一種殺蟲性融合蛋白的發(fā)酵制備方法及其發(fā)酵產物的殺蟲組合物的制作方法
【專利說明】一種殺蟲性融合蛋白的發(fā)酵制備方法及其發(fā)酵產物的殺蟲 組合物
[0001]
技術領域： 本發(fā)明屬于害蟲防治領域，具體涉及一種殺蟲性融合蛋白的發(fā)酵制備方法及其發(fā)酵產 物的殺蟲組合物。
[0002]
【背景技術】： 在害蟲防治領域，采用基因技術來實現害蟲防治較為成熟的僅有Bt和CpTI基因。隨 著采用生物技術來進行害蟲防治需求的增大，將兩個或多個對害蟲具有抑制作用的基因序 列重組形成融合蛋白來實現害蟲的防治進一步受到人們的關注。
[0003] 然而利用毒素蛋白或者對害蟲具有抑制作用的基因序列重組形成融合蛋白的技 術在實際應用上存在蛋白表達量不可控、獲得成本高、蛋白不易純化、活性蛋白產物少、蛋 白活性易受應用環(huán)境的影響而造成其活性的喪失等一系列問題，從而造成了融合蛋白在害 蟲防治領域的應用方面受到限制。
[0004] 因此，需要一種適合于融合蛋白表達方法來實現殺蟲性融合蛋白穩(wěn)定大量的表 達。同時，對于蛋白表達產物采用適當的方法制作成合適的制劑來滿足害蟲防治的田間應 用。
[0005]

【發(fā)明內容】
： 本發(fā)明根據抗蟲性融合蛋白在蛋白表達過程中的需要、蛋白表達產物特點、以及田間 害蟲防治的應用需求，采用一種殺蟲性融合蛋白規(guī)模發(fā)酵制備方法來實現蛋白的高效穩(wěn)定 表達，并將表達后的產物通過篩選與其相匹配的物質的組合來開發(fā)出一種基于融合蛋白發(fā) 酵產物的殺蟲組合物，來滿足目標害蟲防治的田間需求。
[0006] 技術方案如下： 1、一種殺蟲性融合蛋白的發(fā)酵制備方法，其步驟包括： (1) 融合蛋白種子液的準備， (2) 接種融合蛋白種子液， (3) 融合蛋白發(fā)酵產物大量表達階段； 其特征在于： 在步驟（2)接種融合蛋白種子液之前需要完成發(fā)酵培養(yǎng)基的預培養(yǎng)， 在步驟（3)融合蛋白發(fā)酵產物大量表達階段具有補料過程，其中，補料液的流速可隨著 接種的時間的延長進行動態(tài)調整。
[0007] 在融合蛋白表達過程中，增加了對發(fā)酵培養(yǎng)基預培養(yǎng)的步驟，使發(fā)酵罐的環(huán)境達 到適合真核酵母的生長，有助于融合蛋白的表達；在融合蛋白發(fā)酵產物大量表達階段采用 動態(tài)調整的方式進彳丁補料，有助于融合蛋白尚效穩(wěn)定的表達，從而獲得含量尚、殺蟲活性強 的發(fā)酵產物融合蛋白。
[0008] 2、根據技術方案1所述的發(fā)酵制備方法，其特征在于：所述融合蛋白至少包括：一 種植物凝集素蛋白、一種毒素蛋白，其特征在于，融合蛋白的連接順序為：所述植物凝集素 蛋白與毒素蛋白連接，所述融合蛋白具有殺蟲效果。
[0009] 采用植物凝集素蛋白和毒素蛋白重組形成融合蛋白，其中植物凝集素能結合到昆 蟲消化道上皮細胞糖蛋白受體上，對昆蟲產生局部或系統(tǒng)的毒害作用，從而抑制其生長，甚 至將其殺死；它還能在昆蟲消化道內誘發(fā)病灶，促進消化道中細菌的繁殖，對害蟲本身造成 傷害，抑制害蟲生長發(fā)育繁殖，對昆蟲的作用部位主要在中腸的表皮細胞，引起其中腸微絨 毛膜破裂，邊緣部分發(fā)生病變，引起細菌在微絨毛區(qū)增殖，使細胞溶解；中腸表皮細胞發(fā) 生異常變化，功能結構受到破壞，引起死亡，有的甚至可以穿過消化系統(tǒng)進入血淋巴循環(huán)系 統(tǒng)。而毒素蛋白可作用于昆蟲的神經元離子通道，融合蛋白同時在昆蟲的消化道和神經系 統(tǒng)發(fā)揮作用，從而起到防治害蟲的作用。選用蛋白特定的連接順序是考慮到該連接序列在 翻譯后形成的氨基酸序列不影響毒素蛋白和植物凝集素的空間結構，并更好的發(fā)揮融合蛋 白的殺蟲作用。
[0010] 3、根據技術方案2所述的融合蛋白，其特征在于：所述毒素蛋白為蜘蛛毒素蛋白 或者與蜘蛛毒素蛋白功能等同的毒性蛋白。蜘蛛毒素對于靶向昆蟲的神經系統(tǒng)具有損傷作 用，但對哺乳動物、蜜蜂無毒，無害，對環(huán)境無污染。
[0011] 4、根據技術方案3所述的融合蛋白，其特征在于：所述植物凝集素為雪花蓮凝集 素（GNA)或者與雪花蓮凝集素功能等同的植物凝集素。
[0012] 雪花蓮凝集素可以和昆蟲圍食膜表面、消化道上皮細胞的糖綴合物、或糖基化的 消化酶等結合，誘發(fā)昆蟲消化道產生病灶而達到殺蟲的目的。同時，克服了蜘蛛毒素易被昆 蟲消化道中消化蛋白水解的難題。與雪花凝集素功能等同的植物凝集素包括伴刀豆凝集素 (ConA)、大蒜凝集素等植物凝集素，上述植物凝集素對人、畜以及蜜蜂無害。
[0013] 5、根據技術方案1所述的發(fā)酵制備方法，其特征在于：所述融合蛋白發(fā)酵產物是 由畢赤酵母將融合蛋白運用真核發(fā)酵的方式進行蛋白表達。
[0014] 選擇畢赤酵母真核表達體系進行融合蛋白的表達，具有表達量高，發(fā)酵產物易純 化，易實現高密度發(fā)酵等優(yōu)點，并在表達過程中，可使融合蛋白經過正確的糖基化和蛋白酶 剪切，從而得到活性高的融合蛋白。
[0015] 6、根據技術方案6所述的融合蛋白發(fā)酵產物，其特征在于：所述畢赤酵母為 SMD1168H、KM71、GS115、YPH499、YPH500、YPH501的一個株系或幾個株系的混合物。在畢 赤酵母的眾多株系中經過試驗篩選出以上株系，對融合蛋白的表達效果更好。
[0016] 7、根據技術方案1所述的發(fā)酵制備方法，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的預培養(yǎng)的具體方法如 下： 向發(fā)酵罐中按體積比加入20%-35%的BSM培養(yǎng)基，pH調節(jié)劑為30%-60%的氨水，參數 設置為空氣壓力 〇· 〇3MPa-〇. 06MPa，溫度 23°C-32°C，pH為 3-4. 5,轉速 200rpm-300rpm，運 行55h-75h，完成培養(yǎng)基的預培養(yǎng)，其中，BSM培養(yǎng)基為最小緩沖甲醇培養(yǎng)基。該步驟為接種 種子液后的酵母菌落提供最佳生長環(huán)境，縮短了種子液在發(fā)酵罐中的適應期。
[0017] 8、根據技術方案1所述的發(fā)酵制備方法，所述融合蛋白種子液的準備的具體方法 如下： 挑取含有融合蛋白基因片段的畢赤酵母菌株單菌落接種于的無抗性的YPG液體培養(yǎng) 基中，在28°C-32°C，180rpm-250rpm環(huán)境中搖床培養(yǎng)48-75h，其中，YPG液體培養(yǎng)基為酵母 提取物、蛋白胨、蔗糖培養(yǎng)基。該方法適合于表達融合蛋白的酵母菌落的生長，使酵母生長 進入對數生長期，菌落生命力旺盛、適宜環(huán)境快、生長繁殖快，縮短在發(fā)酵罐中的非產物合 成時間。
[0018] 9、根據技術方案1所述的發(fā)酵制備方法，所述接種融合蛋白種子液的具體方法如 下： (1) 向預培養(yǎng)的發(fā)酵罐中加入PTM1，PTM1與BSM培養(yǎng)基的體積比為3:1000-7:1000 ; (2) 在發(fā)酵罐中接種種子液，其中種子液與BSM培養(yǎng)基的體積比為1:20-3:20,完成后 進行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：轉速400rpm-750rpm，pH為3. 7-4. 1，溫度28°C-32°C。
[0019] 該方法為酵母菌種生長提供合適的營養(yǎng)成分，使進入新環(huán)境發(fā)酵罐中的種子液迅 速進入快速生長期，顯著提高了融合蛋白的表達量。
[0020] 10、根據技術方案1所述的發(fā)酵制備方法，所述融合蛋白發(fā)酵產物大量表達階段 的具體方法如下： 補料過程：在接種后l〇h進行補料，補料液的流速為5mL/h，補料時間為12h-20h，將轉 速調至700rpm-1000rpm，補料液流速調整為10mL/h，補料時間為12h-15h，此后，補料流速 在上次補料流速的基礎上逐級遞增4-8mL/h，單次補料時間為12h-15h; 本階段共持續(xù)70h-90h，在本階段需要保持溶氧25%-35%，連接消泡劑；大量表達階段 結束后可直接離心獲得融合蛋白發(fā)酵產物； 所述補料液的主要成份包括消泡劑、50%的甘油、PTM1，其中，50%的甘油與消泡劑、PTM1 體積比為 125:20:1-200:40:3。
[0021] 該階段為蛋白分泌到酵母細胞外提供合適的條件，為酵母快速生長提供最佳條 件，顯著提高了融合蛋白的表達量。其中，所述50%的甘油為甘油與水的體積比為1:1。
[0022] 11、一種殺蟲組合物，其特征包含利用根據技術方案1所述的方法制造的融合蛋 白發(fā)酵產物以及溶劑、保護劑、乳化劑、分散劑、保濕劑，其特征在于：各組分按照殺蟲組 合物的質量比分別為：融合蛋白發(fā)酵產物5%-35%、溶劑30%-60%、保護劑1%-20%、乳化劑 0. 1%-10%、分散劑 0. 1%-10%、以及保濕劑 1%-10%。
[0023] 將融合蛋白的發(fā)酵產物作為有效成分，通過篩選溶劑、保護劑、乳化劑、分散劑、保 濕劑，制備成穩(wěn)定性好、分散效果好，具有對半翅目的盲蝽蟓、同翅目桃蚜、豌豆蚜等、鱗翅 目的甘藍夜蛾等多種害蟲具有明顯的抗蟲作用，具有殺蟲譜廣的優(yōu)點。
[0024] 12、根據技術方案11所述的殺蟲組合物，其特征在于：所述的溶劑為磷酸鹽緩沖 液、磷酸鹽-氯化鹽的緩沖液中的一種或兩種組合，其溶劑的PH6-8。
[0025] 溶劑是pH6_8為磷酸鹽緩沖液、磷酸鹽-氯化鹽的緩沖液中的一種或兩種組合， 代替農用殺蟲劑中常用的有機溶劑，減少了環(huán)境污染，而且融合蛋白在該pH范圍穩(wěn)定性最 佳。
[0026] 13、根據技術方案11所述的殺蟲組合物，其特征在于：所述保護劑為乙二醇、氯化 鈣、葡萄糖、山梨酸鉀中的一種或幾種組合。
[0027] 乙二醇可以抵御田間環(huán)境溫度變化，氯化鈣可以維持蛋白正確的空間結構，葡萄 糖可以增強對環(huán)境的抗逆耐受力，山梨酸鉀可以抑制有害微生物分解融合蛋白。
[0028] 14、根