丹參酮iia衍生物在制備內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)藥物中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及天然藥物領(lǐng)域，主要是丹參酮IIA衍生物通式(I)和通式(II)在制備內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)藥物中的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明丹參酮IIA衍生物通式(I)和通式(II)可以明顯降低H2O2引起的內(nèi)皮細(xì)胞損傷，同時(shí)可以降低H2O2引起的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，機(jī)制研究證明丹參酮IIA衍生物通式(I)和通式(II)是通過激活Nrf2?ARE通路發(fā)揮抗氧化作用。
【專利說明】
丹參酮Μ A衍生物在制備內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)藥物中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬于藥物化學(xué)和藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一類丹參酮IIA衍生物，該類衍生 物為活性成分的藥物組合物，其制備方法以及該類化合物和其他藥物組合物在制備治療內(nèi) 皮細(xì)胞引起疾病的藥物應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 丹參為唇形科鼠尾草植物丹參（Salvia Miltiorrhiza Bunge)的干燥根及根莖， 具有祛瘀止痛、活血調(diào)經(jīng)、養(yǎng)心除煩的功效。丹參在臨床上廣泛用于心血管系統(tǒng)疾病，具有 擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、增加冠脈血流量、改善微循環(huán)、降低心肌耗氧量、防止心肌缺血和心肌梗阻 等作用。
[0003] 丹參含有多種化學(xué)成分，丹參酮IIA是其脂溶性成分中含量最高的化合物，也是其 主要的活性成分之一。丹參酮IIA具有抗癌、抗菌、抗氧化、擴(kuò)張冠脈增加冠脈血流量、改善 心臟功能、抗炎等良好而廣泛的藥理活性。已有研究表明丹參酮IIA可以減輕過氧化氫引起 損傷，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞。但是丹參酮IIA水溶性差，因此制備水溶性好活性高丹參酮IIA衍生物 可以增加其成藥性。
[0004] 血管內(nèi)皮細(xì)胞(Vascular Endothelial Cell，VEC)為襯貼于血管內(nèi)腔面的單層扁 平細(xì)胞，其表面積可達(dá)l〇〇〇m2以上。VEC分泌多種調(diào)節(jié)血管功能的活性物質(zhì)，具有多種生理 功能，參與機(jī)體凝血、免疫、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和生物活性物質(zhì)釋放等生命活動(dòng)。血管內(nèi)皮損傷是多 種心血管疾病的病理基礎(chǔ)。最近已有研究通過干預(yù)治療以恢復(fù)心血管疾病患者的內(nèi)皮功 能，改善預(yù)后，這是對心血管疾病治療的新的嘗試。
[0005] Nrf2-ARE通路是目前最重要的抗氧化通路，對于維持體內(nèi)氧自由基的穩(wěn)態(tài)起關(guān)鍵 性作用，在生理狀態(tài)下Nrf 2-ARE通路處于抑制狀態(tài)，Keapl與Nrf 2蛋白結(jié)合，調(diào)控Nrf2蛋白 的蛋白酶體水解。當(dāng)有外界刺激或體內(nèi)氧自由基增多，Nrf 2蛋白與Keapl蛋白解離進(jìn)入細(xì)胞 核中，Nrf2蛋白與抗氧化原件(antioxidant response element ARE)結(jié)合，調(diào)控下游抗氧 化蛋白的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)缺血性心肌損傷發(fā)生與氧化應(yīng)激關(guān)系密切。因此Nrf2-ARE通路可 能是預(yù)防和治療氧化應(yīng)激引起疾病的重要手段和方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明公布一類的丹參酮IIA衍生物用途，其在制備保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的藥物中 的應(yīng)用。
[0007] 丹參酮IIA衍生物表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化應(yīng)激的作用，他可以降低過氧化氫引起的 內(nèi)皮細(xì)胞損傷，實(shí)驗(yàn)證實(shí)丹參酮IIA抗氧化應(yīng)激作用是通過激活Nrf 2-ARE通路達(dá)到的。
[0008] 1、本發(fā)明提供的丹參酮IIA衍生物，其結(jié)構(gòu)通式如式(I)和式(II)所示：
[0009] 其中:X、Y各自獨(dú)立表示0、N;
[0010] M = 0或 1;
[0011] Ri、R2相同或不同，分別獨(dú)立代表(^_(：5直鏈或支鏈烷基，被0-1個(gè)取代基W取代的 Cl -C5的直連和支鏈烷基，被0-1個(gè)取代基W取代C3-C6的環(huán)烷基，被0-1個(gè)取代基W取代的C3-6 取代的烯基或者取代烯基，被0-1個(gè)取代基W取代的C3-C6烷基取代的炔基以及取代炔基;芳 基、取代芳基、芳雜環(huán)、取代芳雜環(huán);所述W為獨(dú)立選自羥基、氨基、羧基、巰基;或者心和心相 互連接形成的取代或者非取代的3-6元飽和或不飽和的含有1-4個(gè)雜原子的環(huán)狀基團(tuán)，所述 雜原子可獨(dú)立或同時(shí)選自〇、N或S。
[0012] R3表示羥基，d-C5飽和醇，Ci-Cs不飽和醇，Ci-Cs飽和的一級(jí)胺，Ci-Cs不飽和一級(jí) 胺，&-C5飽和的二級(jí)胺或&_(：5不飽和的二級(jí)胺，芳基或取代芳基， 所述的芳基選自含5-14個(gè)原子的芳基官能團(tuán)，包括但不限于苯基、萘基、鹵代苯； 所述的芳雜環(huán)選自含5-14個(gè)原子的芳雜環(huán)官能團(tuán)，包括但不限于P比啶、哌啶、啼啶、咲 喃、吡咯、噻唑、噻吩、噁唑、喹啉、剛噪、吡嗪。
[0013] -種藥物組合物，其中含有權(quán)利要求1化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽及藥學(xué)上可 接受的載體。
[0014] a丹參酮IIA衍生物或其藥學(xué)上可以接受的鹽在制備保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的藥物中的用 途。 b優(yōu)先的用途為在其特征在于:所述心血管疾病是冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、腦出 血或腦血栓。 c丹參酮IIA衍生物或其藥學(xué)上可以接受的鹽在制備抗氧化藥物中的用途，尤其是保護(hù) 血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激時(shí)受到損傷中的用途。 d優(yōu)先的用途為其特征在于:所述保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷是通過調(diào)節(jié)Nrf2- ARE通路進(jìn)行的。
【附圖說明】 圖1是不同濃度(〇μΜ，5μΜ，15μΜ，20μΜ) WL-3化合物作用下Nrf 2-ARE通路下游抗氧化蛋 白H0-1、Nrf 2、GCLC、GCLM的mRNA表達(dá)水平的圖 圖2是不同濃度(ΟμΜ，5μΜ，15μΜ，20μΜ) WL-4化合物作用下Nrf 2-ARE通路下游抗氧化蛋 白H0-1、Nrf 2、GCLC、GCLM的mRNA表達(dá)水平的圖 圖3是不同濃度丹參酮ΙΙΑ( ΟμΜ，5μΜ，15μΜ，20μΜ)作用下Nrf 2-ARE通路下游抗氧化蛋白 H0-1、Nrf 2、GCLC、GCLM 的 mRNA 表達(dá)水平的圖 具體實(shí)施過程
[0015] 實(shí)施例1
[0016] 丹參酮IIA衍生物對EA. hy926細(xì)胞中SOD和MDA含量的影響
[0017] 1.1試驗(yàn)方法:取生長期的EA.hy926細(xì)胞，以2*105接種于50ml細(xì)胞瓶中，培養(yǎng)24小 時(shí)后，吸棄培養(yǎng)液，空白組和損傷組加入新鮮的無血清DMEM高糖培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)。處理組 在此基礎(chǔ)上分別加入濃度為lμg/ml的各種藥物，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，檢測細(xì)胞內(nèi)丙二醛(MDA) 和超氧化物歧化酶(S0D)的含量。
[0018] S0D增加率=(給藥組-模型組)/給藥組* 100 %
[0019] MDA降低率=(模型組-給藥組)/模型組*100%
[0020] 1.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果:如表1所述
[0021] 丹參酮IIA衍生物可以增加 EA. hy926細(xì)胞中S0D的含量同時(shí)減少M(fèi)DA的含量
[0022]


[0023]由表1可以得知，與模型組相比，丹參酮IIA衍生物均表現(xiàn)一定的抗氧化損傷的保 護(hù)作用。
[0024] 實(shí)施例2
[0025] MTT法測試丹參酮IIA衍生物減少H202引起細(xì)胞活力降低。
[0026] 2.1試驗(yàn)方法:EA.Hy926接種于96孔板中，正常培養(yǎng)12h后換無血清DMEM繼續(xù)培養(yǎng) 12h，使細(xì)胞同步化。吸棄原培養(yǎng)液，加入不同濃度的待測化合物預(yù)保護(hù)12h后，換成含 900uMH202的無血清DMEM培養(yǎng)基，每孔100uL，并設(shè)置正常對照組，每組三個(gè)平行復(fù)孔。繼續(xù)培 養(yǎng)2h后，收集上清，三孔富集于一管中，用于后期LDH測定。每孔加入新鮮無血清培養(yǎng)基，并 于每孔加入lOuLMTT，繼續(xù)培養(yǎng)4h，用酶標(biāo)儀在490nm處檢測吸光度值(0D490)。計(jì)算各組細(xì) 胞活力值。
[0027] 2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果:如表2所述
[0028] 丹參酮IIA衍生物對H202引起EA.hy926細(xì)胞活力降低的影響
[0029] 細(xì)胞活力增加值=(給藥組-模型組)/給藥組* 100 %
[0030]

[0031]由表2可以得知，與模型組相比，丹參酮IIA衍生物均表現(xiàn)一定的抗H2〇2引起的內(nèi)皮 細(xì)胞凋亡的作用。
[0032] 實(shí)施例3
[0033] WL-3，WL-4，丹參酮IIA三個(gè)化合物提高Nrf 2-ARE下游抗氧化蛋白H0-1、Nrf2、 GCLC、GCLM 的 mRNA 的表達(dá)。
[0034] A549細(xì)胞的培養(yǎng)與傳代:A549細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100U/ mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，置飽和濕度、37 °C的5 % C02培養(yǎng)孵箱中培養(yǎng)。A549細(xì)胞用含EDTA 的0.25%胰蛋白酶處理后進(jìn)行細(xì)胞的傳代。實(shí)驗(yàn)中平均每兩天傳代一次。具體操作如下:吸 去細(xì)胞培養(yǎng)皿中的舊培養(yǎng)液，用PBS清洗1次，然后加適量胰酶消化l-2min，根據(jù)細(xì)胞的增殖 速度和自己實(shí)驗(yàn)的需要適當(dāng)比例將細(xì)胞傳至新的培養(yǎng)皿中，于37°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0035] 藥物的配制：以2X 105/ml的密度將A549細(xì)胞接種于六孔板中，選擇WL-3、WL-4、丹 參酮IIA配制給藥培養(yǎng)基(含1%血清），每個(gè)樣品做3個(gè)濃度梯度(5μΜ、10μΜ、20μΜ)，由母液 逐級(jí)稀釋，六孔板中每孔加入2mL含藥培養(yǎng)基。給藥12h后提取RNA。
[0036] 細(xì)胞總RNA的提取： a. 取三種藥物處理后的細(xì)胞，倒棄舊培養(yǎng)液，用PBS清洗一遍。6孔板每孔加入1000yL的 RNA isolater，用移液槍反復(fù)吹打至裂解液中無明顯沉淀。將樣品轉(zhuǎn)至1.5mL離心管中，室 溫靜置5min。 b. 加入適量體積(大概1/5體積)氯仿，蓋緊離心管蓋，用力震蕩或渦旋15s混勻液體，4 °C靜置Smirul^jOOg下4°C離心15min(注意此步必須低溫離心，否則產(chǎn)物會(huì)有少量基因組 污染）。小心取出離心管，此時(shí)，勻漿液分為3層，即無色的上清、中間的白色蛋白層和下層紅 色的有機(jī)相，而RNA存在于上清液中。 c. 將上清液轉(zhuǎn)移至新的EP管中，切勿吸到中間的蛋白，向上清液中加入等體積的異丙 醇，上下顛倒混勻，室溫或4 °C靜置10min，4°C下12，000g離心10min。通?？梢钥吹桨咨?淀。 d. 小心棄去上清，加入lmL用DEPC水配制的75%乙醇，上下顛倒洗滌離心管壁，并輕彈 管底，讓沉淀懸浮起來，并靜置3-5min，12，000g4°C離心5min。 e.小心棄去上清液，通風(fēng)櫥干燥，盡量除凈乙醇。
[0037] RNA濃度測定:取2yL的總RNA樣品，測定樣品濃度及在260nm和280nm處的吸光度比 值，判斷樣品純度。A26Q/A28Q值在1.8~2.0之間視為提取的樣品純度合格。新鮮的RNA樣品用 來逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，剩余樣品-80 °C保存。
[0038] cDNA的合成（逆轉(zhuǎn)錄） mRNA的逆轉(zhuǎn)錄按照HiScript? 1st Strand cDNA Synthesis Kit說明書進(jìn)行，反應(yīng)體 系如下表。逆轉(zhuǎn)錄程序?yàn)椋?5°(：，511^11;42°(：，151^11;85°(：，51^11。合成的〇0嫩隨即用于?〇?反 應(yīng)或者-20°C儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?mRNA的逆轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)體系
[0039] Real-Time PCR Roche Real-Time PCR，反應(yīng)體系如下表。 反應(yīng)條件 PCR所用引物序列：

[0040] 提取經(jīng)不同終濃度的活性化合物孵育后的EA. hy926細(xì)胞，獲得完整的RNA，將其反 轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行!10-1、1?2、6(^、6〇^的熒光實(shí)時(shí)定量?〇?。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，11^-3、11^-4、丹參酮 IIA三個(gè)化合物均在不同程度升高!10-1、他€2、6(^(：、6〇^的1111?熟水平。這些結(jié)果說明這些活 性化合物在激活Nrf2-ARE通路后，成功誘導(dǎo)了下游抗氧化蛋白mRNA的表達(dá)。
[0041] WL-3、WL-4、丹參酮 IIA 三個(gè)化合物在 1uM，5uM，10uM 濃度下 H0-l、Nrf2、GCLC、GCLM 的mRNA水平，如說明書附圖1 (WL-3)、說明書附圖2(WL-4)、說明書附圖3(丹參酮IIA)
[0042] WL-3、WL-4、丹參酮IIA三個(gè)化合物可以明顯增加 Nrf2-ARE下游抗氧化蛋白H0-1、 Nrf2、GCLC、GCLM的mRNA水平，說明三個(gè)化合物是通過Nrf 2-ARE通路發(fā)揮抗氧化作用。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種丹參酬II A衍生物，其特征在于該丹參酬II A衍生物的結(jié)構(gòu)式如式（I)和式 (II)所示及藥學(xué)上接受的鹽：其中:Χ、Υ各自獨(dú)立表示0、N; M=0或 1; Ri、R2相同或不同，分別獨(dú)立代表Ci-Cs直鏈或支鏈烷基，被0-1個(gè)取代基W取代的Ci-Cs的 直連和支鏈烷基，被0-1個(gè)取代基W取代C3-C6的環(huán)烷基，被0-1個(gè)取代基W取代的C3-C6取代的 締基或者取代締基，被0-1個(gè)取代基W取代的C3-C6烷基取代的烘基W及取代烘基;芳基、取代 芳基、芳雜環(huán)、取代芳雜環(huán);所述W為獨(dú)立選自徑基、氨基、簇基、琉基;或者Ri和R2相互連接形 成的取代或者非取代的3-6元飽和或不飽和的含有1-4個(gè)雜原子的環(huán)狀基團(tuán)，所述雜原子可 獨(dú)立或同時(shí)選自〇、N或S; R3可W是徑基，Ci-Cs飽和醇，Ci-Cs不飽和醇，Ci-Cs飽和的一級(jí)胺，Ci-Cs不飽和一級(jí)胺， C廣C5飽和的二級(jí)胺或Ci-Cs不飽和的二級(jí)胺，芳基或取代芳基； 所述的芳基選自含5-14個(gè)原子的芳基官能團(tuán)，包括但不限于苯基、糞基、面代苯； 所述的芳雜環(huán)選自含5-14個(gè)原子的芳雜環(huán)官能團(tuán)，包括但不限于化晚、贓晚、喀晚、巧 喃、化咯、嚷挫、嚷吩、嗯挫、哇嘟、嗎隙、化嗦。2. -種藥物組合物，其中含有權(quán)利要求1化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽及藥學(xué)上可接 受的載體。3. 權(quán)利要求1中化合物或其藥學(xué)上可W接受的鹽在制備保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的藥物中的用 途。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于:所述保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的藥物用于治療屯、 血管疾病。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于:所述屯、血管疾病是冠屯、病、動(dòng)脈粥樣硬化、 高血壓、腦出血或腦血栓。6. 權(quán)利要求1中化合物或其藥學(xué)上可W接受的鹽在制備抗氧化藥物中的用途，尤其是 保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激時(shí)受到損傷中的用途。7. 權(quán)利要求6中所述的用途，其特征在于:所述保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激時(shí)受到損傷 是通過調(diào)節(jié)化f 2-ARE通路進(jìn)行的。
【文檔編號(hào)】A61P39/06GK105837538SQ201610190543
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年3月28日
【發(fā)明人】王進(jìn)欣, 陳君, 何龍
【申請人】中國藥科大學(xué)