其它培養(yǎng)。
微生物的培養(yǎng)物通常是在需氧條件下培養(yǎng)。特別是，當使用發(fā)酵罐時，有必要引入無菌空氣，通常是以每分鐘約0.1至約2倍于培養(yǎng)物體積的速度通氣。
培養(yǎng)溫度可在一定范圍內(nèi)變化，其中所用微生物在培養(yǎng)物中是活的。例如，可以在約20℃～40℃，優(yōu)選約25°～35℃，更好是28°～33℃下培養(yǎng)。培養(yǎng)基的pH值最好控制在約6～8之間。
培養(yǎng)時間依多種條件而不同，一般為約1-7天，優(yōu)選為約3-4天。
培養(yǎng)完成后，可按照從天然來源中提取和純化所需化合物的常規(guī)程序，利用生物素的性質(zhì)從培養(yǎng)物中收集生物素。例如，利用離心等技術(shù)從培養(yǎng)物中除去細菌細胞，培養(yǎng)物中積累的生物素被吸附于活性炭或多孔非離子交換樹脂上，隨后，利用生物素與雜質(zhì)間溶解度的不同，用離子交換樹脂或經(jīng)重結(jié)晶進行純化。
本發(fā)明可通過下述實施例來進一步加以闡述，但這些實施例并不限制本發(fā)明的范圍。
實施例1通過震蕩培養(yǎng)生產(chǎn)生物素將一菌環(huán)斯芬克斯小桿菌SC-42405(FERM BP-3995)接種到一個大試管(22mmφ×220mm)中，試管中含有10mL預(yù)培養(yǎng)基(1%的甘油、2%的多胨、0.15%的K2HPO4、0.15%的MgSO4·7H2O，pH值7.2)，在30℃下以200轉(zhuǎn)/分的速度震蕩培養(yǎng)3天。然后，將2mL這種預(yù)培養(yǎng)物接種到500mL的坂口燒瓶中，燒瓶中含50mL的培養(yǎng)基(2%的甘油、2%的酵母膏、0.5%的無維生素酪蛋白氨基酸、0.15%的K2HPO4、0.05%KCl、0.05%的MgSO4·7H2O、0.001%的FeSO4·7H2O、0.001%的MnSO4·4-6H2O，2μg/L的鹽酸硫胺素，pH值為7.0)，在30℃下以每分鐘130轉(zhuǎn)的速度震蕩培養(yǎng)4天。培養(yǎng)后的細菌濃度(OD650)為22.0，此時培養(yǎng)基中所產(chǎn)生和積累的生物素濃度由使用植物乳桿菌IFO3070的定量微生物檢測而確定(Izumi and Yamada，Methods of Vitaminological Experiments，Ⅱ，Water-Soluble Vitamine，pp.481-499，1985年由日本維生素學(xué)學(xué)會主編，東京Kagaku Dohjin)，結(jié)果為3.3mg/L。
實施例2通過需氧攪拌培養(yǎng)生產(chǎn)生物素在一個大試管中預(yù)先培養(yǎng)斯芬克斯小桿菌SC-42405的培養(yǎng)物，方法同實施例1中所述。預(yù)培養(yǎng)物以2mL為單位逐份接種到3個500mL的坂口燒瓶中，每個燒瓶中含有100mL相同的預(yù)培養(yǎng)基，在30℃下以130轉(zhuǎn)/分的速度震蕩培養(yǎng)3天。然后，將300ml這種培養(yǎng)物接種到30L的發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐中含有15L的培養(yǎng)基(2%的甘油、2%的酵母膏、0.5%的無維生素酪蛋白氨基酸、0.15%的K2HPO4、0.05%的KCl、0.05%的MgSO4·7H2O、0.001%的FeSO4·7H2O、0.001%的MnSO4·4-6H2O，20μg/L的鹽酸硫胺素，pH值為7.0)，在通氣、攪拌及30℃下培養(yǎng)4天。通氣速度為15L/分，攪拌速度為200～500轉(zhuǎn)/分(將其控制到培養(yǎng)基中所溶解的氧的濃度為2ppm或更高一些)。通過加入消泡劑Einol(Biotto公司)達到自動消泡。培養(yǎng)完畢后細菌濃度(OD650)為38.0，此時培養(yǎng)基中所產(chǎn)生和積累的生物素濃度可由與實施例1中所述相同的定量微生物檢測來確定，結(jié)果為2.3mg/L。
實施例3產(chǎn)物的分離和鑒定對實施例2中得到的15升培養(yǎng)物進行連續(xù)離心，再加入HCl使pH值調(diào)到3后，使上清液通過裝有500g活性炭(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)的柱。用15L水沖洗該柱，然后用5L 0.1N的氨水進行洗脫。濃縮洗脫物，然后使其通過裝有100ml Dowex離子交換樹脂1×8(The Dow Chemical Co.)的柱，接著用2L水沖洗并用2L 1N的乙酸洗脫。將洗脫物濃縮，使其通過裝有100ml Dowex 50W-8(The Dow Chemical Co.)的柱，然后用2L水洗脫。將洗脫液濃縮，使其通過裝有50g活性炭(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)的柱。用500mL水沖洗柱，再用500mL的0.1N氨水洗脫。使洗脫液蒸發(fā)至干，并將殘留物溶解于5ml 0.1N的氫氧化鈉水溶液中，然后通過使用裝有50ml Sephadex G-10(Pharmacia AB)的柱凝膠過濾色譜進行純化。合并含有洗脫的生物素的級分，通過加入0.05N的HCl將pH值調(diào)到3，然后使合并的級分在冷處放置過夜。收集沉淀的晶體，并在減壓下進行干燥，得到13mg的生物素晶體。這樣得到的生物素表現(xiàn)出的生理化學(xué)特性(如質(zhì)譜、紅外吸收光譜等)與生物素的標準制劑相同。
實施例4多種微生物之間生物素生產(chǎn)的比較將一菌環(huán)多種與斯芬克斯小桿菌屬相似的微生物的每一種接種到一個大試管(22mmφ×22mm)中，試管中含有5ml預(yù)培養(yǎng)基(1%的甘油、2%的多胨、0.15%的K2HPO4、0.15%的MgSO4·7H2O，pH值為7.2)，然后在30℃下以250轉(zhuǎn)/分的速度震蕩培養(yǎng)3天。培養(yǎng)完畢后，培養(yǎng)基中所產(chǎn)生和積累的生物素濃度可用與實施例1中所述相同的定量微生物檢測來確定。結(jié)果如表1中所示。
表1
表1(續(xù))
＊公開于Agr.Biol.Chem.，29，10，889-894(1965)中的數(shù)據(jù)。
＊＊公開于Agr.Biol.Chem.，45，9，1983-1989(1981)中的數(shù)據(jù)。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)生物素的方法，包括以下步驟(a)在培養(yǎng)基中制備具有產(chǎn)生生物素能力的斯芬克斯小桿菌屬微生物的培養(yǎng)物；和(b)收集在培養(yǎng)基中產(chǎn)生和積累的生物素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中具有產(chǎn)生生物素能力的斯芬克斯小桿菌屬微生物是斯芬克斯小桿菌SC-42405(FERM BP-3995)或其突變體。
3.具有產(chǎn)生生物素能力的斯芬克斯小桿菌屬微生物在生產(chǎn)生物素中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的用于生產(chǎn)生物素的微生物的應(yīng)用，其中微生物是斯芬克斯小桿菌SC-42405(FERM BP-3995)或其突變體。
5.斯芬克斯小桿菌SC-42405(FERM BP-3995)或其突變體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種生產(chǎn)生物素的方法，其中在培養(yǎng)基中制備具有產(chǎn)生生物素能力的斯芬克斯小桿菌屬微生物的培養(yǎng)物，并收集培養(yǎng)基中產(chǎn)生和積累的生物素。本發(fā)明還公開了具有產(chǎn)生生物素能力的斯芬克斯小桿菌屬的微生物，其可用于本發(fā)明的這種生產(chǎn)方法中。
文檔編號C12P17/18GK1084217SQ93116830
公開日1994年3月23日 申請日期1993年9月9日 優(yōu)先權(quán)日1992年9月10日
發(fā)明者熊谷和夫, 三木美沙穗, 河野惠美子, 光田賢 申請人:住友化學(xué)工業(yè)株式會社