轉SmMYB75基因提高丹參毛狀根中丹酚酸含量的方法
【技術領域】
[00011本發(fā)明涉及基因工程技術，特別涉及一種轉SmMYB75基因提高丹參毛狀根中丹酚 酸含量的方法。
【背景技術】
[0002]心腦血管疾病是目前威脅全人類健康與生命的"頭號殺手"。據(jù)統(tǒng)計，全世界每年 大約有1700萬人死于心腦血管疾病，約占全球總死亡人數(shù)的1/3,我國每年大約有300萬人 死于心腦血管疾病，因此，積極研究高效、低毒和廉價的治療心腦血管疾病的臨床藥物對提 高人類健康水平具有十分深遠的意義。
[0003] 丹參(Salvia miltiorrhiza)，為唇形科(Labiatae)鼠尾草屬多年生草本植株，以 其干燥的根或塊莖入藥，被廣泛地應用于治療心腦血管疾病，是一種傳統(tǒng)的中草藥植株。丹 參的生物活性成分主要分為兩大類:一類為水溶性的酚酸類化合物，主要包括丹酚酸A、丹 酚酸B、丹酚酸C、咖啡酸、迷迭香素、丹參素等；另一類為脂溶性的丹參酮類化合物，主要包 括丹參酮I、丹參酮ΠΑ、隱丹參酮、二氫丹參酮等。
[0004] 丹參中的丹酚酸在預防人類疾病方面發(fā)揮著重要的作用，其生物學活性主要包括 抗氧化、抗凝活性、腎臟功能的調節(jié)、肝臟的保護、心血管的保護、抗癌、抗菌、抗病毒、抗炎 癥等。除此之外，丹酚酸還具有抗缺血再灌注、抗血栓、降血壓和抗纖維化的作用。在中國， 丹參通常被制作為藥劑，如片劑、膠囊、顆粒劑、注射劑、口服液、噴霧、滴丸等，具有極高的 藥用和經(jīng)濟價值。然而，在傳統(tǒng)的栽培模式下，丹參長期栽培時品質退化嚴重、活性成分含 量降低、生長周期長及易受栽培區(qū)域和環(huán)境等制約;在化學合成過程中，丹酚酸的化學合成 過程十分繁瑣，成本較高且易造成環(huán)境污染;在離體條件下通過細胞培養(yǎng)方法獲得的細胞， 其藥用活性成分積累量很低而且穩(wěn)定性很差，遠達不到商業(yè)化開發(fā)利用的要求。因此，為了 緩解具有重要臨床需求的丹酚酸藥源的緊缺性問題，亟待發(fā)明一種提高丹酚酸含量的新方 法，代謝工程的迅速發(fā)展與毛狀根培養(yǎng)技術的日益成熟為提高丹參毛狀根中丹酚酸成分的 含量，解決丹參酮藥源緊缺性問題提供了 一條新思路。
[0005] 已有研究表明，植物中的R2R3-MYB轉錄因子廣泛參與到植物的次生代謝過程，因 此挖掘丹參自身的R2R3-MYB轉錄因子來提高丹酚酸的含量具有重大的意義。利用基因工程 手段，將丹參轉錄因子SmMYB75基因遺傳轉化丹參葉片獲得SmMYB75過表達的轉基因丹參毛 狀根，同時上調丹酚酸的生物合成，獲得丹酚酸高產(chǎn)的丹參毛狀根根系，為商業(yè)化生產(chǎn)丹酚 酸提供新型優(yōu)質藥源。目前尚未發(fā)現(xiàn)通過SmMYB75基因過表達策略提高丹參毛狀根中丹酚 酸含量的相關報道。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明的目的，就是為了克服上述現(xiàn)有技術存在的缺陷，提供一種轉SmMYB75基因 來提高丹參毛狀根中丹酚酸含量的方法。
[0007] 本發(fā)明的目的可以通過以下技術方案來實現(xiàn)：
[0008] 本發(fā)明從丹參中克隆得到645bp的SmMYB75基因，構建原核表達的載體，在大腸桿 菌中表達SmMYB75基因重組蛋白；定量PCR分析其在不同組織和甲基茉莉酸誘導后的基因的 表達量;構建亞細胞定位的載體，瞬時轉化煙草葉片，激光共聚焦顯微鏡觀察定量SmMYB75 基因在細胞中的定位情況;構建植物表達載體，發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1介導遺傳轉化丹參葉片獲 得轉基因的毛狀根;PCR檢測目的基因 SmMYB75的整合情況;定量PCR分析插入基因 SmMYB75 及丹酚酸生物合成相關基因在毛狀根中的表達情況;高效液相色譜測定轉基因毛狀根中丹 酚酸的含量。
[0009] 一種轉SmMYB75基因提高丹參毛狀根中丹酚酸含量的方法，包括以下步驟：
[0010] (1)采用基因克隆方法從丹參中克隆獲得基因 SmMYB75,所述的SmMYB75基因序列 如SEQ ID: 1所示，對其進行序列分析。
[0011] (2)根據(jù)丹參SmMYB75基因序列，把SmMYB75基因可操作性地構建于原核表達的載 體，在大腸桿菌中進行表達，重組蛋白進行SDS-PAGE電泳檢測;所述的載體為pET-30a( + )， 大腸桿菌為菌株R〇setta(DE3)。
[0012] (3)根據(jù)丹參SmMYB75基因序列，設計定量PCR的引物，對SmMYB75在丹參的不同組 織中的表達量及其對甲基茉莉酸調控的誘導表達進行分析。
[0013] ⑷將SmMYB75基因構建于亞細胞定位的載體，轉化根瘤農(nóng)桿菌，進行煙草葉片的 瞬時轉化，對SmMYB75基因進行亞細胞定位分析;所述的載體為pM0N530，根瘤農(nóng)桿菌為菌株 Ase〇
[0014] (5)把SmMYB75基因可操作性地構建于表達調控序列，形成含SmMYB75基因的植物 表達載體;植物表達載體為經(jīng)過改造獲得的PCAMBIA2300+載體，包含CaMV35S啟動子和終止 子、多克隆位點、復制起始點及卡那霉素抗性位點。
[0015] (6)將步驟(5)所得的含SmMYB75基因的植物表達載體轉化發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1，獲得 用于轉化丹參的含SmMYB75基因植物表達載體的發(fā)根農(nóng)桿菌菌株。
[0016] (7)利用步驟(6)所構建的發(fā)根農(nóng)桿菌菌株遺傳轉化丹參葉片，獲得經(jīng)PCR檢測為 陽性的轉基因毛狀根克隆;所述的經(jīng)PCR檢測的陽性轉基因丹參毛狀根是指:設計發(fā)根位點 基因 BrolB的上下游引物和在插入基因 SmMYB75內部及N0S終止子內部設計上游及下游特異 性引物，進行DNA擴增，紫外線下觀察到目的條帶的根系即為陽性轉基因丹參毛狀根根系。
[0017] (8)定量PCR測定步驟(7)獲得的丹參轉基因毛狀根中SmMYB75基因及丹酚酸生物 合成途徑相關基因的相對表達量，并篩選出過表達SmMYB75基因根系中SmMYB75基因的表達 量提高的根系;具體方法為:對PCR鑒定為陽性的毛狀根克隆進行總RNA的提取，統(tǒng)一定量到 〇.5yg RNA，反轉錄成25μ1體系的cDNA，分別設計插入目的基因及看家基因 SmActin的定量 引物，以相同量的cDNA為模板進行定量PCR分析SmMYB75及丹酚酸生物合成相關基因的相對 表達量情況。
[0018] (9)高效液相色譜法測定步驟(8)中丹參轉SmMYB75基因毛狀根中丹酚酸的含量， 篩選丹酚酸含量顯著提高的丹參轉基因毛狀根根系;所述的方法為:色譜柱C-18反相硅膠 柱，流動相為體積比30:70的乙腈和水，并用磷酸調節(jié)pH至2.03;檢測波長281nm，柱溫35°C， 流速lml/min，進樣量20μ1。
[0019] 本發(fā)明綜合應用生物學和基因技術方法如載體構建、遺傳轉化、分子檢測、定量 PCR分析、丹酚酸的提取及含量測定等，發(fā)明了一種利用丹參的R2R3-MYB轉錄因子SmMYB75 基因提高丹參毛狀根中丹酚酸的方法。本發(fā)明獲得的過表達SmMYB75轉基因丹參毛狀根根 系中最高表達量為總丹酚酸含量為167.25mg/g干重，是對照組(73.7mg/g干重）的2.26倍。 本發(fā)明為商業(yè)化大量生產(chǎn)丹酚酸及降低藥品價格提供了可能，也為大量生產(chǎn)丹酚酸臨床藥 物的大量需求提供了重要來源。
[0020] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：
[0021] 1、顯著提高丹參毛狀根中丹酚酸的含量。
[0022] 2、發(fā)明方法效果可靠。
[0023] 3、獲取丹酚酸的成本低。
[0024] 4、生產(chǎn)過程無環(huán)境污染。
【附圖說明】
[0025] 圖 1 為pCAMBIA2300+: :SmMYB75載體構建示意圖。
[0026] 圖2為重組蛋白SmMYB75的SDS-PAGE分析。
[0027] 圖3為丹參SmMYB75的組織表達分析。
[0028] 圖4為丹參SmMYB75在甲基茉莉酸處理下的表達分析。其中，Control為乙醇對照組 誘導，MJ為甲基茉莉酸誘導。
[0029]圖5為SmMYB75的亞細胞定位的分析結果圖。GFP，綠色熒光蛋白；Bright，明場； Merged，綠色熒光蛋白與明場的合并圖；pM0N530: :GFP，空載體熒光表達；pM0N530:: SmMYB75-GFP，SmMYB75的瞬時熒光表達。
[0030]圖6為SmMYB75在轉基因丹參毛狀根中的表達分析結果圖。其中，Control為C58C1 侵染獲得的毛狀根。
[0031]圖7為丹酸酸生物合成相關基因的表達分析結果圖。其中，Empty vector是空載 體。
[0032]圖8為SmMYB75轉基因丹參毛狀根中丹酚酸的含量檢測結果圖。其中，Empty vector是空載體。
【具體實施方式】
[0033]下面結合附圖和具體實施例對本發(fā)明進行詳細說明。圖1為PCAMBIA2300+:: SmMYB75載體構建示意圖。圖2為重組蛋白SmMYB75的SDS-PAGE分析。
[0034] 下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆 (Sambrook等）中所述的條件，或按照制造廠商所提供的試劑或試劑盒所附帶的說明書建議 的條件。
[0035] 實施例1
[0036] 丹參SmMYB75基因的克隆
[0037] 1 · 1 ·丹參總RNA的提取
[0038] 取少量丹參幼嫩葉片，用液氮速凍后，迅速用研缽研碎，然后按照TIANGEN公司提 供的RNAprep Pure Plant Kit使用說明書提取總RNA。用普通瓊脂糖