專利名稱：一種新的犬新孢子蟲速殖子的體外培養(yǎng)和染色方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及了一種新的犬新孢子蟲速殖子的體外培養(yǎng)和染色方法，屬于生命科學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
犬新孢子蟲是一種胞內(nèi)寄生性原蟲，形態(tài)與龔地弓形蟲相似，在其全部生活史中可出現(xiàn)數(shù)種不同的形態(tài)，即速殖子、包囊、卵囊等。它可引起妊娠母畜的流產(chǎn)和死胎，使新生兒患有嚴(yán)重的精神性疾病，給畜牧業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，危害嚴(yán)重，但迄今尚無理想的防治辦法，究其原因就是新孢子蟲速殖子在體外較難培養(yǎng)，并且由于速殖子體積較小，在細(xì)胞內(nèi)生長時(shí)如果不利用染色方法不容易被觀察到或被誤診，而且目前尚沒有簡單實(shí)用的新孢子蟲胞內(nèi)速殖子的染色方法，這不利于該病的快速檢測，同時(shí)也限制了該病疫苗的研

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供了一種新的犬新孢子蟲速殖子(N. C-I株)的體外培養(yǎng)和染色方法，其培養(yǎng)方法以MCF-7乳腺癌細(xì)胞為宿主細(xì)胞，當(dāng)培養(yǎng)成單層細(xì)胞細(xì)胞后，接種犬新孢子蟲速殖子，利用RPIM-1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，該培養(yǎng)方法簡單實(shí)用，且培養(yǎng)效果較好。本發(fā)明另一目的在于同時(shí)提供了一種新的犬新孢子蟲速殖子的染色方法，該方法利用吖啶橙進(jìn)行染色，染色結(jié)束后利用普通熒光顯微鏡即可對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行觀察，整個(gè)染色方法操作簡便，并且操作時(shí)間較短，這對(duì)于該病的快速診斷有很高的價(jià)值。本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的犬新孢子蟲速殖子的培養(yǎng)方法，其特征在于培養(yǎng)的具體步驟為首先常規(guī)培養(yǎng)MCF-7乳腺癌細(xì)胞，當(dāng)其長成細(xì)胞單層后，按104/ml接種 Iml犬新孢子蟲；之后用含洲胎牛血清的RPIM-1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，每天利用倒置顯微鏡觀察胞外新孢子蟲速殖子的數(shù)目，可看到胞外新孢子蟲速殖子的數(shù)目從第2天開始緩慢增長，自第3天開始迅速增長，在第4天即可達(dá)到頂峰，在第五天顯著下降。所述的犬新孢子蟲速殖子的染色采用胞內(nèi)速殖子吖啶橙染色，其具體步驟為新孢子蟲速殖子經(jīng)多聚甲醛固定，吖啶橙染色后經(jīng)普通熒光顯微鏡照相觀察；MCF-7細(xì)胞感染新孢子蟲速殖子后，在第三天和第五天分別進(jìn)行吖啶橙染色；經(jīng)熒光顯微鏡觀察，在第三天細(xì)胞內(nèi)可直觀、清晰地看到大量的速殖子，在第五天可看到細(xì)胞和速殖子均顯著減少。本發(fā)明的積極效果在于該培養(yǎng)方法簡單實(shí)用，可快速培養(yǎng)新孢子蟲速殖子，并且經(jīng)吖啶橙染色后利用普通熒光顯微鏡即可快速、直觀、清晰的觀察到胞內(nèi)寄生蟲。本培養(yǎng)方法與目前常用的培養(yǎng)新孢子蟲速殖子的vero細(xì)胞相比，可快速大量的培養(yǎng)新孢子蟲速殖子。在同等培養(yǎng)條件下，新孢子蟲速殖子的數(shù)目比在vero細(xì)胞中可早一天達(dá)到頂峰，并且達(dá)到頂峰后速殖子的數(shù)目與在vero細(xì)胞中頂峰時(shí)的數(shù)目相當(dāng)，表明 MCF-7細(xì)胞更適于新孢子蟲速殖子的生長。每天利用倒置顯微鏡觀察胞外新孢子蟲速殖子的數(shù)目，可看到胞外新孢子蟲速殖子的數(shù)目從第2天開始增長，直到第五天胞外速殖子的數(shù)目才達(dá)到頂峰。并且在第六天時(shí)新孢子蟲速殖子的數(shù)目迅速下降。因此，MCF-7細(xì)胞更適于培養(yǎng)新孢子蟲速殖子，從而為新孢子蟲的相關(guān)研究打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。目前，尚沒有新孢子蟲速殖子染色方法的報(bào)道，本發(fā)明填補(bǔ)了這一研究空白，從而為新孢子蟲病的診斷提供了一種快速有效的方法。如圖1所示每天利用倒置顯微鏡觀察胞外新孢子蟲速殖子的數(shù)目，連續(xù)觀察6天， 可看到胞外新孢子蟲速殖子的數(shù)目從第2天開始緩慢增長，自第3天開始迅速增長，在第4 天達(dá)到頂峰，在第五天顯著下降。如圖2所示新孢子蟲速殖子在MCF-7細(xì)胞和vero細(xì)胞中生長曲線的比較(在相同條件下)，可看出在MCF-7細(xì)胞中，新孢子蟲速殖子的數(shù)目在第4天即可達(dá)到頂峰，并且高峰期可持續(xù)一天，而在vero細(xì)胞中第5天才達(dá)到頂峰，達(dá)到頂峰后速殖子的數(shù)目迅速減少，表明MCF-7細(xì)胞更適于培養(yǎng)新孢子蟲速殖子，可作為培養(yǎng)新孢子蟲速殖子的新的宿主細(xì)胞。如圖3所示，利用普通熒光顯微鏡觀察MCF-7細(xì)胞的胞內(nèi)新孢子蟲速殖子 (900X), MCF-7細(xì)胞感染新孢子蟲速殖子后，在第三天和第五天吖啶橙染色。在488nm下 DNA呈綠色，在568nm下RNA呈紅色。第三天在細(xì)胞內(nèi)可看到大量的速殖子，在第五天可看到細(xì)胞和速殖子均顯著減少(A為第三天的胞內(nèi)速殖子，B為第五天的胞內(nèi)速殖子，右邊為相應(yīng)的對(duì)照組)。


圖1為MCF-7細(xì)胞胞外新孢子蟲速殖子的生長曲線。圖2為本發(fā)明新孢子蟲速殖子在MCF-7細(xì)胞和vero細(xì)胞中生長曲線的比較圖。圖3為本發(fā)明實(shí)驗(yàn)效果圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1
1.犬新孢子蟲(N.C-1)的培養(yǎng)方法
1.1 復(fù)蘇MCF-7細(xì)胞，利用RPMI-1640(10%胎牛血清，1%雙抗，4mM谷氨酰胺，2. 30mg /ml NaHCO3, 2. 38 mg /ml HEPES (pH 7.2) , 50 U /ml 青霉素，50 mg/ml 鏈霉素)，于培養(yǎng)箱中37°C、5% CO2環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)。1. 2在培養(yǎng)好的MCF-7細(xì)胞中，接種新孢子蟲速殖子，利用培養(yǎng)基RPMI-1640 (2% 胎牛血清，1%雙抗，4mM谷氨酰胺，2. 30mg /ml NaHCO3, 2. 38 mg /ml HEPES (pH 7.2) , 50 U /ml青霉素，50 mg/ml鏈霉素)，于培養(yǎng)箱中37°C、5% CO2環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)，每天更換新鮮的培養(yǎng)基，并通過倒置相差顯微鏡(40X10)對(duì)每個(gè)視野的速殖子進(jìn)行計(jì)數(shù)，繪制速殖子在不同細(xì)胞中的生長曲線(如圖1所示)，可看到約四天速殖子數(shù)量即可達(dá)到最大值。實(shí)施例2
2.吖啶橙染色觀察胞內(nèi)速殖子
新孢子蟲速殖子經(jīng)16%多聚甲醛(12ml多聚甲醛，88ml 二餾水)固定20分鐘，PBS (Na2HPO412H20 0.89g，NaCL 2g，KCLO. 06g，KH2PO4 0. 05g，250ml 二溜水)沖洗 2 遍，10% 吖啶橙(IOmg 吖啶橙，100ml PBS)染色 2 分鐘，1% triton (triton 1ml，二溜水 99ml)作用；Γ5
分鐘，封片后經(jīng)普通熒光顯微鏡照相。實(shí)驗(yàn)效果如圖3所示。
權(quán)利要求
1.犬新孢子蟲速殖子的培養(yǎng)方法，其特征在于培養(yǎng)的具體步驟為首先常規(guī)培養(yǎng) MCF-7乳腺癌細(xì)胞，當(dāng)其長成細(xì)胞單層后，按104/ml接種Iml犬新孢子蟲；之后用含洲胎牛血清的RPIM-1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，每天利用倒置顯微鏡觀察胞外新孢子蟲速殖子的數(shù)目，可看到胞外新孢子蟲速殖子的數(shù)目從第2天開始緩慢增長，自第3天開始迅速增長，在第4天即可達(dá)到頂峰，在第五天顯著下降。
2.犬新孢子蟲速殖子的染色采用胞內(nèi)速殖子吖啶橙染色，其特征在于染色的具體步驟為新孢子蟲速殖子經(jīng)多聚甲醛固定，吖啶橙染色后經(jīng)普通熒光顯微鏡照相觀察；MCF-7細(xì)胞感染新孢子蟲速殖子后，在第三天和第五天分別進(jìn)行吖啶橙染色；經(jīng)熒光顯微鏡觀察，在第三天細(xì)胞內(nèi)可直觀、清晰地看到大量的速殖子，在第五天可看到細(xì)胞和速殖子均顯著減少。
全文摘要
本發(fā)明涉及了一種新的犬新孢子蟲速殖子的體外培養(yǎng)和染色方法，其特征在于培養(yǎng)的具體步驟為首先常規(guī)培養(yǎng)MCF-7乳腺癌細(xì)胞，當(dāng)其長成細(xì)胞單層后，按104/ml接種1ml犬新孢子蟲；之后用含2%胎牛血清的RPIM-1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，每天利用倒置顯微鏡觀察胞外新孢子蟲速殖子的數(shù)目；染色的具體步驟為新孢子蟲速殖子經(jīng)多聚甲醛固定，吖啶橙染色后經(jīng)普通熒光顯微鏡照相觀察；該培養(yǎng)方法簡單實(shí)用，可快速培養(yǎng)新孢子蟲速殖子，并且經(jīng)吖啶橙染色后利用普通熒光顯微鏡即可快速、直觀、清晰的觀察到胞內(nèi)寄生蟲。
文檔編號(hào)C12Q1/02GK102533556SQ201010593980
公開日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2010年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月17日
發(fā)明者呂強(qiáng), 宮鵬濤, 張國才, 張楠, 張西臣, 李建華, 李 赫, 楊舉 申請(qǐng)人:吉林大學(xué)