一種賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶的原核重組表達(dá)與制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶的原核重組表達(dá)與制備方法。該制備方法包括：向受體大腸桿菌細(xì)胞中導(dǎo)入氨基酸序列為序列2的重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶的編碼基因，得到重組大腸桿菌細(xì)胞；對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，收集并破碎重組大腸桿菌細(xì)胞，得到包含體；然后依次進(jìn)行變性、復(fù)性、激活、純化，得到重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶。采用本發(fā)明的制備方法制備的重組Lys?C蛋白酶具有高的酶活力和較高的尿素耐受。本發(fā)明的制備方法具有酶、特異性好、無動(dòng)物來源病毒等有優(yōu)點(diǎn)，生產(chǎn)與制備工藝簡(jiǎn)單、成本低，可以應(yīng)用于生物制藥和蛋白質(zhì)組學(xué)研究。
【專利說明】
一種賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶的原核重組表達(dá)與制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及一種賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶的原核重組表達(dá)與制備方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶1^871611(1〇口6口1^(^86化0 3.4.21.50)可以特異性在蛋白底物 C端的賴氨酸進(jìn)行消化，目前報(bào)道的Lysyl endopeptidase主要有三種，分別是來源于 Achromobacter lyticus的Achromobacter protease I (API)，來源于Lysobacter enzymogenes的lysyl endopeptidase和來源于Pseudomonas aeruginosa的preL〇對(duì)API(A-LEP)的研究表明，API在表達(dá)的時(shí)候以酶原的形式表達(dá)，其完整序列包括20個(gè)氨基酸的信號(hào) 肽序列，N端185個(gè)氨基酸的pro-peptide和C端的180個(gè)氨基酸的extension peptide以及由 268個(gè)氨基酸組成的成熟的API API比trypsin有更高的活性、更廣泛的pH耐受和表面活性 劑耐受等特點(diǎn)。這些特點(diǎn)使API成為蛋白序列分析、蛋白組學(xué)研究和生物制藥工藝的重要工 具。
[0003]對(duì)來源于Lysobacter enzymogenes的賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶lysyl endopeptidase (Le-LEP)進(jìn)行序列分析表明，Le-LEP具有與A-LEP相同的pro-peptide和extension peptide組成形式，但是其表達(dá)水平非常低。至今尚無基因工程重組表達(dá)Le-LEP的成功報(bào) 道。利用傳統(tǒng)菌種篩選方法可以獲得高表達(dá)菌種，但是仍無法滿足工業(yè)生產(chǎn)需要。
[0004] 來源于Pseudomonas aeruginosa的preL的基因構(gòu)造跟前兩種蛋白有所不同，其完 整序列包括24個(gè)氨基酸的信號(hào)肽序列，N端187個(gè)氨基酸的pro-peptide和251個(gè)氨基酸組成 的成熟的preL。雖然三種來源的Lysyl endopeptidase都實(shí)現(xiàn)了商品化銷售，但因?yàn)閜reL具 有更為優(yōu)越的表面活性劑以及高達(dá)8M尿素的耐受能力，因此在蛋白組學(xué)研究中越來越受到 研究者的重視。但與Le-LEP類似，至今尚無基于原核表達(dá)體系進(jìn)行preL重組表達(dá)并進(jìn)行蛋 白復(fù)性的成功報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是利用分子生物學(xué)技術(shù)，采用大腸桿菌作為宿主細(xì) 胞，構(gòu)建Lysyl endopeptidase(Lys-C) (preL)的表達(dá)載體，并優(yōu)化蛋白復(fù)性和純化方法，獲 得均一、高活性、高特異性的重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶(Lys-C)。
[0006] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了一種制備重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶的方 法。
[0007] 本發(fā)明所提供的制備重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶的方法，具體可包括如下步驟：
[0008] (1)向受體大腸桿菌細(xì)胞中導(dǎo)入氨基酸序列如序列表中序列2所示的重組賴氨酰 肽鏈內(nèi)肽酶的編碼基因，得到重組大腸桿菌細(xì)胞；
[0009] (2)對(duì)所述重組大腸桿菌細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)后，收集所述重組大腸桿菌細(xì)胞;破碎 所述重組大腸桿菌細(xì)胞，得到包含體；
[0010] (3)對(duì)所述包含體進(jìn)行變性，得到變性后的樣品；
[0011] (4)將所述變性后的樣品進(jìn)行復(fù)性，得到復(fù)性后的樣品；
[0012] (5)將所述復(fù)性后的樣品進(jìn)行激活，得到有活性的重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶粗品；
[0013] (6)對(duì)所述重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶粗品進(jìn)行純化，得到純化后的重組賴氨酰肽鏈 內(nèi)肽酶；
[0014] 在步驟(4)中，所述復(fù)性在復(fù)性緩沖液中進(jìn)行，所述復(fù)性緩沖液的pH值為9.0-10.0 (如pH值為10)，所述復(fù)性緩沖液由溶劑和溶質(zhì)組成，所述溶劑為水，所述溶質(zhì)為三羥甲基氨 基甲烷、胱氨酸、半胱氨酸和尿素;所述三羥甲基氨基甲烷在所述復(fù)性緩沖液中的濃度為5-50mM，所述胱氨酸在所述復(fù)性緩沖液中的濃度為0.5-2mM，所述半胱氨酸在所述復(fù)性緩沖液 中的濃度為3-5mM，所述尿素在所述復(fù)性緩沖液中的濃度為0.4-2M。
[0015] 更加具體的，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述所述復(fù)性緩沖液的pH值為10.0,所述 復(fù)性緩沖液由溶劑和溶質(zhì)組成，所述溶劑為水，所述溶質(zhì)為三羥甲基氨基甲烷、胱氨酸、半 胱氨酸和尿素;所述三羥甲基氨基甲烷在所述復(fù)性緩沖液中的濃度為20mM，所述胱氨酸在 所述復(fù)性緩沖液中的濃度為ImM，所述半胱氨酸在所述復(fù)性緩沖液中的濃度為3mM，所述尿 素在所述復(fù)性緩沖液中的濃度為2M。
[0016] 在步驟(5)中，所述激活為將所述復(fù)性后的樣品調(diào)pH值為5.5-9.5(如7.0-8.0,再 如7.5)，于25°C靜置1-6小時(shí)(如3-6小時(shí)，再如6小時(shí)）。
[0017] 在步驟(6)中，所述純化為將所述重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶粗品依次進(jìn)行硫酸銨沉 淀、金屬離子親和層析、超濾濃縮和凝膠過濾層析；
[0018]所述金屬離子親和層析采用的層析介質(zhì)為Chelating FF(金屬螯合高流速瓊脂糖 微球)或者Chelating HP(金屬螯合高分辨瓊脂糖微球）；所述凝膠過濾層析采用的層析介 質(zhì)為Sephacryl S-100(丙稀葡萄糖凝膠S-100)。
[0019] 其中，在進(jìn)行所述硫酸銨沉淀前還可包括對(duì)所述重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶粗品進(jìn) 行-20 °C凍融12-16h (過夜，具體如14h)的步驟。
[0020] 在本發(fā)明中，所述重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶的編碼基因具體可是如下a)或b)或c)的 核酸分子：
[0021] a)其編碼序列如序列表中序列1所示的DNA分子；
[0022] b)其編碼序列是將序列表中序列1中的T均替換為U，其它核苷酸不變得到的RNA分 子；
[0023] c)在嚴(yán)格條件下與a)限定的DNA分子雜交且編碼序列表中序列2所示的重組賴氨 酰肽鏈內(nèi)肽酶的DNA分子。
[0024] 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員很容易地采用已知的方法，例如定向進(jìn)化和點(diǎn)突變的方法， 對(duì)所述重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶的編碼基因序列進(jìn)行突變，那些經(jīng)過人工修飾的，與所述重 組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶的編碼基因序列具有75%或者更高同一性且具有相同的功能，均是衍 生于本發(fā)明的核苷酸序列并且等同于本發(fā)明的序列。
[0025] 這里使用的術(shù)語"同一性"指與天然核酸序列的序列相似性。"同一性"包括與本發(fā) 明序列1所示的DNA分子具有75%或更高，或85%或更高，或90%或更高，或95%或更高同一 性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行評(píng)價(jià)。使用計(jì)算機(jī)軟件，兩個(gè)或多個(gè) 序列之間的同一性可以用百分比（％ )表示，其可以用來評(píng)價(jià)相關(guān)序列之間的同一性。
[0026] 所述嚴(yán)格條件可為在2 X SSC，0.1 % SDS的溶液中，在68 °C下雜交并洗膜2次，每次 5min，又于0.5 X SSC，0.1 % SDS的溶液中，在68°C下雜交并洗膜2次，每次15min。
[0027] 在本發(fā)明中，序列表中序列1所示的重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶的編碼基因是為經(jīng)過 密碼子優(yōu)化的基因；所述優(yōu)化為在不改變野生型賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶的氨基酸序列的前提 下，將其密碼子替換為大腸桿菌偏好(高頻使用）的密碼子。所述優(yōu)化還包括對(duì)賴氨酰肽鏈 內(nèi)肽酶的基因序列的其他改造，以適合在大腸桿菌中表達(dá)。本發(fā)明中使用的術(shù)語"偏好的密 碼子"具有本領(lǐng)域公知的含義，也稱為密碼子的偏好性(Codon Preference)，是指某些生物 體更偏愛使用某些同義三聯(lián)密碼子(即編碼相同氨基酸的密碼子）。
[0028] 在步驟（1)中，所述重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶的編碼基因是通過重組表達(dá)載體的形 式導(dǎo)入所述受體大腸桿菌細(xì)胞中的。更加具體的，所述重組表達(dá)載體為將序列表中序列1的 第502-1818位所示DNA片段替換pET-32a( + )載體的EcoR I/Xho I的識(shí)別序列間的DNA片段 后得到的重組質(zhì)粒。
[0029]在本發(fā)明中，所述大腸桿菌具體可為大腸桿菌BL21 (DE3)。
[0030] 在所述方法中，所述金屬離子親和層析的洗脫程序具體可如下：1)用平衡液與洗 脫緩沖液的混合液進(jìn)行咪唑線性洗脫，共洗脫5個(gè)柱體積，在所述5個(gè)柱體積內(nèi)，咪唑在所述 混合液中的濃度由0M線性升至0.01M;2)用所述平衡液與所述洗脫緩沖液的混合液進(jìn)行咪 唑線性洗脫，共洗脫10個(gè)柱體積，在所述10個(gè)柱體積內(nèi)，咪唑在所述混合液中的濃度由 0.01M線性升至0.5M。所述平衡液由溶劑和溶質(zhì)組成；溶劑為水，溶質(zhì)及其濃度為：20mM Tris，2M NaCl，pH 7.5。所述洗脫緩沖液由溶劑和溶質(zhì)組成；溶劑為水，溶質(zhì)及其濃度為： 20mMTris，2M NaCl，0.5M咪唑，ρΗ7·5。
[0031] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，進(jìn)行所述金屬離子親和層析時(shí)采用的親和柱的柱體積 為5ml。在進(jìn)行上柱前還包括采用所述平衡液液對(duì)所述層析柱進(jìn)行平衡的步驟。
[0032] 在所述方法中，所述凝膠過濾層析所用層析柱的柱長(zhǎng)度和柱內(nèi)直徑比為165:8(如 33cm: 1.6cm);所述凝膠過濾層析所采用的洗脫液的pH值為3-4,所述洗脫液由溶劑和溶質(zhì) 組成，所述溶劑為水，所述溶質(zhì)為醋酸和棉籽糖，所述醋酸在所述洗脫液中的濃度為50mM， 所述棉籽糖在所述洗脫液中的濃度為6.7mg/mL。
[0033]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述凝膠過濾層析所用層析柱具體為GE Healthcare 公司生產(chǎn)的"XK 16X40,柱高：33mm"柱子。在進(jìn)行上柱前還包括采用所述凝膠過濾層析所 采用的洗脫液對(duì)所述層析柱進(jìn)行平衡的步驟。進(jìn)行所述凝膠過濾層析時(shí)的上樣量為2mL，層 析流速3mL/min。
[0034] 在所述方法中，進(jìn)行所述金屬離子親和層析和所述凝膠過濾層析時(shí)，均是收集采 用SDS電泳檢測(cè)在約28KD的位置上出現(xiàn)目的條帶的洗脫峰，進(jìn)行后續(xù)操作。
[0035] 在所述方法中，所述硫酸銨沉淀的步驟具體可為：1)在所述激活后的樣品中加入 固體硫酸銨至60 %飽和濃度，4 °C攪拌直至硫酸銨完全溶解（1小時(shí)），在冰上沉淀蛋白4小 時(shí);2)離心收集沉淀蛋白（如4000rpm離心40分鐘）。
[0036] 在所述方法中，在所述硫酸銨沉淀和所述金屬離子親和層析之間還可包括重懸所 述沉淀蛋白的步驟;進(jìn)行所述重懸時(shí)使用的重懸緩沖液的溶劑為水，溶質(zhì)及濃度如下:20mM Tris,150mM NaCl,pH 7.5〇
[0037] 在所述方法中，所述超濾濃縮為采用截留分子量具體為lOkD的超濾濃縮。
[0038] 在所述方法的步驟(2)中，對(duì)所述重組大腸桿菌細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)為向培養(yǎng)有所 述重組大腸桿菌的培養(yǎng)體系中加入IPTG至其終濃度為0.5-1.5mM，32°C誘導(dǎo)9小時(shí)。
[0039] 更加具體的，所述步驟(2)為:將所述重組大腸桿菌細(xì)胞接種到發(fā)酵培養(yǎng)基(初始 0D_為0.01)中；先在條件1下進(jìn)行培養(yǎng)，得到發(fā)酵液1;再向所述發(fā)酵液1中加入補(bǔ)料，在條 件2下培養(yǎng)，然后加入IPTG至其終濃度為0.5-1.5mM，32°C誘導(dǎo)9小時(shí)，得到發(fā)酵液2;從所述 發(fā)酵液2中收集所述重組大腸桿菌細(xì)胞;破碎所述重組大腸桿菌細(xì)胞，得到所述包含體。
[0040] 所述條件1具體可為:培養(yǎng)溫度為37°C;溶氧量(D0)(相對(duì)溶氧量)設(shè)定為15% ;pH 值為7.0;培養(yǎng)至發(fā)酵體系的0D6Q()>31。
[0041] 所述條件2具體可為:培養(yǎng)溫度為32°C，溶氧量(D0)(相對(duì)溶氧量)設(shè)定為15% ;pH 值為7.0;培養(yǎng)至發(fā)酵體系的0D6(x)為100。
[0042]所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成可如下：每1L所述發(fā)酵培養(yǎng)基中含有26-27g甘油、39-41g 酵母粉、1.6-2.0g磷酸二氫鉀、1.6-2.0g檸檬酸、4.9-5. lmL鹽溶液、0.9-1. lmL微量金屬鹽 溶液、0.9-1. lmL消泡劑204,余量為水;pH值為7.2-7.4。其中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值可通 過30% (體積百分含量)氨水進(jìn)行控制。
[0043]更加具體的，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成如下：每1L所述發(fā)酵培養(yǎng)基中含有26.7g甘 油、40g酵母粉、1.8g磷酸二氫鉀、1.8g檸檬酸、5mL鹽溶液、lmL微量金屬鹽溶液、lmL消泡劑 204,余量為水;pH值為7.2。
[0044] 其中，所述鹽溶液由水和溶質(zhì)組成，所述溶質(zhì)及其濃度為：250g/L MgCl2 · 6H20、 100g/L CaCl2.2H20、100g/L KC1、2M梓檬酸(Citric acid)。所述微量金屬鹽溶液的組成如 下：每1L所述微量金屬鹽溶液中含有6.80g ZnCl2、54.00g FeCl3 · 6H20、16.20gMnCl2 · 4H20、2.20g CuS〇4 · 5H20、4.80g CoCh · 6H2〇、0.024g(NH4)6M〇7〇24 · 4H20、0.20g KI和 119mL 3 7 % (體積百分比濃度)的濃鹽酸，余量為水。
[0045]所述補(bǔ)料由水和溶質(zhì)組成，所述溶質(zhì)及其濃度可為:270-280g/L甘油和220-230g/ L酵母粉，具體可為275g/L甘油和225g/L酵母粉。
[0046] 收集所述重組大腸桿菌細(xì)胞的方法可為離心或過濾中至少一種，具體可為離心收 集;破碎所述重組大腸桿菌細(xì)胞方法可為高壓勻漿、凍融或超聲破碎中至少一種，具體可為 高壓勻漿破碎。
[0047] 在步驟(3)中，對(duì)所述包含體進(jìn)行變性是在變性緩沖液中進(jìn)行。所述變性緩沖液的 pH值為10.0;所述變性緩沖液由溶劑和溶質(zhì)組成，所述溶劑為水，所述溶質(zhì)為三羥甲基氨基 甲烷、尿素和二硫蘇糖醇;所述三羥甲基氨基甲烷在所述變性緩沖液中的濃度為5-100mM; 所述尿素在所述變性緩沖液中的濃度為6-8M;所述二硫蘇糖醇在所述變性緩沖液中的濃度 為10-100mM 〇
[0048] 更加具體的，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述變性緩沖液的pH值為10.0;所述變性 緩沖液由溶劑和溶質(zhì)組成，所述溶劑為水，所述溶質(zhì)為三羥甲基氨基甲烷、尿素和二硫蘇糖 醇;所述三羥甲基氨基甲烷在所述變性緩沖液中的濃度為20mM;所述尿素在所述變性緩沖 液中的濃度為8M;所述二硫蘇糖醇在所述變性緩沖液中的濃度為20mM。
[0049] 所述變性的溫度為20-30Γ (室溫），時(shí)間為3_4h。變性后離心收集上清液，得到所 述變性后的樣品。
[0050] 進(jìn)行所述變性時(shí)，所述包含體與所述變性緩沖液的比例具體可為lg: 40mL
[0051]在步驟(4)中，將所述變性后的樣品進(jìn)行復(fù)性時(shí)，所述變性后的樣品與所述復(fù)性緩 沖液的比例具體可為1:20 (體積比）。
[0052] 所述復(fù)性的溫度為25°C，時(shí)間為12-16h(過夜），如14h。
[0053]利用所述方法制備得到的重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0054]本發(fā)明還提供了一種用于制備重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶的成套試劑和試劑盒。
[0055] 本發(fā)明所提供的用于制備重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶的成套試劑，由所述復(fù)性緩沖 液、進(jìn)行所述金屬離子親和層析時(shí)采用的所述平衡液和所述洗脫緩沖液、進(jìn)行所述凝膠過 濾層析時(shí)采用的所述洗脫液組成。
[0056] 本發(fā)明所提供的用于制備重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶的試劑盒，含所述成套試劑，以 及如下中全部或部分:大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞、能夠表達(dá)氨基酸序列如序列表中序列2所示的 重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶的原核表達(dá)載體、IPTG、Chelating FF或者Chelating HP、 Sephacryl S-100〇
[0057] 所述試劑盒中還含有記載有前文所述的制備重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶的方法的可 讀性載體。
[0058]下述生物材料中的任一種也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍：
[0059] (al)序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)；
[0060] (a2)序列表中序列1所示的DNA分子；
[0061 ] (a3)將序列表中序列1中的T均替換為U，其它核苷酸不變得到的RNA分子；
[0062] (a4)含有序列表中序列1所示的DNA分子的表達(dá)盒、重組載體、重組微生物、重組病 毒、轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物細(xì)胞系。
[0063] 其中，所述轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系和所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物細(xì)胞系均為非繁殖材料。
[0064] 下述應(yīng)用中的任一種也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍：
[0065] I)所述方法在制備重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶中的應(yīng)用；
[0066] II)所述成套試劑在制備重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶中的應(yīng)用；
[0067] III)所述試劑盒在制備重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶中的應(yīng)用；
[0068] IV)所述生物材料在制備重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶中的應(yīng)用。
[0069] 在本發(fā)明中，所述重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶的氨基酸序列如序列表中序列2所示。
[0070] 實(shí)驗(yàn)證明，采用本發(fā)明的制備方法制備的重組Lys-c蛋白酶具有高的酶活力和較 高的尿素耐受。本發(fā)明的制備方法具有酶切特異性好、無動(dòng)物來源病毒等有優(yōu)點(diǎn)，生產(chǎn)與制 備工藝簡(jiǎn)單、成本低，可以應(yīng)用于生物制藥和蛋白質(zhì)組學(xué)研究。
【附圖說明】
[0071] 圖1為大腸桿菌發(fā)酵與表達(dá)鑒定。其中，A為大腸桿菌發(fā)酵的生長(zhǎng)曲線，標(biāo)注31的檢 測(cè)點(diǎn)對(duì)應(yīng)的OD600為加入IPTG誘導(dǎo)時(shí)發(fā)酵液的0D600值，標(biāo)注100的代表菌體收集時(shí)發(fā)酵液的 OD6Q0值。B為對(duì)BL21-Lys-C菌株的誘導(dǎo)后的全菌蛋白、上清和包含體進(jìn)行15%SDS-PAGE電泳 檢測(cè)結(jié)果。C為包含體經(jīng)8M尿素溶解后的質(zhì)譜分析結(jié)果。
[0072] 圖2為復(fù)性蛋白的激活條件優(yōu)化。其中，A為不同pH對(duì)復(fù)性蛋白的激活結(jié)果比較，箭 頭所示條帶為激活蛋白條帶。B為pH 7.5條件下，不同激活時(shí)間對(duì)蛋白激活的影響，箭頭所 示條帶為激活蛋白條帶。
[0073] 圖3為蛋白純化以及相應(yīng)蛋白分析結(jié)果。其中，A為親和層析的色譜圖，親和洗脫收 集的色譜峰為虛線包括范圍。B為凝膠層析的色譜圖，凝膠層析收集的洗脫峰為虛線包括范 圍。C為純化各步驟的聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)分析結(jié)果(分子篩峰1為圖3中B的凝膠層 析色譜峰的30-45mL組分，分子篩主峰為圖3中B的凝膠層析色譜峰的45-55mL對(duì)應(yīng)組分，即 虛線部分為分子篩主峰的液質(zhì)連用(LC/MS)分析的結(jié)果。
[0074] 圖4為純化蛋白的活性分析結(jié)果。其中，A為純化Lys-C對(duì)大腸桿菌全蛋白在不同尿 素濃度下對(duì)底物蛋白的酶切比較結(jié)果。B為純化Lys-C對(duì)大腸桿菌全蛋白在2M尿素濃度下對(duì) 底物蛋白在不同酶切比例條件下的酶切比較結(jié)果。C為純化Ly s -C對(duì)大腸桿菌全蛋白在2M尿 素濃度下，按照1:50比例進(jìn)行酶切樣品的質(zhì)譜分析的離子峰。
【具體實(shí)施方式】
[0075] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0076] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0077] pET_32a( + )載體:Novagen公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為69030-3。
[0078]高密度基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基:每1L所述發(fā)酵培養(yǎng)基中含有26.7g甘油、40g酵母粉、1.8g 磷酸二氫鉀、1.8g檸檬酸、5mL鹽溶液、lmL微量金屬鹽溶液、lmL消泡劑204，余量為水;pH值 為 7.2。
[0079] 其中，所述鹽溶液由水和溶質(zhì)組成，所述溶質(zhì)及其濃度為：250g/L MgCl2 · 6H20、 100g/L CaCl2.2H20、100g/L KC1、2M梓檬酸(Citric acid)。所述微量金屬鹽溶液的組成如 下：每1L所述微量金屬鹽溶液中含有6.80g ZnCl2、54.00g FeCl3 · 6H20、16.20gMnCl2 · 4H20、2.20g CuS〇4 · 5H20、4.80g CoCh · 6H2〇、0.024g(NH4)6M〇7〇24 · 4H20、0.20g KI和 119mL 3 7 % (體積百分比濃度)的濃鹽酸，余量為水。
[0080]補(bǔ)料：由水和溶質(zhì)組成，所述溶質(zhì)及其濃度為:275g/L甘油和225g/L酵母粉。
[0081 ]包含體洗滌緩沖液：由溶劑和溶質(zhì)組成，溶劑為pH值為7.2-7.5的10mM的roS緩沖 液，溶質(zhì)及其濃度為:2M尿素。
[0082]變性緩沖液：由溶劑和溶質(zhì)組成。溶劑為水，溶質(zhì)及其濃度為:20mM三羥甲基氨基 甲烷(Tr i s)、8M尿素(urea)和20mM二硫蘇糖醇(DTT); pH值為10.0。
[0083]復(fù)性緩沖液：由溶劑和溶質(zhì)組成，溶劑為水，溶質(zhì)及其濃度如下：20mM三羥甲基氨 基甲燒(Tris)、2M尿素(Urea)、ImM胱氨酸（Cystine)和3mM半胱氨酸（Cysteine);pH值為 10.0〇
[0084] 硫酸銨沉淀所采用的復(fù)溶緩沖液：由溶劑和溶質(zhì)組成。溶劑為水，溶質(zhì)及其濃度 為：20mM Tris，150mM NaCl，pH 7.5。
[0085] 親和層析所采用的平衡液：由溶劑和溶質(zhì)組成。溶劑為水，溶質(zhì)及其濃度為：20mM Tris，2M NaCl，pH 7.5。
[0086] 親和層析所采用的洗脫緩沖液：由溶劑和溶質(zhì)組成。溶劑為水，溶質(zhì)及其濃度為： 20mM Tris，2M NaCl，0.5M咪唑，pH 7.5。
[0087] 超濾稀釋緩沖液：由溶劑和溶質(zhì)組成。溶劑為水，溶質(zhì)及其濃度為:20mM Tris，8M 尿素 ，pH 8.5。
[0088] 凝膠過濾層析所采用的洗脫液：由溶劑和溶質(zhì)組成，溶劑為水，溶質(zhì)及其濃度如 下：50mM醋酸(HAC)、6· 7mg/mL棉籽糖(Raff inose) ;pH值為3-4。
[0089]實(shí)施例1、重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶(Lys-C)的制備與鑒定
[0090]本實(shí)施例將采用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶(Lys-C)，并 對(duì)其進(jìn)行鑒定。
[0091 ] -、表達(dá)重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶(Lys-C)重組大腸桿菌的制備
[0092] 1、賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶(Lys-C)編碼基因的優(yōu)化
[0093]將綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa)來源的Lys-C的編碼基因（GenBank號(hào)： AY062882.1的第73-1389位，GI :17978564)，在不改變野生型賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶的氨基酸序 列（序列2的第169-606位）的前提下，將其密碼子替換為大腸桿菌偏好(高頻使用）的密碼 子。所述優(yōu)化還包括對(duì)賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶的基因序列的其他改造，以適合在大腸桿菌中表 達(dá)，并在優(yōu)化好的序列前加入起始密碼子ATG，最終獲得優(yōu)化后的Lys-C的編碼基因序列如 序列表中序列1的第502-1818位所示。
[0094] 2、重組表達(dá)載體的構(gòu)建
[0095] 將pET-32a( + )載體的EcoR I和Xho I識(shí)別位點(diǎn)（識(shí)別序列）間的DNA序列替換為序 列表中序列1的第502-1818位所示的DNA序列，保持其它DNA序列不變，得到重組表達(dá)載體 pET-32a( + )-Lys-C。并進(jìn)一步經(jīng)DNA測(cè)序驗(yàn)證表明載體構(gòu)建正確。
[0096] 重組表達(dá)載體pET-32a( + )-Lys-C，其編碼的蛋白序列（序列2)除Lys-C酶原的完整 序列以外，還包括了N端的載體TRX標(biāo)簽序列，C端的6xHis序列等。表達(dá)蛋白的完整分子量 (理論）為64888.53Da。如果第一個(gè)甲硫氨酸在表達(dá)后去除，其完整分子量（理論）為 64757.33Da〇 [0097] 3、化學(xué)轉(zhuǎn)化
[0098]通過化學(xué)轉(zhuǎn)化法，將步驟2構(gòu)建的pET-32a( + )-Lys-C導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)感受 態(tài)細(xì)胞中，得到含有重組Lys-C基因的重組菌株，將該菌株命名為重組大腸桿菌BL21-Lys-C (下文中簡(jiǎn)稱BL21_Lys_C菌株）。
[0099]二、重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶(Lys-C)的制備 [0100] 1、BL21-Lys-C菌株的發(fā)酵與包含體收集及初步鑒定
[0101] 將步驟一制備的BL21-Lys-C菌株在固體LB/Amp平板上活化，獲得BL21-Lys-C菌株 的單克隆。將單克隆接種于50mL LB液體培養(yǎng)基中（卡那霉素的濃度為100yg/mL)，37°C搖床 震蕩培養(yǎng)。當(dāng)LB液體培養(yǎng)體系的OD600為1.5-2.0時(shí)（以LB液體培養(yǎng)基為空白對(duì)照），得到一級(jí) 種子。將一級(jí)種子單獨(dú)接種到經(jīng)121°C濕熱法高壓滅菌的裝有2.5L高密度發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基 5L發(fā)酵罐(Applikon Biotechnology公司）中，接種后的培養(yǎng)體系的0D6QQ為0 · 01 (以高密度 發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基為空白對(duì)照）。初始發(fā)酵參數(shù):培養(yǎng)溫度為37 °C，攪拌速度為400rpm，空氣流 量為6L/min，pH值為7.0。發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值通過30 %氨水(體積百分比濃度)控制。當(dāng)溶氧 (D0)(相對(duì)溶氧量)〈15%時(shí)與轉(zhuǎn)速聯(lián)動(dòng)，最高轉(zhuǎn)速1200rpm。當(dāng)初始發(fā)酵體系的0D 6Q()>31(以 高密度發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基為空白對(duì)照）時(shí)，獲得菌株發(fā)酵液1。向菌株發(fā)酵液1中補(bǔ)料，補(bǔ)料速 度控制在16-18mL/h，降低溫度至32°C，并加 IPTG至終濃度為ImM，誘導(dǎo)培養(yǎng)9h。誘導(dǎo)培養(yǎng)參 數(shù)為:培養(yǎng)溫度為32°C，攪拌速度為400rpm，空氣流量為6L/min，pH值為7.0，發(fā)酵培養(yǎng)基的 pH值通過30%氨水（體積百分比濃度）控制。溶氧量和轉(zhuǎn)速控制同上，培養(yǎng)至發(fā)酵體系的 OD6〇Q為100,得到發(fā)酵液2。
[0102] 采用水平轉(zhuǎn)子對(duì)BL21-LyS-C菌株的發(fā)酵液2在4000rpm條件下離心30min收集菌 體，得到BL21 -Ly s-C菌株。在菌體中按照1 g: 1 OmL (w/v)的比例加入濃度為1 OmM的PBS緩沖 液，用高速組織剪切機(jī)混合均勻，并采用高壓勻漿法破碎。高壓勻漿壓力設(shè)定800bar，連續(xù) 破碎3次后采用水平轉(zhuǎn)子在4000rpm條件下離心30min，獲得BL21-Lys-C菌株的包含體(記為 包含體1)，共70g。用roS+2M尿素對(duì)包含體1進(jìn)行洗滌并離心收集包含體(記為包含體2)，共 48g〇
[0103] 大腸桿菌發(fā)酵的生長(zhǎng)曲線如圖1中A所示。對(duì)BL21-Lys-C菌株的誘導(dǎo)后的全菌蛋 白、上清和包含體進(jìn)行15%SDS-PAGE電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖1中B所示。BL21-Lys-C菌株在誘導(dǎo) 后的全菌蛋白和洗滌后的包含體中含有大小約為65kD的目的蛋白。電泳結(jié)果顯示誘導(dǎo)的目 的蛋白主要以包含體形式表達(dá)(圖1中B)。
[0104]本發(fā)明的發(fā)明人進(jìn)一步對(duì)包含體用8M尿素溶解后進(jìn)行質(zhì)譜分析。結(jié)果顯示分子量 為64758.44Da(圖1中C)，該分子量與步驟一2中分析的Lys-C蛋白的理論分子量大小相符。 [0105] 2、包含體蛋白變性
[0106] 將包含體按照1:40 (質(zhì)量體積比，g/ml)的比例溶解到變性緩沖液中并室溫(25 °C) 變性3-4小時(shí)，13000rpm離心收集上清液，即為變性后的樣品。
[0107] 3、蛋白復(fù)性
[0108] 將上述步驟2獲得的變性后的樣品按照1:20(體積比）的比例加入到復(fù)性緩沖液 中，25 °C復(fù)性過夜（14小時(shí)）中，即得復(fù)性后的樣品。
[0109] 4、蛋白激活
[0110] 按照如下進(jìn)行蛋白激活條件的優(yōu)化：
[0111] 將步驟3獲得的復(fù)性后的樣品分別調(diào)pH值為:9.5、8.5、8.0、7.5、7.0、6.5、5.5,并 將不同pH值樣品分別置于25°C激活6小時(shí)，并對(duì)激活樣品進(jìn)行SDS電泳分析（圖2中A)。將步 驟3獲得的復(fù)性后的樣品調(diào)pH值為7.5并將樣品分別置于25°C激活6小時(shí)，每隔1小時(shí)取樣并 對(duì)激活樣品進(jìn)行SDS電泳分析(圖2中B)。
[0112] 由圖2可見，在pH 7.0-8.0之間時(shí)，在分子量約28KD位置，有一個(gè)明顯的條帶產(chǎn)生， 證明蛋白已經(jīng)被成功激活。
[0113] 5、激活蛋白的純化
[0114] (1)硫酸銨沉淀及重懸
[0115] 硫酸銨沉淀，具體操作如下：①向在pH 7.0條件下激活的蛋白樣品中加入固體硫 酸銨至60 %飽和濃度并4 °C攪拌直至硫酸銨完全溶解，冰上沉淀蛋白4小時(shí)。②4000rpm離心 30min并收集沉淀蛋白。
[0116] 重懸:將沉淀蛋白樣品用重懸緩沖液(配方:溶劑為水，溶質(zhì)及濃度為20mM Tris， 150mM NaCl，pH 7.5)溶解后并12000印111離心3〇111；[11，收集上清蛋白。
[0117] (2)金屬離子親和層析純化
[0118] 將步驟（1)重懸后所得上清蛋白進(jìn)行金屬離子親和層析純化，層析介質(zhì)為 Chelating FF(也可以以Chelating HP(GE)替代），層析柱體積為5mL。親和層析的具體操作 如下：
[0119] 平衡:先用平衡液平衡親和層析柱5個(gè)柱體積，使得流出液的基線平穩(wěn)。
[0120] 上洋:將步驟(1)所得上清蛋白直接上樣。
[0121] 洗脫:上樣結(jié)束后用平衡液平衡5個(gè)柱體積，再按照如下洗脫程序進(jìn)行洗脫:①用 平衡液與洗脫緩沖液的混合液進(jìn)行咪唑線性洗脫，共洗脫5個(gè)柱體積，在這5個(gè)柱體積內(nèi)，洗 脫緩沖液在混合液中的體積含量由〇 %線性變化至2 %，即咪唑在洗脫液中的濃度由0M線性 升至0.01M。②用平衡液與洗脫緩沖液的混合液進(jìn)行咪唑線性洗脫，共洗脫10個(gè)柱體積，在 這10個(gè)柱體積內(nèi)，洗脫緩沖液在混合液中的體積含量由2%線性變化至100%，即咪唑在洗 脫液中的濃度由0.01M線性升至0.5M。收集洗脫峰，并進(jìn)行SDS電泳檢測(cè)。
[0122] 親和層析的色譜圖如圖3中A所示。SDS電泳結(jié)果如圖3中C所示，在約28KD的位置上 出現(xiàn)目的條帶。
[0123] (3)親和洗脫樣品的超濾濃縮
[0124] 將步驟(2)收集的經(jīng)SDS-PAGE鑒定產(chǎn)生約28KD目的條帶的洗脫峰用超濾稀釋緩沖 液稀釋一倍并進(jìn)行超濾濃縮，超濾管為Merck-Millipore公司的10kDa Centrifugal Filter Unit〇
[0125] 超濾后的樣品進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果如圖3中C所示，在約28KD的位置上出現(xiàn)目的條 帶，且雜帶明顯減少。
[0126] (4)凝膠層析純化
[0127] 將步驟(3)所得超濾濃縮后樣品通過凝膠過濾層析進(jìn)行最終純化，所用層析柱為 XK 16X40column柱高：33mm，GE Healthcare,USA"，層析介質(zhì)為Sephacryl? S-100。具體操 作如下：
[0128] 平衡：用平衡緩沖液（溶劑為水，溶質(zhì)及濃度如下：50mM HAC，6.7mg/mL Raffinose)，平衡2個(gè)柱體積。
[0129] 上洋:將步驟(3)所得超濾濃縮后樣品直接上樣，上樣量為2mL。
[0130] 洗脫：用洗脫液進(jìn)行洗脫，基于體積進(jìn)行連續(xù)收集，每個(gè)收集組分為2mL，流速為 3mL/min，并對(duì)收集組分進(jìn)行電泳分析，對(duì)電泳純度較好的組分進(jìn)行合并并進(jìn)行后續(xù)活性分 析。
[0131] 樣品的凝膠過濾層析圖譜如圖3中B所示，將所收集的洗脫峰進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果 如圖3中C所示(其中，分子篩峰1為圖3中B的凝膠層析色譜峰的30-45mL組分，分子篩主峰為 圖3中B的凝膠層析色譜峰的45-55mL對(duì)應(yīng)組分，即虛線部分），在約28KD的位置上出現(xiàn)目的 條帶，已經(jīng)基本沒有任何雜帶產(chǎn)生。
[0132] 基于圖3中色譜圖和電泳結(jié)果表明，在虛線標(biāo)注的色譜峰之前的蛋白峰，除了含有 目的蛋白外，在低分子量部分含有大量的降解條帶，這個(gè)結(jié)果表明，蛋白降解產(chǎn)物可能有非 常強(qiáng)的相互作用。
[0133] 另外，有圖3中C所示的將復(fù)性激活但未經(jīng)硫酸銨沉淀的蛋白樣品、經(jīng)硫酸銨沉淀 復(fù)溶后的蛋白樣品、以及經(jīng)不同純化方法獲得的蛋白樣品一同進(jìn)行SDS凝膠電泳檢測(cè)的結(jié) 果，可見:經(jīng)過激活后(未經(jīng)硫酸銨沉淀）的蛋白是一個(gè)混合物，在分子量約28kD處有一個(gè)明 顯條帶;經(jīng)過硫酸銨沉淀和親和純化后，蛋白純度沒有明顯提高，但蛋白得到有效濃縮;經(jīng) 過進(jìn)一步的超濾濃縮和凝膠過濾層析，蛋白純度有明顯提高，在分子量約28kD處有一條主 要條帶產(chǎn)生而且有一條約18kD的蛋白產(chǎn)生。該結(jié)果與Lee S.Engel，1998(Protease IV，a Unique Extracellular Protease and Virulence Factor from Pseudomonas aeruginosa,the journal of biological chemistry，1998)的報(bào)道--致。這進(jìn)--步說明 18kD的蛋白不是雜蛋白，而可能是Lys-C蛋白的降解產(chǎn)物。
[0134] 三、重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶(Lys-C)的質(zhì)譜鑒定
[0135] 對(duì)凝膠過濾層析后獲得的蛋白純品進(jìn)行LC-MS/MS分析。結(jié)果如圖3中D所示，經(jīng)凝 膠過濾層析獲得的蛋白純品的實(shí)際測(cè)量分子量為27431.28kD，與理論分子量27431.1 lkD相 符。該結(jié)果進(jìn)一步證明，Lys-C蛋白表達(dá)完全正確。
[0136] 四、重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶(Lys-C)回收率計(jì)算
[0137] 根據(jù)純化各步驟以及對(duì)圖3中C的電泳結(jié)果進(jìn)行灰度值掃描定量，計(jì)算Lys-C蛋白 整體回收率，如表1所示?？梢?，基于該高密度大腸桿菌發(fā)酵體系，Lys-C蛋白的最終蛋白回 收率約為36.61mg/L，即每1L發(fā)酵體系中可獲得36.61mg的Lys-C蛋白純品。
[0138] 表1 Lys-C蛋白整體回收率
[0139]
[0140] 實(shí)施例2、重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶(Lys-c)的活性測(cè)定
[0141] -、制備大腸桿菌全蛋白
[0142] 將大腸桿菌BL21(DE3)(Novagen，Germany)PBS重懸后進(jìn)行超聲破碎并離心獲得菌 體總蛋白，并按照1:9的比例用預(yù)冷丙酮進(jìn)行蛋白沉淀，然后用重懸緩沖液(配方：溶劑為 水;溶質(zhì)及濃度為50mM NH4HC03和8M的尿素)進(jìn)行重懸，蛋白濃度為4mg/ml。加入DTT至終濃 度20mM，并37°C變性45min，將樣品冷卻至常溫后加入碘化乙酰胺至終濃度40mM并黑暗中進(jìn) 行烷基化，烷基化時(shí)間為30min。烷基化結(jié)束后，用10kD超濾管換液以去除DTT和碘化乙酰 胺。采用緩沖液(配方:溶劑為水;溶質(zhì)及濃度為50mM NH4HC03和不同濃度的尿素)對(duì)其進(jìn)行 稀釋，得到4份大腸桿菌全蛋白樣品，使4份大腸桿菌全蛋白樣品中蛋白濃度均為lmg/ml， NH4HC03濃度均為50mM，尿素濃度分別為2M、4M、6M、8M，備用。
[0143] 二、利用重組Lys-C蛋白酶切大腸桿菌全蛋白樣品
[0144] 利用實(shí)施例1制備的重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶(Lys-C)純品酶切步驟一制得的大腸 桿菌全蛋白樣品。具體進(jìn)行了如下實(shí)驗(yàn)：
[0145] 1.將實(shí)施例1制備的重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶(Lys-C)純品按照1:20(質(zhì)量比）的比 例加入到步驟一制得的酵母全蛋白樣品（尿素濃度分別為21、41、611、81〇中，37°(：酶切4小 時(shí)，酶切結(jié)束后進(jìn)行SDS電泳檢測(cè)。
[0146] 結(jié)果如圖4中A所示。基于電泳結(jié)果，該蛋白酶在2-8M尿素條件下均實(shí)現(xiàn)對(duì)大腸桿 菌全蛋白的完全酶切。
[0147] 2.將實(shí)施例1制備的重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶(Lys-c)純品按照1: (50-1000)(質(zhì)量 比）的比例加入到步驟一制得的大腸桿菌全蛋白樣品(尿素濃度為2M)中，37°C酶切過夜（14 小時(shí)），酶切結(jié)束后進(jìn)行SDS電泳檢測(cè)。
[0148] 結(jié)果如圖4中B所示?；陔娪窘Y(jié)果，在進(jìn)行分析的酶切條件中，大腸桿菌的全蛋白 均被完全酶切，只有在1:1000條件下，有少量蛋白蛋白殘留。
[0149] 3.將實(shí)施例1制備的重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶(Lys-C)純品按照1:50(質(zhì)量比）的比 例加入到步驟一制得的大腸桿菌全蛋白樣品（尿素濃度為2M)中，37°C酶切過夜（14小時(shí)）， 體系中酵母全蛋白的總量為2yg。酶切結(jié)束后，將溶液酶切樣品進(jìn)行真空干燥后進(jìn)行 C18z ip-tip脫鹽用于質(zhì)譜分析。
[0150] C18zip-tip脫鹽柱的預(yù)處理與脫鹽
[0151] 1)脫鹽柱處理：向脫鹽柱中加入20yL甲醇，靜置2-3mins，用注射器將甲醇?jí)撼?，?意不要壓太干;繼續(xù)加入20yL buffer B(配方:溶劑為水，溶質(zhì)及濃度如下:80%ACN，0.5% 乙酸，19.5 % ddH20，％表示體積百分含量），靜置2-3mins，用注射器將甲醇?jí)撼觯⒁獠灰?壓太干；
[0152] 2)加入20yL buffer A(配方溶劑為水，溶質(zhì)及濃度如下：98%ddH20，l%CAN，l% TFA，％表示體積百分含量），靜置2-3mins用注射器將甲醇?jí)撼觯⒁獠灰獕禾?重復(fù)上述 平衡步驟1_2次；
[0153] 3)向3中已干燥樣品中加入10yL buffer A，輕彈渦旋已充分溶解樣品，離心 (6000rpm，5mins);將樣品加到已平衡好的Ziptip柱子中，輕彈，將液體輕甩至柱底部，保留 裝過樣品的PCR管；用注射器分別將樣品壓至相應(yīng)的樣品PCR管中，瞬離樣品至管底部；
[0154] 4)重復(fù)上述3步驟，最后將樣品分別壓入新的PCR管中（記為Ft);
[0155] 5)平衡：向脫鹽柱中加入20yL buffer A，輕彈，將液體輕甩至柱底部，輕彈，將液 體輕甩至柱底部，將樣品分別壓入新的PCR管中（記為Wash);
[0156] 6)洗脫：用裝有ddH20的洗瓶沖洗脫鹽柱的外壁；向脫鹽柱中加入20yL buffer B， 用注射器將樣品分別壓入新的PCR管中；重復(fù)該步驟1次，分別將脫鹽柱的液體壓入相對(duì)應(yīng) 的PCR管中，（記為Et);
[0157] (注意:所有試驗(yàn)中PCR樣品管樣品全部保留，將所有Ft，Wash，Et樣品全部離心，真 空冷凍干燥;將蒸干的Ft，Wash及脫鹽柱于冰箱冷凍保存。）
[0158] 7)向標(biāo)記有Et的樣品中加入4yL質(zhì)譜上樣Loading buffer，輕彈充分溶解樣品，離 心，取3yL用于質(zhì)譜檢測(cè)。
[0159] 4.酶切樣品的質(zhì)譜分析
[0160] 質(zhì)譜型號(hào)與參數(shù)：液相系統(tǒng)UPLC system(nanoAcquity Ultra Performance LC, Waters);色譜柱（5μηι i.d.X15cm fused-silica capillary column,Cisresins, 100 ??；3μ m);流速0 · 3yL/min;質(zhì)譜系統(tǒng)Orbitrap mass spectrometer(Thermo Scientific , San 了〇86^，1^4)。質(zhì)量范圍：300-1600,01^1廿&?質(zhì)量分析其的分辨率為30000，選擇離子豐度 在前20的離子在LTQ(線性離子肼）中進(jìn)行CID(碰撞誘導(dǎo)碎裂)碎裂。每一次掃描，在25ms時(shí) 間內(nèi)積累的最大離子數(shù)為5000。母離子離子的動(dòng)態(tài)排除時(shí)間為30s。
[0161] 對(duì)獲得質(zhì)譜數(shù)據(jù)利用MaxQuant (v 1.5.3.8)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
[0162] 質(zhì)譜結(jié)果見圖4中C和表2。結(jié)果表明，在鑒定的肽段中，以賴氨酸為C端肽段所占比 例為全部肽段的96%以上。說明本發(fā)明實(shí)施例1制備的重組Lys-C蛋白的酶切特異性非常 高。可以用來進(jìn)行蛋白組學(xué)的樣品制備。
[0163] 表2基于大腸桿菌全蛋白檢測(cè)重組蛋白酶的特異性
[0164]
[0165] 對(duì)比例1 .Lys-C優(yōu)化基因的構(gòu)建與表達(dá)方式對(duì)照試驗(yàn)1
[0166] 將實(shí)施例1中優(yōu)化后的Lys-C基因序列(序列1的第502-1818位)替換為優(yōu)化前序列 (GenBank號(hào):AY062882.1的第73-1389位），其余操作均同實(shí)施例1和2。結(jié)果證實(shí)本對(duì)比例蛋 白的復(fù)性收效率非常低，幾乎無法拿到有活性的Lys-C蛋白酶。
[0167] 對(duì)比例2. Lys-C優(yōu)化基因的構(gòu)建與表達(dá)方式對(duì)照試驗(yàn)2
[0168] 將實(shí)施例1中優(yōu)化后的Lys-C基因序列（序列1的第502-1818位)采用實(shí)施例1相同 的酶切位點(diǎn)連接到pET-30a( + )中，其余操作均同實(shí)施例1和2。結(jié)果證實(shí)本對(duì)比例蛋白表達(dá) 量很低，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)無法看到明顯的蛋白表達(dá)，表達(dá)蛋白可以復(fù)性，但回收效率特別 低。分析其原因可能在于：pET-32a( + )載體的N端存在TRX標(biāo)簽序列，其與序列1的第502-1818位融合后表達(dá)的重組蛋白才能取得實(shí)施例中令人滿意的效果，本對(duì)比例中目的蛋白的 回收效果不甚理想正是由于pET-30a( + )載體缺少TRX標(biāo)簽序列所致。
[0169] 對(duì)比例3. Lys-C優(yōu)化基因的構(gòu)建與表達(dá)方式對(duì)照試驗(yàn)3
[0170] 將實(shí)施例1中優(yōu)化后的Lys-C基因序列(序列1的第502-1818位）中編碼成熟蛋白的 序列（序列1的第1068-1818位)采用實(shí)施例1相同的酶切位點(diǎn)連接到pET-32a( + )中，其余操 作均同實(shí)施例1和2。結(jié)果證實(shí)本對(duì)比例蛋白表達(dá)量與實(shí)施例相當(dāng)，但是表達(dá)蛋白無法復(fù)性。 [0171 ]對(duì)比例4. Lys-C優(yōu)化基因的構(gòu)建與表達(dá)方式對(duì)照試驗(yàn)4
[0172] 將實(shí)施例1中優(yōu)化后的Lys-C基因序列（序列1)采用實(shí)施例1相同的酶切位點(diǎn)連接 到Pgex-4T-l載體中，其余操作均同實(shí)施例1和2。結(jié)果證實(shí)本對(duì)比例蛋白表達(dá)量適中，表達(dá) 蛋白可以復(fù)性，但激活過程中蛋白降解速度快于實(shí)施例，同等條件下無法獲得激活蛋白。
[0173] 對(duì)比例5.不同復(fù)性方法的對(duì)照試驗(yàn)
[0174] 變性樣品的制備及之前的所有步驟同實(shí)施例1。將變性樣品平均分成兩份，按照1: 40(體積比）的比例分別加入到本發(fā)明實(shí)施例1中的復(fù)性緩沖液(記為①)和對(duì)照復(fù)性緩沖液 (記為②）中，4°C復(fù)性過夜（14小時(shí)），即得復(fù)性樣品。將復(fù)性樣品調(diào)pH值為7.5,置于25°C激 活5小時(shí)，取樣并進(jìn)行電泳分析(具體方法參見實(shí)施例1)。
[0175] 復(fù)性緩沖液①:20mM Tris，lmM胱氨酸，3mM半胱氨酸，2M尿素 ，pH 9.5;
[0176] 對(duì)照復(fù)性緩沖液②:20mM Tris，10mM CaCl2,2M尿素，0.05%SDS，pH 7.5。
[0177] 結(jié)果顯示:4°C條件下復(fù)性后激活條件①激活，但效果不及實(shí)施例中25°C條件下的 復(fù)性效果;而條件②未激活。
[0178] 對(duì)比例6.不同純化方法的對(duì)照試驗(yàn)1
[0179] 復(fù)性后的樣品的制備及之前的所有步驟同實(shí)施例1。將復(fù)性后的樣品平均分為兩 份A、B。其中A樣品直接調(diào)pH值為7.5，B份稀釋4倍后調(diào)pH值為7.5。將兩份樣品分別置于25°C 激活5小時(shí)。
[0180] 分別取激活樣品置于_20°C凍存過夜（14h)，然后參照實(shí)施例1進(jìn)行硫酸銨沉淀和 重懸，獲得上清蛋白。將所得上清蛋白脫鹽至緩沖液（溶劑為水，溶質(zhì)及濃度如下：50mM HAC，6.7mg/ml Raffinose)或緩沖液2(溶劑為水，溶質(zhì)及濃度如下：lmM HC1)中然后進(jìn)行電 泳分析，然后對(duì)大腸桿菌全蛋白的切割活性驗(yàn)證(具體方法參見實(shí)施例2)。
[0181] 結(jié)果顯示:A/B兩份樣品在激活后的蛋白是混合物，在分子量約28kD處有一個(gè)明顯 條帶;但經(jīng)-20°C凍融后純度均明顯提高，在銨鹽沉淀復(fù)溶以及脫鹽后樣品A的純度再次提 高且酶切大腸桿菌全蛋白有活性，但B樣品卻純度下降且混合雜質(zhì)特別多。該對(duì)比例說明， 凍融和銨鹽沉淀能夠起到蛋白濃縮和提高純度的作用，但是復(fù)性樣品稀釋后凍融對(duì)蛋白的 激活和純度提高幫助不大。
[0182] 對(duì)比例7.不同純化方法的對(duì)照試驗(yàn)2
[0183] 蛋白復(fù)性、硫酸銨沉淀和重懸，以及之前的所有步驟同實(shí)施例1，經(jīng)硫酸銨沉淀和 重懸后獲得上清蛋白。
[0184] 將所得上清蛋白進(jìn)行親和層析純化(層析柱體積5ml)。親和層析的具體操作:先用 平衡液(bufTerA:20mMhepes，0.3MNaCl，pH7.5)平衡親和層析柱5個(gè)柱體積，使基線平 穩(wěn);將以上所得上清蛋白直接上樣，體積為20ml;上樣結(jié)束后用平衡液平衡5個(gè)柱體積后，再 按照如下洗脫程序進(jìn)行洗脫:①用平衡液與洗脫緩沖液的混合液進(jìn)行咪唑線性洗脫，共洗 脫5個(gè)柱體積，在這5個(gè)柱體積內(nèi)，洗脫緩沖液在混合液中的體積含量由0 %線性變化至2 %， 即咪唑在洗脫液中的濃度由〇M線性升至〇. 01M。②用平衡液與洗脫緩沖液的混合液進(jìn)行咪 唑線性洗脫，共洗脫10個(gè)柱體積，在這10個(gè)柱體積內(nèi)，洗脫緩沖液在混合液中的體積含量由 2%線性變化至100%，即咪唑在洗脫液中的濃度由0.01M線性升至0.5M。③用洗脫緩沖液洗 脫3個(gè)柱體積。收集洗脫峰取樣并進(jìn)行電泳檢測(cè)(具體操作參見實(shí)施例1)。其中，洗脫緩沖液 的溶劑為水，溶質(zhì)及濃度如下:20mM h印es，0.3M NaCl，0.5M咪唑;pH 7.5。
[0185] 結(jié)果顯示:在經(jīng)親和層析后得到相對(duì)純度較高的激活蛋白。但蛋白回收率很低，說 明激活Lys-C蛋白的穩(wěn)定性較差，在蛋白純化過程中降解明顯。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種制備重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶的方法，包括如下步驟： (1) 向受體大腸桿菌細(xì)胞中導(dǎo)入氨基酸序列如序列表中序列2所示的重組賴氨酰肽鏈 內(nèi)肽酶的編碼基因，得到重組大腸桿菌細(xì)胞； (2) 對(duì)所述重組大腸桿菌細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)后，收集所述重組大腸桿菌細(xì)胞;破碎所述 重組大腸桿菌細(xì)胞，得到包含體； (3) 對(duì)所述包含體進(jìn)行變性，得到變性后的樣品； (4) 將所述變性后的樣品進(jìn)行復(fù)性，得到復(fù)性后的樣品； (5) 將所述復(fù)性后的樣品進(jìn)行激活，得到有活性的重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶粗品； (6) 對(duì)所述重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶粗品進(jìn)行純化，得到純化后的重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽 酶； 在步驟(4)中，所述復(fù)性在復(fù)性緩沖液中進(jìn)行，所述復(fù)性緩沖液的pH值為9.0-10.0,所 述復(fù)性緩沖液由溶劑和溶質(zhì)組成，所述溶劑為水，所述溶質(zhì)為三羥甲基氨基甲烷、胱氨酸、 半胱氨酸和尿素;所述三羥甲基氨基甲烷在所述復(fù)性緩沖液中的濃度為5-50mM，所述胱氨 酸在所述復(fù)性緩沖液中的濃度為〇.5-2mM，所述半胱氨酸在所述復(fù)性緩沖液中的濃度為3-5mM，所述尿素在所述復(fù)性緩沖液中的濃度為0.4-2M; 在步驟(5)中，所述激活為將所述復(fù)性后的樣品調(diào)pH值為5.5-9.5,于25°C靜置1-6小 時(shí)； 在步驟(6)中，所述純化為將所述重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶粗品依次進(jìn)行硫酸銨沉淀、金 屬離子親和層析、超濾濃縮和凝膠過濾層析； 所述金屬離子親和層析采用的層析介質(zhì)為金屬螯合高流速瓊脂糖微球或者金屬螯合 高分辨瓊脂糖微球;所述凝膠過濾層析采用的層析介質(zhì)為丙烯葡萄糖凝膠S-100。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶的編碼基因是 如下a)或b)或c)的核酸分子： a) 其編碼序列如序列表中序列1所示的DNA分子； b) 其編碼序列是將序列表中序列1中的T均替換為U，其它核苷酸不變得到的RNA分子； c) 在嚴(yán)格條件下與a)限定的DNA分子雜交且編碼序列表中序列2所示的重組賴氨酰肽 鏈內(nèi)肽酶的DNA分子。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述金屬離子親和層析的洗脫程序如 下：1)用平衡液與洗脫緩沖液的混合液進(jìn)行咪唑線性洗脫，共洗脫5個(gè)柱體積，在所述5個(gè)柱 體積內(nèi)，咪唑在所述混合液中的濃度由OM線性升至0.0IM; 2)用所述平衡液與所述洗脫緩沖 液的混合液進(jìn)行咪唑線性洗脫，共洗脫10個(gè)柱體積，在所述10個(gè)柱體積內(nèi)，咪唑在所述混合 液中的濃度由0.0IM線性升至0.5M; 所述平衡液由溶劑和溶質(zhì)組成，所述溶劑為水，所述溶質(zhì)為三羥甲基氨基甲烷和NaCl， 所述三羥甲基氨基甲烷在所述平衡液中的濃度為20mM Tris，所述NaCl在所述平衡液中的 濃度為2M，所述平衡液的pH值為7.5; 所述洗脫緩沖液由溶劑和溶質(zhì)組成，所述溶劑為水，所述溶質(zhì)為三羥甲基氨基甲烷、 NaCl和咪唑，所述三羥甲基氨基甲烷在所述洗脫緩沖液中的濃度為20mM Tri s，所述NaCl在 所述洗脫緩沖液中的濃度為2M，所述咪唑在所述洗脫緩沖液中的濃度為0.5M咪唑，所述洗 脫緩沖液的pH值為7.5。4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于:所述凝膠過濾層析所用層析柱的 柱長(zhǎng)度和柱內(nèi)直徑比為165:8;所述凝膠過濾層析所采用的洗脫液的pH值為3-4,所述洗脫 液由溶劑和溶質(zhì)組成，所述溶劑為水，所述溶質(zhì)為醋酸和棉籽糖，所述醋酸在所述洗脫液中 的濃度為50mM，所述棉籽糖在所述洗脫液中的濃度為6.7mg/mL。5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于:所述硫酸銨沉淀的步驟為：1)在 所述激活后的樣品中加入固體硫酸銨至60%飽和濃度，4°C攪拌直至硫酸銨完全溶解，沉淀 蛋白4小時(shí);2)離心收集沉淀蛋白；和/或 所述超濾濃縮為采用截留分子量為IOkD的超濾濃縮;和/或 在步驟(2)中，對(duì)所述重組大腸桿菌細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)為向培養(yǎng)有所述重組大腸桿菌 的培養(yǎng)體系中加入IPTG至其終濃度為0.5-1.5mM，32 °C誘導(dǎo)9小時(shí)。6. 利用權(quán)利要求1-5中任一所述的方法制備得到的重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶。7. 成套試劑或試劑盒，其特征在于： 所述成套試劑為用于制備重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶的成套試劑，由權(quán)利要求1-5任一中 所述的復(fù)性緩沖液、權(quán)利要求1-5任一中進(jìn)行所述金屬離子親和層析時(shí)采用的所述平衡液 和所述洗脫緩沖液、權(quán)利要求1-5任一中進(jìn)行所述凝膠過濾層析時(shí)采用的所述洗脫液組成； 所述試劑盒為用于制備重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶的試劑盒，含有所述成套試劑，以及如 下中全部或部分:大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞、能夠表達(dá)氨基酸序列如序列表中序列2所示的重組 賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶的原核表達(dá)載體、IPTG、金屬螯合高流速瓊脂糖微球或者金屬螯合高分 辨瓊脂糖微球、丙烯葡萄糖凝膠S-100。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒中還含有記載有權(quán)利要求1-5中任一所述方法的可讀性載體。9. 下述生物材料中的任一種： (al)序列表中序列2所不的蛋白質(zhì)； (a2)序列表中序列1所示的DNA分子； (a3)將序列表中序列1中的T均替換為U，其它核苷酸不變得到的RNA分子； (a4)含有序列表中序列1所示的DNA分子的表達(dá)盒、重組載體、重組微生物、重組病毒、 轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物細(xì)胞系。10. 下述應(yīng)用中的任一種： I) 權(quán)利要求1-5中任一所述的方法在制備重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶中的應(yīng)用； II) 權(quán)利要求7所述的成套試劑在制備重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶中的應(yīng)用； III) 權(quán)利要求7或8所述的試劑盒在制備重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶中的應(yīng)用； IV) 權(quán)利要求9所述生物材料在制備重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/57GK105950593SQ201610319892
【公開日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年5月13日
【發(fā)明人】趙明治, 徐平, 吳飛林, 常蕾
【申請(qǐng)人】中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所