用于水溶性定位溶酶體的比率型pH熒光探針、其制備方法、應(yīng)用及測(cè)試方法
【專利說明】用于水溶性定位溶酶體的比率型pH熒光探針、其制備方法、應(yīng) 用及測(cè)試方法
[0001] -、技術(shù)領(lǐng)域 本發(fā)明涉及一種比率型pH熒光探針、其制備方法、應(yīng)用及測(cè)試方法，尤其是一種用于水 溶性定位溶酶體的比率型pH熒光探針、其制備方法、應(yīng)用及測(cè)試方法。
[0002] 二、【背景技術(shù)】 細(xì)胞內(nèi)pH值在許多細(xì)胞行為中發(fā)揮重要作用，如細(xì)胞生長(zhǎng)，細(xì)胞凋亡，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞 增殖等。作為細(xì)胞健康的一個(gè)重要指標(biāo)，細(xì)胞內(nèi)pH的微小變化可以導(dǎo)致細(xì)胞異常，甚至?xí)?起細(xì)胞功能障礙和嚴(yán)重的疾病，如癌癥和阿爾茨海默氏病。細(xì)胞內(nèi)的pH值不是相同的，細(xì)胞 質(zhì)是弱堿性的。而溶酶體內(nèi)部pH值約為4.0-6.0，呈弱酸性。溶酶體內(nèi)的弱酸性環(huán)境可以活 化內(nèi)部水解酶的功能，在細(xì)胞代謝中分解蛋白質(zhì)。因此，用于水溶性定位溶酶體的比率型pH 熒光探針、其制備方法、應(yīng)用及測(cè)試方法是對(duì)溶酶體的pH值定量檢測(cè)對(duì)細(xì)胞分析或診斷的 方法，在現(xiàn)有的比率型pH熒光探針和其制備方法及應(yīng)用中，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)pH值的方法主要有 核磁共振、吸收光譜和熒光光譜等，熒光檢測(cè)技術(shù)由于靈敏度高，操作方便，可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè) 等優(yōu)點(diǎn)而得到了廣泛應(yīng)用，但是大部分熒光探針都是檢測(cè)單個(gè)波長(zhǎng)熒光強(qiáng)度的變化，該類 探針輸出信號(hào)會(huì)受到溫度、溶劑極性、探針濃度的影響，會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
[0003] 三、
【發(fā)明內(nèi)容】
本發(fā)明的客體其一是一種用于水溶性定位溶酶體的比率型pH熒光探針， 本發(fā)明的客體其二是一種用于水溶性定位溶酶體的比率型pH熒光探針的其制備方法， 本發(fā)明的客體其三是一種用于水溶性定位溶酶體的比率型pH熒光探針的應(yīng)用， 本發(fā)明的客體其四是一種用于水溶性定位溶酶體的比率型pH熒光探針的測(cè)試方法。
[0004] 為了克服上述技術(shù)缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的是提供一種用于水溶性定位溶酶體的比率 型pH熒光探針、其制備方法、應(yīng)用及測(cè)試方法，因此同時(shí)檢測(cè)兩個(gè)發(fā)射波長(zhǎng)的熒光強(qiáng)度變 化，通過自校準(zhǔn)消除外界影響，提高檢測(cè)準(zhǔn)確性。
[0005] 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是： 一種用于水溶性定位溶酶體的比率型pH熒光探針，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下式所示：
[0006] 由于設(shè)計(jì)了比率型pH熒光探針，通過用于水溶性定位溶酶體的比率型pH熒光探針 的熒光共振能量轉(zhuǎn)移FRET機(jī)制表明，因此同時(shí)檢測(cè)兩個(gè)發(fā)射波長(zhǎng)的熒光強(qiáng)度變化，通過自 校準(zhǔn)消除外界影響，提高檢測(cè)準(zhǔn)確性。
[0007] 本發(fā)明設(shè)計(jì)了，一種用于水溶性定位溶酶體的比率型pH熒光探針，具有： 核磁共振氫譜測(cè)定結(jié)果 JHNMR (DMS0-d6,300 ΜΗζ)，δ (ppm) = 8.71-8.75 (m，1H)， 8.67 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 8.14 (s, 1H), 7.80 (t, J = 4.5 Hz, 1H), 7.51 (t, J =4.5 Hz, 2H), 7.39 (dd, J = 1.5 Hz, J = 7.5 Hz, 1H), 7.00 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 6.30-6.43 (m, 6H), 4.03 (s, 3H), 3.39-3.48 (m, 4H), 3.18-3.32 (m, 10H), 1.56-1.64 (m, 2H), 1.39 (q, J = 7.5 Hz, 2H), 0.97-1.09 (m, 12H), 0.91 (t, J = 7.5 Hz, 3H), 磁共振碳譜測(cè)定結(jié)果：13C NMR (DMS〇-d6, 75 MHz), δ (ppm) = 12.31 (4C), 13.48 (2C), 21.66 (2C), 25.12, 28.57, 29.96, 43.51 (3C), 64.31, 64.31, 97.27 (2C), 104.74 (2C), 108.07 (2C), 110.93 (2C), 116.01, 119.24, 121.51, 122.22, 123.60, 124.20, 128.25, 128.60, 130.65 (2C), 131.45, 132.68, 138.47 (2C), 152.51 (2C), 153.87, 163.76, 167.69, 高分辨質(zhì)譜測(cè)定結(jié)果：Calcd. [M_I]-: 733.3633; found value - : 733.3623, 的化合物。
[0008] 本發(fā)明設(shè)計(jì)了，一種用于水溶性定位溶酶體的比率型pH熒光探針的其制備方法， 其步驟： 中間化合物m、H0BT (1-羥基苯并三唑）、EDC[ 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺 鹽酸鹽]、三乙胺溶解于DMF中得到中間溶液中，將中間化合物V加入到中間溶液中，反應(yīng)得 到最終化合物RMPM， 其中：中間化合物m化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下式所示：
中間化合物V化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下式所示：
[0009] 本發(fā)明設(shè)計(jì)了，一種用于水溶性定位溶酶體的比率型pH熒光探針的其制備方法， 其步驟:其步驟： 中間化合物mi.0-1.4 mmol、HOBT 1.0-1.4 mmol、EDC 1.0-1.4 mmol、三乙胺 1.8-2.2 mmol溶解于DMF18-22mL中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫?cái)嚢?.8-1.2h，得到中間溶液，然后將中間化 合物V0.8-1.2 mmol加入到中間溶液中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，室溫?cái)嚢?8-22h，硅膠板跟蹤確定 反應(yīng)終點(diǎn)，將反應(yīng)液減壓蒸發(fā)濃縮得粗終端化合物，將粗終端化合物用二氯甲烷和水中萃 取，收集有機(jī)相，干燥，濃縮，然后通過柱色譜純化，得到的淡黃色固體即終端化合物RMPM， 收率 45.2%，熔點(diǎn)：197-201°(3。
[0010] 本發(fā)明設(shè)計(jì)了，一種用于水溶性定位溶酶體的比率型pH熒光探針的其制備方法， 其步驟:其步驟： 3-丁基-1-氯咪唑并〔1，5-α〕吡啶-7-羧酸乙酯即中間化合物I8-12mmol和Na0H18-22mmol溶解在乙醇18-22ml和水13-17ml的混合溶液中，回流反應(yīng)1.8-2.2 h后，將所得溶液 倒入180-220 ml水中，用稀鹽酸1.8-2.2M中和至中性，有黃色固體析出過濾，用水洗滌2 X 5mL，在烘箱中50°C干燥后，得到黃色固體即中間化合物Π ，收率為90.8%， 將中間化合物n8-12mmol和CH3I 48-52mmol溶解在四氫呋喃28-32ml溶液中，在氮?dú)?保護(hù)下加熱回流反應(yīng)7.8-8.2h，冷卻到室溫，析出黃色固體，通過真空抽濾，濾餅用乙酸乙 酯8-12ml洗滌3次，得到黃色的固體即中間化合物ΙΠ ，收率為73.0%， 中間化合物V可以通過由在文獻(xiàn)中的方法制的中間化合物IV和乙二胺反應(yīng)合成， 其中：中間化合物IV化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下式所示：
[0011] 本發(fā)明設(shè)計(jì)了，一種用于水溶性定位溶酶體的比率型pH熒光探針的其制備方法的 合成路線如下：
本發(fā)明設(shè)計(jì)了，一種用于水溶性定位溶酶體的比率型pH熒光探針作為比率型pH熒光探 針的應(yīng)用。
[0012] 本發(fā)明設(shè)計(jì)了，一種用于水溶性定位溶酶體的比率型pH熒光探針作為測(cè)定pH為 5.8到6.8的比率型pH熒光探針的應(yīng)用。
[0013] 本發(fā)明設(shè)計(jì)了，一種用于水溶性定位溶酶體的比率型pH熒光探針作為在Hela細(xì)胞 的比率型pH熒光探針的應(yīng)用。
[0014] 本發(fā)明設(shè)計(jì)了，一種用于水溶性定位溶酶體的比率型pH熒光探針的測(cè)試方法，其 步驟：配制上述水溶性定位溶酶體的比率型pH熒光探針，在不同pH值下的溶液（乙醇/ Britton-Robinson緩沖溶液，40mM醋酸，磷酸，硼酸，1:4，體積比），通過焚光分光光度法測(cè) 試其對(duì)不同pH值的響應(yīng)能力； 在酸性條件下向上述含pH熒光探針的溶液中分別定量加入AgN03, Al(N03)3，Ba(N03) 2， Cd(N03)2，Co(N03)2, Cu(N03)2，F(xiàn)e(N03)3，HgC12，Ni (N03)2, Pb(N03)2，Zn(N03)2的 水溶液，測(cè)試其抗干擾能力； 使用不同濃度的上述pH熒光探針培養(yǎng)Hela細(xì)胞，分別進(jìn)行熒光成像，觀察細(xì)胞內(nèi)熒光 強(qiáng)度變化， 使用上述pH焚光探針與商品化的溶酶體探針Lysosensor? Green DND-189對(duì)活Hela 細(xì)胞共染色，通過熒光成像進(jìn)行染色定位， 使用一定濃度不同pH值的上述pH熒光探針培養(yǎng)Hela細(xì)胞，觀察熒光強(qiáng)度和紅色熒光/ 藍(lán)色熒光比率的變化， 使用一定濃度的上述pH熒光探針培養(yǎng)Hela細(xì)胞，在激光的連續(xù)激發(fā)下，觀察藍(lán)色熒光/ 紅色熒光的比率的變化，測(cè)試該探針在Hela細(xì)胞中的光穩(wěn)定性， 使用一定濃度的上述pH熒光探針培養(yǎng)Hela細(xì)胞6 h后，檢測(cè)探針對(duì)Hela細(xì)胞存活率的 影響。
[0015] 本發(fā)明的技術(shù)效果在于:所述活細(xì)胞優(yōu)選Hela細(xì)胞。定位溶酶體的pH熒光探針響 應(yīng)迅速，具有優(yōu)良的水溶性，對(duì)多種金屬離子具有良好抗干擾能力。在pH從5.8到6.8范圍內(nèi) 變化顯著，適應(yīng)弱酸性條件下pH檢測(cè)。該探針可以選擇將Hela細(xì)胞中的溶酶體染色，可用于 在活細(xì)胞中pH的檢測(cè)。上述探針具有羅丹明-咪唑并[1，5_α]吡啶結(jié)構(gòu)，當(dāng)pH值從5.50增加 到7.00，咪唑并[1，5-α]吡啶基團(tuán)的藍(lán)色熒光幾乎是不變的。同時(shí)，羅丹明基團(tuán)