貝母尼丁的藥物組合物及其在生物醫(yī)藥中的應用
【專利摘要】本發(fā)明公開了貝母尼丁的藥物組合物及其在生物醫(yī)藥中的應用，本發(fā)明提供的貝母尼丁的藥物組合物中含有貝母尼丁和一種結構新穎的天然產(chǎn)物化合物(Ⅰ)，貝母尼丁、化合物(Ⅰ)單獨作用時，對肺癌具有抑制作用；貝母尼丁和化合物(Ⅰ)聯(lián)合作用時，對肺癌的抑制效果進一步提高，可以開發(fā)成治療肺癌的藥物，與現(xiàn)有技術相比具有突出的實質性特點和顯著的進步。
【專利說明】
貝母尼丁的藥物組合物及其在生物醫(yī)藥中的應用
技術領域
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領域，涉及貝母尼丁的新用途，具體涉及貝母尼丁的藥物組 合物及其在生物醫(yī)藥中的應用。
【背景技術】
[0002] 肺癌是發(fā)病率和死亡率增長最快，對人群健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一。 近50年來許多國家都報道肺癌的發(fā)病率和死亡率均明顯增高，男性肺癌發(fā)病率和死亡率均 占所有惡性腫瘤的第一位，女性發(fā)病率占第二位，死亡率占第二位。肺癌的病因至今尚不完 全明確，大量資料表明，長期大量吸煙與肺癌的發(fā)生有非常密切的關系。已有的研究證明： 長期大量吸煙者患肺癌的概率是不吸煙者的10~20倍，開始吸煙的年齡越小，患肺癌的幾 率越高。此外，吸煙不僅直接影響本人的身體健康，還對周圍人群的健康產(chǎn)生不良影響，導 致被動吸煙者肺癌患病率明顯增加。
[0003] 迄今為止，尚未見貝母尼丁及其藥物組合物與肺癌的相關性報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種貝母尼丁的藥物組合物，該藥物組合物中含有貝母尼 丁和一種結構新穎的天然產(chǎn)物，貝母尼丁和該天然產(chǎn)物可以協(xié)同治療肺癌。
[0005] 本發(fā)明的上述目的是通過下面的技術方案得以實現(xiàn)的：
[0006] 一種具有下述結構式的化合物（I)，
[0007]
[0008] -種貝母尼丁的藥物組合物，包括貝母尼丁、如權利要求1所述的化合物（I)和藥 學上可以接受的載體，制備成需要的劑型。
[0009] 進一步地，藥學上可以接受的載體包括稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、 崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體或潤滑劑。
[0010] 進一步地，所述劑型包括片劑、膠囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、 膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、溶液劑、注射劑、栓劑、噴霧劑、滴劑或貼劑。
[0011] 上述化合物（I)的制備方法，包含以下操作步驟：（a)將夏枯草粉碎，用65~85%乙 醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水飽和的正丁醇萃 取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步驟(a)中正丁醇萃取物 用大孔樹脂除雜，先用6 %乙醇洗脫8個柱體積，再用70 %乙醇洗脫8個柱體積，收集70 %洗 脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中70%乙醇洗脫濃縮物用正相硅膠分 離，依次用體積比為50:1、25:1、15:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到4個組分；（d)步 驟(c)中組分4用正相硅膠進一步分離，依次用體積比為10:1、5:1和2:1的二氯甲烷-甲醇梯 度洗脫得到3個組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百 分濃度為75 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集8~14個柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到化 合物(I)。
[0012] 進一步地，化合物（I)的制備方法中，所述大孔樹脂為AB-8型大孔吸附樹脂。
[0013] 上述化合物(I)在制備治療肺癌的藥物中的應用。
[0014] 上述貝母尼丁的藥物組合物在制備治療肺癌的藥物中的應用。
[0015] 本發(fā)明的優(yōu)點：
[0016] 本發(fā)明提供的貝母尼丁的藥物組合物中含有貝母尼丁和一種結構新穎的天然產(chǎn) 物，貝母尼丁和該天然產(chǎn)物單獨作用時，對肺癌具有治療作用；二者聯(lián)合作用時，對肺癌的 治療效果進一步提高，可以開發(fā)成治療肺癌的藥物。
【具體實施方式】
[0017] 下面結合實施例進一步說明本發(fā)明的實質性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明保護范 圍。
[0018] 實施例1:化合物(I)分離制備及結構確證
[0019] 分離方法：（a)將夏枯草(3kg)粉碎，用75 %乙醇熱回流提取(20L X 3次），合并提取 液，濃縮至無醇味（4L)，依次用石油醚(4L X 3次）、乙酸乙酯（4L X 3次）和水飽和的正丁醇 (4LX3次）萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步驟(a)中 正丁醇萃取物用AB-8型大孔樹脂除雜，先用6%乙醇洗脫8個柱體積，再用70%乙醇洗脫8個 柱體積，收集70%洗脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中70%乙醇洗脫濃 縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為50:1 (8個柱體積）、25:1 (8個柱體積）、15:1 (8個柱體 積)和5:1(10個柱體積）的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到4個組分；（d)步驟(c)中組分4用正 相硅膠進一步分離，依次用體積比為10:1(8個柱體積）、5:1(10個柱體積)和2:1(5個柱體 積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反 相硅膠分離，用體積百分濃度為75 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集8~14個柱體積洗脫液， 洗脫液減壓濃縮得到化合物(I)(純度大于98% )。
[0020] 結構確證:冊431-]\^顯示[]\?1]+為111/2 343.0945，結合核磁特征可得分子式為 C15H18O9，不飽和度為7。核磁共振氫譜數(shù)據(jù)δΗ(ρρηι，acetone_d6，500MHz):H_3a(2 · 17，m)，H-3b(2.35，br，dd，J=14.0,6.4Hz)，H-4a(l .89，m)，H-4b(2.26,dd，J= 13.6，6·0Ηζ)，H-6 (4.24，s)，H-7(4.96，s)，H-10a(1.42，br，d，J=13.6Hz)，H-10b(2.76，br，d，J=13.6Hz)，H-13(1.82，s)，H-14(1.31，s)，OH-9 (6 · 89，s);核磁共振碳譜數(shù)據(jù) 5C( ppm，pyridi ne-d5， 125MHz):75.3(Ca-C)，221.9(C，2-C)，25.4(CH2,3-C)，23.7(CH2,4-C)，63.2(C，5-C)，66.5 (CH，6-C)，77.9(CH，7-C)，156.7(C，8-C)，106.8(C，9-C)，52.5(CH2，10_C)，135.7(C，n-C)， 168.9(C，12-C)，9.9(CH 3，13-C)，17.3(CH3，14-C)，172.9(C，15-C)。紅外光譜表明該化合物 含有羥基(3579CHT 1)和內(nèi)酯羰基（1737(31^1)結構。氫譜和碳譜顯示該化合物含有一個內(nèi)酯 結構[δΗ4.24(lH，s，H-6)，4.96( lH，s，H-7);Sc63.2(C-5)，66.5(C-6)，77.9(C-7)，172.9(C-15)]，一個〇，0-不飽和丫-內(nèi)酯結構[5。156.7(08)，106.8((：-9)，135.7((：-11)，168.9((：-12)]，一個縮醛碳^106.8(〇9)]，一個乙烯基甲基^1.82(3!1，8，!1-13)]以及一個甲基[6 h1.31(3H，s，H-14)]。綜合高分辨以及核磁共振譜數(shù)據(jù)，可以推斷出該化合物可能是一個倍 半萜類化合物。查閱文獻，發(fā)現(xiàn)該化合物和已知化合物Villosine具有相似的結構。比較兩 者核磁數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，這兩個化合物只是在C-1和C-2以及C-5和C-6位存在一定的區(qū)別。在該化 合物的HMBC譜中，可以通過H 2-3與C-1，H2-10與C-2以及H3-14與C-2的相關性證明該化合物 的C-1連有羥基，而C-2位是一個羰基。此外，H-6與C-5，H 2-4與C-5和C-6之間的相關信號說 明在化合物Villosine中C-5和C-6的三元氧環(huán)開環(huán)。至此我們將該化合物的平面結構解析 出來。N0ESY譜中缺少H-6與H-7的相關性，以及在 1H-匪R譜中兩者沒有耦合常數(shù)，表明兩者 不在同一側。通過單晶X射線衍射法可知該化合物的相對構型為1S，5R，6R，7R，9S。綜合氫 譜、碳譜、HMBC譜和N0ESY譜，以及文獻關于相關類型核磁數(shù)據(jù)，可基本確定該化合物如下所 示，立體構型進一步通過E⑶試驗確定，理論值與實驗值一致。
[0021] 該化合物化學式及碳原子編號如下：
[0022]
[0023] 實施例2:藥理作用
[0024] 本實施例使用右腋皮下接種肺癌瘤株細胞建立lewis肺癌小鼠模型，測定各組的 抑瘤率和Bcl-2及Bax表達水平，觀察藥物上調(diào)Bax、下調(diào)Bcl-2的表達、誘導腫瘤細胞凋亡來 抑制腫瘤生長的抗腫瘤作用。
[0025] 1、材料與方法
[0026] 1.1動物
[0027] C57BL/6純系小鼠，雄性6~8周，（20±2)g，北京維通利華公司動物實驗中心。
[0028] 1.2試劑與樣品
[0029]貝母尼丁自制并經(jīng)過結構確證?；衔铮↖)自制，制備方法見實施例1。兔抗鼠 Bax 單克隆抗體、兔抗鼠 Be 1-2單克隆抗體(SANTACRUZ公司）、二步法免疫組化檢測試劑盒，DAB 顯示劑(北京中杉金橋公司）。瘤株Lewis肺癌，Lewis肺癌荷瘤鼠由中科院腫瘤研究所提供 并傳代保種;Lewis肺癌維持在C57BL/6小鼠體內(nèi)，每2周傳代1次。
[0030] 1.3小鼠分組及模型制備
[0031] C57BL/6小鼠隨機分組，每組12只，分別為模型對照組(NS組）、貝母尼丁組、化合物 (I)組、貝母尼丁與化合物（I)組合物組。每只小鼠右腋皮下接種肺癌瘤株細胞，建立lewis 肺癌小鼠模型，從接種腫瘤次日開始，分別腹腔注射給藥。生理鹽水(NS)組:0.9%生理鹽水 0.2mL，連續(xù)10d;貝母尼丁組:40mg/(kg · d)，連續(xù)給藥10d;化合物（I)組:40mg/(kg · d)，連 續(xù)給藥l〇d;貝母尼丁與化合物（I)組合物組:40mg/(kg · d)貝母尼丁+40mg/(kg · d)化合物 (I)，連續(xù)給藥l〇d。末次給藥后24h，小鼠稱重，處死。
[0032] 1.5瘤重測定實驗
[0033]末次給藥后24h將小鼠稱重，斷頸處死，剝?nèi)×鰤K稱重。
[0034] 抑瘤率（％ )=(模型組平均瘤重-治療組平均瘤重)/模型組平均瘤重X 100%。 [0035] 1.6Lewis肺癌Bcl_2、Bax表達變化的測定實驗
[0036]免疫組化法測定Bcl-2、Bax表達。瘤塊以石蠟包埋制成4μπι厚的切片，脫蠟、水化 后，3 %Η202滅活內(nèi)源性過氧化物酶，高壓抗原修復，后續(xù)步驟按照二步法免疫組化檢測試 劑盒說明書操作。陰性對照以0.01mol/LPBS(pH=7.4)代替一抗。在光學顯微鏡下觀察鹽水 對照組和各給藥實驗組樣本的免疫組化切片。
[0037]結果判定:每張切片在5~10個高倍視野下進行細胞計數(shù)，每個視野計數(shù)100~200 個細胞，共1000個細胞，計算每張切片陽性細胞數(shù)所占比例。Bcl-2在胞漿出現(xiàn)棕黃色染色 為陽性染色。Bax在胞衆(zhòng)和(或)胞膜出現(xiàn)棕黃色染色為陽性染色。
[0038] 1.7統(tǒng)計學方法
[0039]數(shù)據(jù)均以x±s表示，采用SPSS13.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，單因素方差分析。
[0040] 2、實驗結果
[0041 ] 2.1對Lewis肺癌模型小鼠實體瘤的影響
[0042]與模型對照組比較，貝母尼丁與化合物（I)組合物組瘤重明顯減小(P<0.01)，抑 瘤率明顯增加（p<〇. 01);與模型對照組比較，貝母尼丁組、化合物（I)組瘤重減?。╬< 0.05)，抑瘤率增加(P<0.05)。結果見表1。
[0043] 2.2對Lewis肺癌模型小鼠 Bcl-2及Bax表達的影響
[0044] 與模型對照組比較，貝母尼丁與化合物（I)組合物組Bcl-2表達明顯降低（P< 0.01)，Bax表達明顯升高(P<0.01);與模型對照組比較，貝母尼丁組、化合物（I)組Bcl-2表 達降低(P<〇.〇5)，Bax表達升高(P<0.05)。結果見表1。
[0045] 表1對小鼠體內(nèi)Lewis肺癌生長及Bcl-2、Bax表達水平的影響(X土s，n = 10)
[0046]
[0047] 肺癌的發(fā)生是一個涉及多因素多階段的復雜過程，近年來研究表明，肺癌的發(fā)生 可能是由于細胞凋亡與增殖失衡造成的。細胞凋亡是細胞自身的一種主動的、生理性死亡 機制，細胞調(diào)亡過程受促調(diào)亡因子和調(diào)亡抑制因子的共同調(diào)節(jié)。其中Bcl-2和Bax屬于Bcl-2 同一家族，與人類多種腫瘤的發(fā)生有密切關系的基因。Bcl-2是從人類濾泡型非霍奇金B(yǎng)細 胞淋巴瘤克隆到的原癌基因，其通過穩(wěn)定線粒體膜的功能，阻止線粒體釋放Caspase、凋亡 誘導因子和細胞色素 C等作用抑制細胞凋亡。Bcl-2通過抑制細胞凋亡而參與腫瘤的發(fā)生。 Bax基因具有拮抗Bcl-2的作用，是促凋亡基因。當Bax蛋白大量表達，并與Bcl-2蛋白形成異 源二聚體時加速細胞死亡，Bcl-2和Bax的表達程度對決定細胞接受凋亡信號后存活與否起 關鍵作用。目前，多數(shù)研究表明，Bcl-2與Bax的表達之間呈負相關，Bcl-2過量表達，細胞存 活;Bax蛋白過量表達，細胞死亡。
[0048] 結果表明，貝母尼丁、化合物（I)單獨作用時，對肺癌具有抑制作用；貝母尼丁和化 合物(I)聯(lián)合作用時，對肺癌的抑制效果進一步提高，可以開發(fā)成治療肺癌的藥物。
[0049] 上述實施例的作用在于說明本發(fā)明的實質性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明的保護 范圍。本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發(fā)明的技術方案進行修改或者等同替換， 而不脫離本發(fā)明技術方案的實質和保護范圍。
【主權項】
1. 一種具有下述結構式的化合物（I)，2. -種貝母尼丁的藥物組合物，其特征在于:包括貝母尼丁、如權利要求1所述的化合 物(I)和藥學上可以接受的載體，制備成需要的劑型。3. 根據(jù)權利要求2所述的貝母尼丁的藥物組合物，其特征在于:藥學上可以接受的載體 包括稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體 或潤滑劑。4. 根據(jù)權利要求2所述的貝母尼丁的藥物組合物，其特征在于:所述劑型包括片劑、膠 囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、溶液劑、注射劑、 栓劑、噴霧劑、滴劑或貼劑。5. 權利要求1所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于，包含以下操作步驟：（a)將夏 枯草粉碎，用65~85%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油醚、乙酸乙 酯和水飽和的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b) 步驟(a)中正丁醇萃取物用大孔樹脂除雜，先用6%乙醇洗脫8個柱體積，再用70%乙醇洗脫 8個柱體積，收集70%洗脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中70 %乙醇洗 脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為50:1、25:1、15:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗 脫得到4個組分；（d)步驟(c)中組分4用正相硅膠進一步分離，依次用體積比為10:1、5:1和 2:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反 相硅膠分離，用體積百分濃度為75 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集8~14個柱體積洗脫液， 洗脫液減壓濃縮得到化合物(I)。6. 根據(jù)權利要求5所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:所述大孔樹脂為AB-8型 大孔吸附樹脂。7. 權利要求1所述的化合物（I)在制備治療肺癌的藥物中的應用。8. 權利要求2~4任一所述的貝母尼丁的藥物組合物在制備治療肺癌的藥物中的應用。
【文檔編號】A61K31/365GK106008544SQ201610362895
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年5月27日
【發(fā)明人】田麗華
【申請人】淄博夸克醫(yī)藥技術有限公司