一種熱穩(wěn)定的脂肪酶及制備方法與應用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種熱穩(wěn)定的脂肪酶及制備方法與應用。該脂肪酶為氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的S2?210脂肪酶、氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的S8?214脂肪酶、氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的S14?216脂肪酶或氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的S191?241脂肪酶。本發(fā)明通過長時間的高溫分子動力學模擬模擬耶氏解脂酵母脂肪酶2的解折疊過程，分析了蛋白解折疊的主要區(qū)域和濕熔球態(tài)形成的關(guān)鍵步驟，有效的篩選出動力學穩(wěn)定性改造的關(guān)鍵位點。該熱穩(wěn)定的脂肪酶耐熱，半衰期長，特別適合在工業(yè)上進行應用。
【專利說明】
一種熱穩(wěn)定的脂肪酶及制備方法與應用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于酶工程領(lǐng)域，特別涉及一種熱穩(wěn)定的脂肪酶及制備方法與應用。
【背景技術(shù)】
[0002] 脂肪酶(EC 3.1.1.3)全稱三酰甘油水解酶，被廣泛應用于飼料工業(yè)、食品加工、化 妝品、洗滌劑、生物醫(yī)學和生物能源等方面。
[0003] 耶氏解脂假絲酵母(Yarrowia lipolytica)是一種非常規(guī)酵母，屬于食品安全型 酵母，目前通過連續(xù)基因干擾分析，，已發(fā)現(xiàn)其能編碼16種脂肪酶Lip2、Lip4、Lip5、Lip7~ 19。這些脂肪酶同源性大小不一，且性質(zhì)差異較大。其中，耶氏解脂酵母脂肪酶2(Lip2)是主 要的胞外分泌脂肪酶，其對中長鏈脂肪酸甘油三酯(C12~C16)具有較高的催化活性，被廣 泛應用于油脂水解、污水處理、食品加工、生物能源、化學合成以及胰腺缺乏癥的治療等多 個領(lǐng)域，具有廣泛的應用前景，但當環(huán)境溫度超過40°C時，該脂肪酶迅速失活，在生產(chǎn)加工、 儲存、運輸?shù)冗^程中造成較大的損失，成為其在工業(yè)上應用的主要瓶頸。因此，有必要對耶 氏解脂酵母脂肪酶2改造，提高其熱穩(wěn)定性，以拓寬其應用范圍。
[0004] 在天然蛋白結(jié)構(gòu)中引入新的二硫鍵是改造蛋白熱穩(wěn)定性的一種重要方法，被廣泛 應用于各類蛋白的改造，特別是在藥物儲存和工業(yè)應用改造領(lǐng)域。隨著預測二硫鍵算法的 不斷發(fā)展，其中應用較為廣泛的是DbD和M0DIP算法，通過對C e和SY原子進行定位，快速搜索 并精確地估算X3二面角，篩選符合條件的二硫鍵。這兩種算法都是基于靜態(tài)晶體結(jié)構(gòu)的計 算，對二硫鍵的預測具有高準確性，并且已經(jīng)成功的應用于米黑根毛霉脂肪酶、南極假絲酵 母脂肪酶B、華根霉脂肪酶和銅綠假單胞菌脂肪酶等多種脂肪酶的熱穩(wěn)定性設計，但是對篩 選熱穩(wěn)定型二硫鍵的準確度仍然十分有限。
[0005] 目前對蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性改造主要分為定向進化、半理性設計和理性設計，其中定 向進化和半理性設計需要大量的人力物力，而理性設計需要對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能有全面的 理解。目前理性設計主要根據(jù)蛋白質(zhì)的晶體靜態(tài)結(jié)構(gòu)的計算，目前主要利用一下2類篩選方 法：
[0006] (1)基于蛋白質(zhì)柔性區(qū)域的設計，如B-FITTER、FIRST、分子動力學模擬篩選波動較 大的區(qū)域。
[0007] (2)基于經(jīng)驗力場對蛋白熱力學自由能進行計算，篩選蛋白質(zhì)熱力學穩(wěn)定的突變 位點，如F0LDX力場等。
[0008] 以上均沒有深刻理解蛋白質(zhì)解折疊動力學過程，亦無涉及蛋白質(zhì)動力學穩(wěn)定性的 設計。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，利用分子動力學模擬篩選出 脂肪酶解折疊和濕熔球態(tài)形成的關(guān)鍵區(qū)域，并分析濕熔球態(tài)的形成，有針對性地引入二硫 鍵突變，抑制蛋白濕恪球態(tài)和共價聚沉的形成，提尚熱穩(wěn)定型^?硫鍵篩選的精確性，并提供 一種熱穩(wěn)定的脂肪酶。
[0010] 本發(fā)明的另一目的在于提供所述熱穩(wěn)定的脂肪酶的制備方法。
[0011] 本發(fā)明的再一目的在于提供所述熱穩(wěn)定的脂肪酶的應用。
[0012] 本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn):一種熱穩(wěn)定的脂肪酶，是在耶氏解脂假絲 酵母脂肪酶2的解折疊和濕熔球態(tài)形成的關(guān)鍵區(qū)域引入二硫鍵突變；
[0013] 所述的關(guān)鍵區(qū)域為耶氏解脂假絲酵母脂肪酶2的第180位~280位氨基酸序列。
[0014] 所述熱穩(wěn)定的脂肪酶優(yōu)選為S2-210脂肪酶、S8-214脂肪酶、S14-216脂肪酶或 S191-241脂肪酶；
[0015] S2-210脂肪酶的氨基酸序列如下：
[0017] S8-214脂肪酶的氨基酸序列如下：
[0019] S14-216脂肪酶的氨基酸序列如下：
[0021] S191-241脂肪酶的氨基酸序列如下：
[0023]編碼所述熱穩(wěn)定的脂肪酶的核苷酸序列，如下所示：
[0024] S2-210脂肪酶的核苷酸序列如下：

[0026] S8-214脂肪酶的核苷酸序列如下：
[0028] S14-216脂肪酶的核苷酸序列如下：
[0030] S191-241脂肪酶的核苷酸序列如下：
[0032]所述熱穩(wěn)定的脂肪酶的制備方法，包括如下步驟：
[0033] (1)通過Gromacs分子動力學軟件模擬耶氏解脂酵母脂肪酶2的解折疊過程，通過 對所得軌跡的波動性分析與蛋白表面水分子的統(tǒng)計，分析出脂肪酶解折疊和濕熔球態(tài)形成 的關(guān)鍵區(qū)域，并進一步對β折疊尾巴區(qū)域分區(qū)，分析濕熔球態(tài)形成的步驟，最后使用 Disulfide byDesign軟件算法篩選潛在二硫鍵突變位點；
[0034] (2)通過反向PCR突變，將所選出的氨基酸位點突變?yōu)榘腚装彼幔⑥D(zhuǎn)入大腸桿菌 工程菌中，進行擴增培養(yǎng)與質(zhì)粒提取、測序；
[0035] (3)將測序正確的突變質(zhì)粒以Pmel限制性內(nèi)切酶線性化處理，并電擊轉(zhuǎn)化入感受 態(tài)畢赤酵母X33中，進一步通過博來霉素抗性平板篩選和BMMY-羅丹明B產(chǎn)酶平板篩選，得到 對應的突變工程菌；
[0036] (4)將突變工程菌在YH)液體培養(yǎng)基中進行擴繁培養(yǎng)后轉(zhuǎn)接至BMGY液體培養(yǎng)基進 行去抑制培養(yǎng)，最后接種BMMY液體培養(yǎng)基進行發(fā)酵，將菌液離心獲取上清粗酶液
[0037] (5)使用超濾管將粗酶液進行超濾濃縮后，使用鎳柱一步法純化，分離出帶組氨酸 標簽的脂肪酶蛋白，并以還原性SDS-PAGE檢測蛋白純度，獲取純化后的脂肪酶；
[0038] (6)通過DTNB法測定蛋白質(zhì)中的游離巰基濃度和總巰基濃度，計算蛋白分子內(nèi)的 二硫鍵數(shù)目，檢測引入的二硫鍵突變是否成鍵；
[0039] (7)通過p-NPP比色法和DSF熒光檢測測定突變脂肪酶的熱穩(wěn)定性指標:保溫15min 后殘余50%活性的溫度(T5Q)、5(TC下的半衰期（t1/2)、最適反應溫度(T Qpt)以及蛋白熔解溫 度(Tm);
[0040] (8)通過不同尿素誘導解折疊測定濕熔球態(tài)的形成所需要的濃度，確定突變脂肪 酶動力學穩(wěn)定性大小；
[0041 ] (9)將突變脂肪酶在50°C下保溫不同的時間，以非還原性SDS-PAGE檢測突變脂肪 酶的抗聚沉能力大小，得到熱穩(wěn)定的脂肪酶。
[0042] 步驟（1)中所述的脂肪酶解折疊和濕熔球態(tài)形成的關(guān)鍵區(qū)域為耶氏解脂假絲酵母 脂肪酶2的第180位~280位氨基酸序列，即β折疊尾巴區(qū)域。
[0043] 步驟（1)中所述的濕熔球態(tài)形成的步驟包括初級步驟和關(guān)鍵步驟；耶氏解脂假絲 酵母脂肪酶2底部無規(guī)卷曲1〇〇ρ4(氨基酸207位至221位）與Ν端區(qū)域(氨基酸1位至13位）的 解離是濕熔球態(tài)形成的初級步驟，1〇〇ρ3結(jié)構(gòu)(氨基酸228位至246位）的解離是濕熔球態(tài)形 成的關(guān)鍵步驟。
[0044] 步驟(1)中所述的解折疊的區(qū)域優(yōu)選為β折疊尾巴區(qū)域(氨基酸180位至280位）。
[0045] 步驟(2)中所述的大腸桿菌工程菌優(yōu)選為大腸桿菌Τ0Ρ10。
[0046] 步驟(4)中所述的培養(yǎng)的條件優(yōu)選為搖瓶培養(yǎng)96小時。
[0047] 所述熱穩(wěn)定型脂肪酶耐熱，半衰期長，特別適合在工業(yè)上進行應用。
[0048] 本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果：
[0049] 本發(fā)明利用生物信息學對蛋白質(zhì)改造屬于理性設計的方法。該方法相對于傳統(tǒng)的 非理性改造方法而言，能節(jié)約大量的人力物力，但需要對蛋白質(zhì)分子進行全面的分析，方能 找篩選出有效的改造點。
[0050] 本發(fā)明通過長時間的高溫分子動力學模擬篩選出耶氏解脂酵母脂肪酶2解折疊和 濕熔球態(tài)形成的關(guān)鍵區(qū)域，并分析濕熔球態(tài)的形成，關(guān)注蛋白質(zhì)在動力學過程中的變化，有 針對性地引入二硫鍵突變，大大提高熱穩(wěn)定型二硫鍵篩選的準確性。
[0051] 1)本發(fā)明通過在脂肪酶底部無規(guī)卷曲1〇〇ρ4(氨基酸207位至221位)與Ν端區(qū)域(氨 基酸1位至13位)之間引入二硫鍵，加強了底部無規(guī)卷曲1 〇〇ρ4與Ν端的聯(lián)系，穩(wěn)定了 β折疊尾 部區(qū)域(氨基酸180位至280位)的穩(wěn)定，相對于親本脂肪酶，S2-210、S8-214、S14-216突變體 脂肪酶的T m值分別提升了 10.48 °C、7.50 °C和5.67 °C，50 °C半衰期分別達到198、43.87、 17.24 分鐘，分別提升了 120、26.58、10.44 倍；
[0052] 2)本發(fā)明通過在脂肪酶β7、β8折疊之間的無規(guī)卷曲1〇〇ρ3(氨基酸228-246位)與β6 折疊和α5螺旋間的無規(guī)卷曲（氨基酸188位至氨基酸198位)之間引入的二硫鍵突變，相對于 親本脂肪酶，S191-241突變體脂肪酶的1?值提升了5.63°C，50°C半衰期達到14.87分鐘，提 升了 9倍。
[0053]以上所述的二硫鍵突變均有效地抑制了蛋白解折疊、減緩濕熔球態(tài)的形成，并減 少了脂肪酶之間的共價聚沉反應。
【附圖說明】
[0054] 圖1是不同溫度下氨基酸的均方根漲幅曲線圖。
[0055] 圖2是熔球態(tài)形成區(qū)域分析圖；其中：圖a為蓋子1區(qū)域、β折疊尾巴區(qū)域、財斤疊頭部 區(qū)域4 Α范圍內(nèi)水分子數(shù)量隨時間的變化曲線；圖b為β折疊尾巴區(qū)域的4個亞區(qū)4 Α范圍內(nèi) 的水分子數(shù)量隨時間變化曲線。
[0056]圖3是β折置尾巴區(qū)域解折置波動曲線圖；其中，圖a為06、07、08、09折置的均方根 波動隨模擬時間的變化曲線，圖b為1〇〇ρ2、1〇〇ρ3、1〇〇ρ4的均方根波動隨模擬時間的變化曲 線。
[0057] 圖4是BMMY-羅丹明B產(chǎn)酶平板篩選圖；其中，A-F分別為1^?2、38-214、32-210、314- 216、S191-241、S4-266在紫外光下脂肪酶的水解光圈。
[0058]圖5是還原性SDS-PAGE檢測蛋白純度的結(jié)果圖；其中：泳道1-7分別為1^?2、52_ 210、8-214、514-216、5191-241、5198-242、54-266突變脂肪酶的蛋白條帶。
[0059] 圖6是尿素誘導解折疊 bis-ANS熒光曲線圖。
[0060] 圖7是非還原性SDS-PAGE蛋白檢測的結(jié)果圖；其中：圖&、13、(：、(1、6分別代表1^2、 52-210、58-214、514-216、5191-241在50°(：下熱處理不同時間。
【具體實施方式】
[0061] 下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限 于此。
[0062] 材料與試劑:pPICZaA_Lip2畢赤酵母表達載體由上海金斯瑞生物公司全基因合成 與構(gòu)建;質(zhì)粒提取試劑盒購自Omega貿(mào)易有限公司，K0D-PLUS突變試劑盒購自東洋紡公司， ProteinThermal Shift篩選試劑盒購自Thermo公司；T0P10大腸桿菌感受態(tài)細胞購自天根 生物公司，突變引物由上海生工生物工程公司合成；Pmel限制性內(nèi)切酶購自New England Biolabs公司；PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒購自大連寶生物公司；電轉(zhuǎn)儀購自Bio-Rad公司； 0^、1^^+26〇(^11、￥?0、81?^、81?^培養(yǎng)基均按照1鮮1杜(^611畢赤酵母表達試劑盒操作手冊 配制，鎳柱純化試劑盒購自上海生工生物工程公司，其余試劑均為國內(nèi)外購買的分析純級 別。
[0063] 實施例1耶氏解脂酵母脂肪酶2的解折疊模型建立與二硫鍵的篩選。
[0064] (1)從RCSB PDB晶體數(shù)據(jù)庫中搜索下載Lip2的晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID:300D)，精度為 1.7 A，晶體為七聚體，每個聚體各有不同程度的原子缺失，因此選取骨架原子完整的A鏈作 為初始模型，使用Swiss-pdb Viewer軟件對A鏈缺失的側(cè)鏈氨基酸進行修復，并使用 Disulfide byDesign軟件，將A鏈中Cysl20_Cysl23二硫鍵重構(gòu)，在模擬中保留A鏈的所有結(jié) 晶水，除了三聯(lián)體中心的HIS289使用HID質(zhì)子化狀態(tài)，其余組氨酸均設置為Gromacs默認下 pH=7.00的質(zhì)子化狀態(tài)，得到預處理模型；
[0065] (2)使用6如1^03 5.04軟件對預處理模型進行三維建模，使用4!1^6"€9938-匪1?- ILDN力場的參數(shù)，將蛋白放置于十二面體的菱形盒子中央并填充TIP3P水分子與10個Na+中 和的體系電荷，并以Steepest算法對整個體系進行能量優(yōu)化。隨后在等溫等壓體系(NPT)體 系下，限制蛋白骨架重原子的運動，在500ps內(nèi)緩慢地從0K升溫至303K，充分平衡酶周圍的 水分子，體系的溫度和壓力偶聯(lián)使用Berendsen算法，得到預平衡模型；
[0066] (3)將預平衡模型在2ns內(nèi)從303K緩慢地升溫至目標溫度，然后在等溫等壓體系 (NPT)下進行模擬。范德華力截斷半徑、靜電相互作用力截斷半徑、鄰近搜索截斷半徑均根 據(jù)AMBER力場推薦，設置為0.9nm。所有的鍵長采用LINCS算法約束，長程靜電相互作用力采 用PME算法，計算步長設置為2f s;
[0067] (4)對分子模擬所得軌跡進行分析：
[0068] 1)通過波動性分析解折疊的關(guān)鍵區(qū)域:通過Gromacs自帶的分析工具gmx_rmsf計 算C。原子的均方根漲幅隨解折疊進程的變化，分析骨架氨基酸均方根漲幅曲線，結(jié)果如圖1 所示，在450K溫度下底部環(huán)形區(qū)1〇〇ρ4(氨基酸207位至221位)浮動最大，該區(qū)域為容易運動 的結(jié)構(gòu);在473K溫度下N端(氨基酸1位至13位)和底部環(huán)形區(qū)1 〇〇ρ4(氨基酸207位至221位） 的均方根漲幅大幅增加，該區(qū)域可能是脂肪酶發(fā)生初步解折疊的區(qū)域;在500K溫度下脂肪 酶整體的均方根漲幅顯著提升，主要集中在β折疊頭部區(qū)域(氨基酸30位至90位）、β折疊尾 巴區(qū)域、蓋子1區(qū)域(氨基酸91位至130位）。
[0069] 2)分析濕熔球態(tài)形成的關(guān)鍵區(qū)域:根據(jù)波動性分析的結(jié)果，針對Lip2脂肪酶主要 的三個波動區(qū)域進行熔球態(tài)形成分析，通過在VMD中統(tǒng)計氨基酸4A范圍內(nèi)的水分子數(shù)目隨 解折疊進程的變化，分析熔球態(tài)形成的關(guān)鍵區(qū)域和位點。結(jié)果如圖2所示，水分子進入Lip2 脂肪酶的主要區(qū)域為β折疊尾巴區(qū)域。并且通過進一步將β折疊尾巴區(qū)域分為4個亞區(qū)進行 水分子數(shù)目統(tǒng)計，其中亞區(qū)1(氨基酸251位至279號)包含蓋子2鉸鏈區(qū)、β9折疊;亞區(qū)2(氨基 酸221位至250號）包含β7、8折疊和之間的無規(guī)卷曲1οορ3;亞區(qū)3(氨基酸194位至220號）包 括底部環(huán)形區(qū)1〇〇ρ4與α5螺旋;亞區(qū)4(氨基酸180位至193號)包含β6折疊與α5螺旋間的無規(guī) 卷曲，結(jié)果顯示亞區(qū)2周圍的水分子數(shù)目在解折疊過程中增長最為明顯，是濕熔球態(tài)形成的 主要區(qū)域。
[0070] 3)分析濕恪球態(tài)形成的過程:通過Gromacs自帶的分析工具gmx_rmsf計算β折疊尾 巴區(qū)域中每段結(jié)構(gòu)的Ca原子RMSD隨時間的變化曲線，以分析熔球態(tài)形成的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)的波動 與步驟。結(jié)果如圖3所示，在濕恪球態(tài)形成的時間區(qū)間內(nèi)1οορ3、1οορ4、β7和β8折疊的RMSD急 劇上升，暗示著這些區(qū)域的運動與恪球態(tài)形成直接相關(guān)，并且β9折疊與1οορ4的運動發(fā)生在 早期，可能是熔球態(tài)形成的誘因，但β6折疊在解折疊運動中所受影響不大。
[0071]綜上所述方法分析出脂肪酶在熱變性的過程中解折疊和濕熔球態(tài)形成的關(guān)鍵區(qū) 域為β折疊尾巴區(qū)域，其中濕熔球態(tài)的形成可分為2個步驟，初級步驟為脂肪酶的底部無規(guī) 卷曲1〇〇ρ4(氨基酸207位至221位)與Ν端區(qū)域(氨基酸1位至13位)的解離，關(guān)鍵步驟為β7、β8 折疊之間的無規(guī)卷曲區(qū)域(氨基酸228位至246位)結(jié)構(gòu)的解離。
[0072] (7)通過Disulfide by Design軟件篩選存在于底部無規(guī)卷曲1οορ4(氨基酸207位 至221位)與Ν端區(qū)域(氨基酸1位至13位）、β7折疊至β8折疊之間的無規(guī)卷曲1〇〇ρ3區(qū)域(氨基 酸228位至246位)與周圍之間的所有二硫鍵潛在位點。篩選結(jié)果顯示，篩選出六對潛在的二 硫鍵位點，分別為 32-210、58-214、514-216、5191-241、5198-242、54-266。具體信息如表1所 不。
[0073] 表1二硫鍵篩選位點
[0075]其中，6段氨基酸序列如下所示：

[0088] 編碼上述序列的脂肪酶的核苷酸序列，如下所示：
[0089] S2-210：
[0090]


[0101 ]實施例2脂肪酶突變體表達質(zhì)粒的構(gòu)建
[0102] 以耶氏解脂酵母脂肪酶2序列（Genbank ID:AJ012632.1)為目的片段，以EcoRI與 Notl為限制性酶切位點，全基因合成并構(gòu)建pPICZaA-Lip2,通過兩次連續(xù)的反向突變PCR方 法引入二硫鍵突變，點突變所用引物如表2所示。
[0103] 表2突變引物匯總
[0106] 注:斜線加粗處為突變位點
[0107] PCR 擴增條件為：941€2111丨11;94°(：1〇8、661€3〇8、68 1€51^11，10個循環(huán)。反應體系如下 表3所示。
[0108] 表3 PCR反應體系
[0110]擴增產(chǎn)物以Dnpl酶消化模板，在瓊脂糖凝膠電泳檢測突變條帶大小后，用T4連接 酶連接環(huán)化過夜，隨后使用熱激法將突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)入T0P10大腸桿菌感受態(tài)細胞，并涂布于 LLB+Ze〇Cin(Ze〇Cin濃度為25μg/ml)平板37°C過夜培養(yǎng)，挑選陽性轉(zhuǎn)化子進行質(zhì)粒的測序。
[0111] 實施例3:線性化質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化畢赤酵母、轉(zhuǎn)化子篩選與產(chǎn)酶篩選
[0112] 將測序正確的陽性轉(zhuǎn)化子于LLB液體培養(yǎng)基過夜擴培后，提取質(zhì)粒，以Pmel線性化 處理并純化回收，以總量為5yg的質(zhì)粒線性化產(chǎn)物與X33畢赤酵母感受態(tài)混合電擊轉(zhuǎn)化。畢 赤酵母感受態(tài)制備參照Invitrogen公司操作手冊。電轉(zhuǎn)程序按照Bio-Rad公司推薦參數(shù)設 置。
[0113] 電轉(zhuǎn)完畢立刻加入lmL lmol/L山梨醇溶液，將菌液在30°C孵育復蘇1小時后，均勻 涂布于￥?03+26〇〇;[11(2600;[11濃度為20(^8/1111)抗性平板上篩選 ;培養(yǎng)3天后，將生長出的單 菌落挑取至BMMY-羅丹明B平板上進行產(chǎn)酶篩選，每12小時添加100yL甲醇誘導;誘導3天后 觀察脂肪酶水解圈，篩選出正常產(chǎn)酶的基因工程菌。如圖4所示，所有的突變體脂肪酶均產(chǎn) 生了油脂水解圈，二硫鍵的引入沒有影響工程菌的產(chǎn)酶。
[0114] 實施例4:工程菌搖床發(fā)酵
[0115]參考Invitrogen公司畢赤酵母表達試劑盒操作手冊并稍作修改，修改內(nèi)容如下： 把工程菌株單菌落接種到2mL YPDS-Zeocin(Zeocin濃度為200yg/mL)液體培養(yǎng)基中進行純 化培養(yǎng)過夜，離心將細胞以BMGY液體培養(yǎng)基重懸并過夜培養(yǎng)，再接種至30mL BMMY液體培養(yǎng) 基，以25°C、300r/min培養(yǎng)96小時，每天補充甲醇至終濃度為1 %。
[0116] 實施例5:脂肪酶的分離和純化
[0117] 1)超濾濃縮
[0118] 將100mL發(fā)酵液于4°C5000r/min離心5分鐘后吸取上清液并用10kDa超濾管于 5000r/min 4°C離心50min，收集濃縮酶液。
[0119] 2) -步法鎳柱純化
[0120] ①用5mL的含咪唑10mM的Binding Buffer平衡鎳柱，充分除去殘留的乙醇；
[0121 ] ②濃縮酶液與含咪唑120mM的Binding Buffer按照1:1比例混合后添加至鎳柱中 結(jié)合；
[0122] ③用15mL含咪唑60mM的Washing buffer充分洗脫雜蛋白；
[0123] ④用15mL含咪唑300mM的Elution Buffer洗脫目標蛋白；
[0124] ⑤純化酶液按照上述條件超濾濃縮；
[0125] 得到純化的突變脂肪酶，最后以還原性SDS-PAGE垂直電泳檢測酶純度，純度均在 99%以上，結(jié)果如圖5所示。
[0126] 實施例6:二硫鍵測定
[0127] 1)將純化蛋白樣品以含8M尿素的Tris-Gly緩沖液(50mM，pH=8 · 00)稀釋至0 · 5mg/ mL?；旌暇鶆蚝?，分裝2mL至兩支4mL離心管中，A管用于測定游離巰基的濃度，B管用于測定 總半胱氨酸含量，并在B管中加入50μ?3-巰基乙醇還原分子內(nèi)的二硫鍵，于37 °C保溫1小時。
[0128] 2)在B管中加入2mL 30%(w/v)三氯乙酸溶液，37°C水浴1小時，充分沉淀蛋白，隨 后以12000r/min離心30min，棄上清，沉淀使用2mL 30%三氯乙酸溶液重懸潤洗并再次離 心，晾干5min，揮發(fā)殘余的β-巰基乙醇。最后用2mL含8M尿素的Tris-Gly緩沖液（50mM，pH = 8.00)重新溶解沉淀。每管吸取lmL做為空白組，并在剩余反應液中加入10yL DTNB(4mg/mL) 顯色。孵育30min后以12000r/min離心10min，除去沉淀，吸取上清，并稀釋一定的倍數(shù)，于 412nm測定吸光值，保證其吸光值在0.2-0.8之間。二硫鍵數(shù)量由以下公式計算：
[0129] SH=73.53XA4i2XD/V----------------(公式 1)
[0130] SH3 = SH1-SH2----------------(公式 2)
[0131] SS = N/2X(SH3/SH1)----------------(公式 3)
[0132] 其中SH為巰基濃度(ymol/mL)，SH3為成鍵半胱氨酸巰基濃度(ymol/mL)，SH2為游 離半胱氨酸疏基濃度(μπιο 1 /mL)，SH1為總半胱氨酸疏基濃度(μπιο 1 /mL)，A4i2為除去空白樣 品后的吸光光度值，D為稀釋倍數(shù)，V為溶液體積(mL)，SS為蛋白質(zhì)內(nèi)部二硫鍵的數(shù)目。
[0133] 經(jīng)過二硫鍵測定，結(jié)果如表4所示，除S198-242突變脂肪酶未形成二硫鍵，其余新 引入的二硫鍵均正確成鍵。
[0134] 表4二硫鍵數(shù)目測定
[0136] 實施例7:脂肪酶突變體的熱穩(wěn)定性與催化性質(zhì)的測定。
[0137] 利用熒光定量PCR儀，按照Protein Thermal Shift試劑盒推薦反應程序測定突變 脂肪酶的1值，結(jié)果如表5所示，除了 S4-266突變脂肪酶，其余引入的二硫鍵均大幅度提升 了脂肪酶的Tm，引入的^硫鍵屬于熱穩(wěn)定型^硫鍵，基于解折置t吳型設計^?硫鍵大大提升 了設計的成功率。
[0138] 表5 DSF測定結(jié)果
[0140] T5Q測定方法：以0.1mg/mL的純化蛋白溶液在PCR儀中精確保溫15min，以50mM含 40mM的p-NPP的Tris-Hcl緩沖液為反應體系(pH=7.50)，精確反應lOmin后，添加20%(w/v) 的三氯乙酸終止反應5min，在20 % (w/v)的碳酸鈉溶液顯色，測定41 Onm處吸光值，計算不同 溫度保溫后，脂肪酶殘余的相對酶活。
[0141 ] t1/2測定方法：以0. lmg/mL的純化蛋白溶液在PCR儀中50 °C精確保溫0、5、10、15、 30、45、60min，以50mM含40mM的p-NPP的Tris-Hcl緩沖液為反應體系（pH= 7.50)，精確反應 10min后，添加20% (w/v)的三氯乙酸終止反應，20% (w/v)碳酸鈉溶液顯色，測定410nm處吸 光值，計算不同溫度保溫后，脂肪酶殘余的相對酶活。
[0142] 最適反應溫度測定方法:將0.1mg/mL的純化蛋白溶液加入在30、35、40、45、50、55 °C條件下預熱的50mM含40mM的p-NPP的Tris-Hcl緩沖液(pH = 7.50)，精確反應10min后，添 加20% (w/v)的三氯乙酸終止反應，20% (w/v)碳酸鈉溶液顯色，測定410nm處吸光值，計算 不同溫度下脂肪酶的相對酶活。以上結(jié)果如表6所示：
[0143] 表6熱穩(wěn)定性測定結(jié)果
[0146] 可見，S2-210、S8-214、S14-216和S191-241突變脂肪酶的熱穩(wěn)定性均顯著地提高， 其中S2-210在50°C下具有較長的半衰期，并且除S191-241突變脂肪酶外，其余突變脂肪酶 的最適反應溫度均提升至40°C。
[0147] 實施例8:尿素解折疊檢測濕熔球態(tài)的形成。
[0148] 將O.lmg/mL純化蛋白溶液與含0、0·25、0·5、0·75、1、1·5、2、2·5、3、4、5、6Μ 尿素的 Tris-Hcl緩沖液(50mM，ρΗ = 7.50)均勻混合，常溫下靜止12個小時，使體系充分平衡后，加 入bis-ANS熒光劑（終濃度為50μΜ)，常溫結(jié)合1小時后，加入酶標板，在350nm波長激發(fā)，以 492nm波長采集熒光信號，以熒光信號強度對尿素濃度作圖。結(jié)果如圖6所示，所有突變脂肪 酶需要更高的尿素濃度方能完全進入濕熔球態(tài)，其中S2-210突變脂肪酶進入濕熔球態(tài)所需 要的尿素濃度最高，為2.5M，在脂肪酶底部無規(guī)卷曲1 〇〇ρ4(氨基酸207位至221位)與N端區(qū) 域(氨基酸1位至13位)之間引入二硫鍵突變，均抑制了濕熔球態(tài)的形成。并且S191-241突變 脂肪酶的熒光峰值顯著低于其他突變脂肪酶，二硫鍵顯著抑制了濕熔球態(tài)進一步地形成， 證實β7、β8折疊之間的無規(guī)卷曲區(qū)域1 〇〇ρ3(氨基酸228位至246位）的解離的為濕熔球態(tài)形 成的關(guān)鍵步驟，與分子模擬結(jié)果一致。
[0149] 實施例9:非還原性SDS-PAGE檢測脂肪酶共價聚沉
[0150] 將50yL 0.5mg/mL純化蛋白溶液在PCR儀上50°C精確保溫5、10、15、30、45、60min。 以非還原性SDS-PAGE電泳檢測脂肪酶的共價聚沉。結(jié)果如圖7所示，Lip2脂肪酶在50°C處理 5min后，發(fā)生了嚴重聚沉，共價聚體分子量集中在75kDa、1 lOkDa和140kDa左右，隨著熱處理 的時間增加，單體與二聚體均向更高聚體的轉(zhuǎn)變。在引入二硫鍵突變后，所有的突變脂肪酶 的共價聚沉均受到了抑制，其中32-210、38-214、314-216、3191-241突變脂肪酶的聚沉抗性 依次遞減，其中S2-210、S8-214突變脂肪酶的低聚聚沉主要發(fā)生在10~15min的熱處理期 間，隨后以高聚體聚沉為主。S14-216突變脂肪酶、S191-241突變脂肪酶和Lip2脂肪酶的低 聚聚沉主要發(fā)生在熱處理的前5min內(nèi)，并且S191-241二硫鍵對1οορ3結(jié)構(gòu)的限制并沒有完 全抑制共價聚沉，因此的折疊與1οορ4的解離是Cys244游離半胱氨酸暴露的關(guān)鍵原因。
[0151] 上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種熱穩(wěn)定的脂肪酶，其特征在于:是在耶氏解脂假絲酵母脂肪酶2的解折疊和濕熔 球態(tài)形成的關(guān)鍵區(qū)域引入二硫鍵突變； 所述的關(guān)鍵區(qū)域為耶氏解脂假絲酵母脂肪酶2的第180位~280位氨基酸序列。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述熱穩(wěn)定的脂肪酶，其特征在于:所述熱穩(wěn)定的脂肪酶為S2-210脂 肪酶、S8-214脂肪酶、S14-216脂肪酶或S191-241脂肪酶； S2-210脂肪酶的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示； S8-214脂肪酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示； S14-216脂肪酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示； S191-241脂肪酶的氨基酸序列如SEQIDN0.4所示。3. 編碼權(quán)利要求2所述熱穩(wěn)定的脂肪酶的核苷酸序列，其特征在于： 所述的S2-210脂肪酶的編碼核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示； 所述的S8-214脂肪酶的編碼核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示； 所述的S14-216脂肪酶的編碼核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示； 所述的S191-241脂肪酶的編碼核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。4. 權(quán)利要求1所述熱穩(wěn)定的脂肪酶的制備方法，其特征在于包括如下步驟： (1) 通過Gromacs分子動力學軟件模擬耶氏解脂酵母脂肪酶2的解折疊過程，通過對所 得軌跡的波動性分析與蛋白表面水分子的統(tǒng)計，分析出脂肪酶解折疊和濕熔球態(tài)形成的關(guān) 鍵區(qū)域，并進一步對β折疊尾巴區(qū)域分區(qū)，分析濕熔球態(tài)形成的步驟，最后使用Disulfide by Design軟件算法篩選潛在二硫鍵突變位點； (2) 通過反向PCR突變，將所選出的氨基酸位點突變?yōu)榘腚装彼?，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌工程 菌中，進行擴增培養(yǎng)與質(zhì)粒提取、測序； (3) 將測序正確的突變質(zhì)粒以Pme I限制性內(nèi)切酶線性化處理，并電擊轉(zhuǎn)化入感受態(tài)畢 赤酵母X33中，進一步通過博來霉素抗性平板篩選和BMMY-羅丹明B產(chǎn)酶平板篩選，得到對應 的突變工程菌； (4) 將突變工程菌在YPD液體培養(yǎng)基中進行擴繁培養(yǎng)后轉(zhuǎn)接至BMGY液體培養(yǎng)基進行去 抑制培養(yǎng)，最后接種BMMY液體培養(yǎng)基進行發(fā)酵，將菌液離心獲取上清粗酶液； (5) 使用超濾管將粗酶液進行超濾濃縮后，使用鎳柱一步法純化，分離出帶組氨酸標簽 的脂肪酶蛋白，并以還原性SDS-PAGE檢測蛋白純度，獲取純化后的脂肪酶； (6) 通過DTNB法測定蛋白質(zhì)中的游離巰基濃度和總巰基濃度，計算蛋白分子內(nèi)的二硫 鍵數(shù)目，檢測引入的二硫鍵突變是否成鍵； (7) 通過p-NPP比色法和DSF熒光檢測測定突變脂肪酶的熱穩(wěn)定性指標:保溫15min后殘 余50%活性的溫度、50°C下的半衰期、最適反應溫度以及蛋白熔解溫度； (8) 通過不同尿素誘導解折疊測定濕熔球態(tài)的形成所需要的濃度，確定突變脂肪酶動 力學穩(wěn)定性大??； (9) 將突變脂肪酶在50°C下保溫不同的時間，以非還原性SDS-PAGE檢測突變脂肪酶的 抗聚沉能力大小，得到熱穩(wěn)定的脂肪酶。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述熱穩(wěn)定的脂肪酶的制備方法，其特征在于：步驟（1)中所述的脂 肪酶解折疊和濕熔球態(tài)形成的關(guān)鍵區(qū)域為耶氏解脂假絲酵母脂肪酶2的第180位~280位氨 基酸序列。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述熱穩(wěn)定的脂肪酶的制備方法，其特征在于：步驟（I)中所述的濕 熔球態(tài)形成的步驟包括初級步驟和關(guān)鍵步驟； 所述的初級步驟為耶氏解脂假絲酵母脂肪酶2第207~221位氨基酸序列與第1~13位 氨基酸序列的解離； 所述的關(guān)鍵步驟是耶氏解脂假絲酵母脂肪酶2第228~246位氨基酸序列的解離。7. 權(quán)利要求1所述的熱穩(wěn)定型脂肪酶在工業(yè)中的應用。
【文檔編號】C12N9/20GK105950585SQ201610279266
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年4月29日
【發(fā)明人】管武太, 吳煒坤, 李力浪
【申請人】華南農(nóng)業(yè)大學