一種乳酸片球菌與片球菌素同步生產(chǎn)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種片球菌素生產(chǎn)方法，特別涉及乳酸片球菌與片球菌素同步生產(chǎn)的 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 在控制食品中病原性和腐敗性微生物方面，一個重要的發(fā)展就是細(xì)菌素的發(fā)現(xiàn)。 細(xì)菌素為肽類物質(zhì)，由細(xì)菌產(chǎn)生，在食品工業(yè)上，細(xì)菌素指的是由乳酸菌產(chǎn)生，對許多腐 敗和病原細(xì)菌有殺滅作用。因為他們符合公認(rèn)安全的標(biāo)準(zhǔn)（Generallyrecognizedas safe，GRAS)，因此，具有作為食品保藏劑的巨大潛力。乳酸菌產(chǎn)生的細(xì)菌素對食品工業(yè)有極 強的吸引力，還因為他們屬于天然食品防腐劑，使用這些抗菌肽可以大大減少化學(xué)添加劑 的使用量或減少物理處理的強度。
[0003] 到目前為止，nisin(乳鏈球菌素）是唯一得到商業(yè)化和大規(guī)模應(yīng)用的細(xì)菌素。盡 管nisin具有抗菌譜較廣、天然、無毒副作用、安全、高效等優(yōu)點，但其在在中性和堿性條件 下溶解度低，對食品中一些酶敏感，及一些細(xì)菌可對其產(chǎn)生抗性等問題。因此，對于僅單獨 用一種細(xì)菌素貯藏的食品，抗細(xì)菌素的病原微生物的出現(xiàn)是潛在的威脅。克服這些問題的 途徑之一是開發(fā)更多的細(xì)菌素，并將多種細(xì)菌素聯(lián)合應(yīng)用，以彌補使用單一細(xì)菌素可能出 現(xiàn)的問題。片球菌素被認(rèn)為是繼nisin之后第二個有望用于食品工業(yè)的細(xì)菌素。主要因為 它由符合GRAS標(biāo)準(zhǔn)的片球菌產(chǎn)生，具有廣譜抑菌作用，在食品中性質(zhì)穩(wěn)定，進(jìn)入消化道后 迅速被蛋白酶消化等特征。
[0004] 乳酸片球菌能夠定居到動物和人的消化道，作為潛在的益生菌顯示出良好的應(yīng)用 前景。目前乳酸片球菌作為益生菌的應(yīng)用主要集中在小動物、禽類、豬和水產(chǎn)動物等，正被 作為益生制劑用于治療便秘、腹瀉、消除應(yīng)激反應(yīng)、增強免疫力等。乳酸片球菌作為益生菌 制劑代替抗生素用于飼料中是國際上備受推崇的措施之一，具有良好的市場前景。
[0005] 現(xiàn)有的片球菌素純化方法，都較為繁瑣，大量純化成本也較高。且在純化的過程中 只提取片球菌素，而乳酸片球菌則在純化的過程中死亡而未被收集利用。乳酸片球菌有很 多益生作用，在發(fā)酵過程中不能夠收集應(yīng)用是一種浪費。因此建立獲得乳酸片球菌菌體和 片球菌素的同步生產(chǎn)工藝具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供一種乳酸片球菌與片球菌素同步生 產(chǎn)的方法，克服現(xiàn)有技術(shù)中片球菌素純化方法繁瑣、成本較高、乳酸片球菌在純化的過程中 未被收集利用的問題。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種乳酸片球菌與片球菌素同步生產(chǎn)的方法，包括以下步 驟：
[0008] (1)將含有乳酸片球菌和片球菌素的發(fā)酵液調(diào)節(jié)pH為2. 8-3. 2,攪拌進(jìn)行解吸 附；
[0009] (2)將步驟（1)解吸附的發(fā)酵液離心處理，得到上清液和菌體；
[0010] (3)將步驟（2)所得上清液依次經(jīng)過微濾、超濾、納濾、冷凍干燥工藝獲得片球菌 素產(chǎn)品；
[0011] (4)將步驟（2)所得菌體進(jìn)行噴霧干燥獲得乳酸片球菌噴干制劑。
[0012] 所述步驟（1)攪拌解吸附速率為200r/min，時間2h。
[0013] 所述步驟⑵離心的條件為4°C，lOOOOrpm。
[0014] 所述步驟⑶微濾的條件為0.45 μ m水系微濾膜，室溫，壓力為0· IMpa。
[0015] 所述步驟（3)超濾工藝的條件為：選擇截留分子量為5000Da的聚醚砜膜，在室溫， 0. 02MPa的條件下進(jìn)行超濾處理，超濾濃縮比為3時，進(jìn)行洗濾操作，加入與初始料液等體 積的去離子水進(jìn)行全過濾工藝，待超濾濃縮比為5時停止超濾處理。
[0016] 所述步驟（3)納濾工藝的條件為：選擇截留分子量為650Da的聚醚砜膜，在室溫， 0. 02MPa的條件下進(jìn)行納濾處理，納濾濃縮比為4時停止納濾濃縮。
[0017] 所述步驟（3)冷凍干燥獲得片球菌素產(chǎn)品工藝為：將納濾濃縮液中加入一定量的 氯化鈉，最終濃度為70% -80%，首先-45°C預(yù)凍2h，溫度為-56°C，干燥6h。
[0018] 所述步驟⑷噴霧干燥獲得乳酸片球菌噴干制劑工藝為：保護(hù)劑為海藻 糖 48-52g/L，β-環(huán)糊精 28-32g/L，乳糖 38-42g/L，脫脂乳粉 98-102g/L;進(jìn) 口溫度 145-155°C，進(jìn)料流速為65-75mL/h，保護(hù)劑與菌泥的比例為0. 235-0. 245(L:g)。
[0019] 本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明同步生產(chǎn)方法同時獲得了乳酸片球菌菌體和片球 菌素產(chǎn)品。乳酸片球菌噴干制劑的活菌數(shù)可達(dá)到8. 5X1012-8. 6X1012CFU/g，存活率為 20-25%。片球菌素產(chǎn)品的純化倍數(shù)為2. 5% -2. 6 %以上，收率可達(dá)到80% -85%。
【附圖說明】
[0020] 圖1乳酸片球菌素效價標(biāo)準(zhǔn)曲線；抑菌圈直徑差：不同濃度的片球菌素溶液與中 心濃度（片球菌素溶液與PBS緩沖液1:1混合，效價為320AU/mL)的片球菌素溶液抑菌圈 直徑的差值；
[0021] 圖2乳酸片球菌菌體和片球菌素同步生產(chǎn)工藝流程圖。
【具體實施方式】
[0022] 下面結(jié)合附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明做詳細(xì)說明。
[0023] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0024] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0025] 海藻糖購自南寧中諾生物工程有限責(zé)任公司，谷氨酸鈉購自國藥集團化學(xué)試劑有 限公司、α-乳糖購自上海恒信化學(xué)試劑有限公司、β-環(huán)狀糊精購自西安宏昌藥業(yè)有限責(zé) 任公司、脫脂乳粉購自新西蘭Westland合作乳業(yè)有限公司。
[0026] 5000Da和650Da聚醚砜超濾濾膜，美國Pal1公司；小型噴霧干燥機，美國 Labplant公司。
[0027] 本發(fā)明中所述乳酸片球菌是指乳酸片球菌PA003 (Pediococcus acidilactici PA003)〇
[0028] 實施例1
[0029] 片球菌素效價測定
[0030] 乳酸片球菌發(fā)酵液用2mol/L的HCI調(diào)節(jié)pH到1. 9-2. 0,防止乳酸片球菌素吸附 到細(xì)胞上，65-70°C水浴28-30min，防止發(fā)酵液中的蛋白酶破壞細(xì)菌素。然后，8000r/min， 4°(：離心15-2〇11^11，取上清液用2111〇1/1的似0!1調(diào)節(jié)？!1到5.9-6.1，進(jìn)行抑菌試驗測定乳酸 片球菌素效價。乳酸片球菌素的抑菌活性實驗參考管碟法。效價的測定采用二倍稀釋法， 以李氏桿菌為指示菌，細(xì)菌素液依次用0. 02mol/L，pH6. 0的磷酸緩沖液（PBS)2倍稀釋，用 對指示菌顯示抑菌圈的最高稀釋倍數(shù)表示細(xì)菌素活性，計算式為：AU/mL= 2nX(1000/x)，n 表示對指示菌顯示抑菌圈的大小與牛津杯外徑的差值不小于2mm的孔數(shù)；x表示每孔中的 細(xì)菌素液加樣體積。二倍稀釋法確定了乳酸片球菌培養(yǎng)16-17h后發(fā)酵液中乳酸片球菌素 的效價為640AU/mL，抑菌圈直徑差與效價對數(shù)值呈線性關(guān)系，可繪出效價標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖 1)〇
[0031] 實施例2
[0032] 發(fā)酵后乳酸片球菌上吸附的片球菌素含量分析
[0033] 乳酸片球菌培養(yǎng)16h后，發(fā)酵液分別進(jìn)行如下處理：（1)發(fā)酵液離心（8000r/min， 4°C，lOmin)，上清液用4mol/LHCI調(diào)pH為2. 0,置于4°C冰箱備用，收集菌體備用；（2)上 述離心后的菌體2次洗滌后，加入發(fā)酵液等體積的100mm〇l/LNaCl(pH2. 0)，電動攪拌12h， 取上清液備用；（3)發(fā)酵液不離心直接用4mol/LHCI調(diào)pH為2. 0,電動攪拌攪拌12h，取上 清液備用；（4)發(fā)酵液用 4mol/LHCI調(diào)pH為 2. 0, 70°C，30min滅酶，離心（8000r/min，4°C， lOmin)取上清液，置于4°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?br>[0034] 發(fā)酵結(jié)束后菌體細(xì)胞上吸附的片球菌素含量為總片球菌素含量的28. 51%。需要 對乳酸片球菌進(jìn)行解析附處理以增加發(fā)酵液中的片球菌素含量。為了同步獲得較多產(chǎn)量的 乳酸片球菌素及活菌體，選擇2h作為其適宜的解吸附時間，pH值3. 0作為片球菌素的適宜 吸附pH值。
[0035] 實施例3
[0036] 超濾膜的選擇
[0037] 根據(jù)處理料液的性質(zhì)及目的的不同，需選取合適的超濾膜進(jìn)行超濾操作，實驗通 過測定片球菌素純化倍數(shù)和回收率、膜通量、雜蛋白去除率和膜抗污染性能指標(biāo)來篩選最 適合的超濾膜。實驗選擇截留分子量分別為l〇〇〇Da，5000Da，lOOOODa的聚醚