砜膜（PES)， 20000Da，10000Da，5000Da，1000Da的陶瓷膜（CT)對片球菌素進行超濾處理超濾實驗在室 溫和0. 2MPa的壓力條件下進行，采用循環(huán)超濾的模式。
[0038] 1.片球菌素回收率和雜蛋白去除率測定
[0039] 對經微濾處理后的400mL料液進行循環(huán)超濾，在超濾濃縮比分別為1. 5, 2. 0, 2. 5， 3. 0, 3. 5, 4. 0, 4. 5, 5. 0, 5. 5時測定透過液和濃縮液的體積、蛋白質濃度和片球菌素活性，以 及膜通量。
[0040] 超濾濃縮比為初始料液的體積與超濾后剩余料液的體積比。透過液中物質的回收 率為透過液中此物質的量與料液中相應物質的量的比值。濃縮液中物質回收率等于濃縮液 中此物質的量與料液中相應物質的量的比值。
[0041] 2.膜通量測定
[0042]對經微濾處理后的400mL料液進行循環(huán)超濾，每隔20min測定一次膜通量，膜通量 常用單位時間內通過單位膜面積的透過液的體積來表示。
[0043] 3.膜組件的清洗
[0044] 超濾處理結束后，先用一定量的去離子水沖洗超濾膜設備lOmin，然后用0. 5mol/ L的NaOH水溶液清洗超濾膜30min。然后，用去離子水清洗干凈超濾膜內殘留的堿液。
[0045] 4.通量回復率測定
[0046] 膜組件清洗完成后，測定膜的去離子水通量。清洗后的超濾膜設備的去離子水通 量與膜的初始水通量的比值，即為通量回復率
[0047] 綜合考慮不同超濾膜的純化倍數(shù)、片球菌素收率、膜通量和膜通量回復率指標進 行實驗用超濾膜選擇。相同截留分子量的陶瓷膜的初始膜通量要高于聚醚砜膜，但是陶瓷 膜更易于被污染，且片球菌素的純化倍數(shù)、收率以及膜通量回復率要低于聚醚砜膜，因此實 驗的超濾膜材質將選擇聚醚砜膜。聚醚砜超濾膜中，5000Da的超濾膜對片球菌素有最好的 純化倍數(shù)，可達到3. 9-4. 0,和相對較高的片球菌素收率，初始膜通量略低，但是膜通量的回 復率和抗污性能要高于lOOOODa的超濾膜。綜上所述，實驗選擇5000Da聚醚砜膜對乳酸片 球菌素進行超濾處理。
[0048] 表1不同超濾膜超濾后蛋白質濃度和片球菌素活性（超濾濃縮比為4時）
[0049] Table1ResultsoftheUFtestsrealizedwithsevenmembranesof differentMffC0(VCF= 4)
[0050]
[0051] 5.洗濾條件的確定
[0052] 取微濾后的片球菌發(fā)酵液1600mL均分為4份，每份400mL，分別在室溫和0.2MPa 的條件下進行全過濾。用5000Da的聚醚砜超濾膜進行超濾，測定不同超濾濃縮比時截留 液、透過液中的片球菌素含量，片球菌素收率和膜通量以選擇合適的超濾濃縮比進行全過 濾工藝。
[0053] 全過濾工藝共分為以下4個階段：第一階段，當濃縮比等于3時，補水稀釋至 400mL;第二階段，再次濃縮至濃縮比為3時，補水稀釋至400mL;第三個階段，同樣濃縮比為 3時，補水稀釋至400mL;第四個階段，濃縮至超濾濃縮比為3,整個超濾過程結束。試驗中， 對各個階段片球菌素收率、膜通量進行監(jiān)測，確定最優(yōu)的洗濾模式。
[0054] 選擇超濾濃縮比為3時開始進行洗濾操作。未洗濾前片球菌素收率為40-50%。 第一階段洗濾后片球菌素的收率增加到70-75%，第二階段、第三階段和第四階段時，片球 菌素的收率沒有顯著增加（p> 〇. 05)。稀釋補水后，膜通量能夠得到較好的恢復，在第一階 段全過濾工藝后，膜通量回復率也達到了 85-90%。因此選擇"一階段全過濾工藝"，即當濃 縮比等于3時，補水稀釋至400mL，繼續(xù)進行超濾，待超濾濃縮比為5時停止超濾處理，片球 菌素的收率為90-95%。
[0055] 實施例4
[0056] 納濾濃縮
[0057] 收集上述得到的超濾透過液，用650Da的納濾膜進行納濾濃縮實驗，分別在不同 的納濾濃縮比時測定濃縮液中片球菌素的含量以及膜通量，確定適宜的納濾濃縮比。選擇 當納濾濃縮比為4時停止?jié)饪s處理，濃縮液中片球菌素的收率為80-85%，整個濃縮過程的 時間為60min左右。
[0058] 實施例5
[0059] 冷凍干燥獲得片球菌素產品
[0060] 將片球菌素粗提液中加入一定量的氯化鈉，最終濃度為70% -80%，首先_45°C左 右預凍2h左右，在溫度為_56°C左右，干燥6h，得到片球菌素產品。
[0061] 實施例6
[0062] 噴霧干燥獲得乳酸片球菌制劑
[0063] 保護劑為海藻糖48-52g/L，β-環(huán)糊精28-32g/L，乳糖38-42g/L，脫脂乳粉 98-102g/L;在進口 口溫度145-155 °C，進料流速為65-75mL/h，保護劑與菌泥的比例為 0. 235-0. 245 (L:g)的條件下進行噴霧干燥，得到乳酸片球菌制劑。
[0064] 盡管上面結合附圖對本發(fā)明進行了描述，但是本發(fā)明并不局限于上述的具體實施 方式，上述的【具體實施方式】僅僅是示意性的，并不是限制性的，本領域的普通技術人員在本 發(fā)明的啟示下，在不脫離本發(fā)明宗旨和權利要求所保護的范圍情況下，還可以做出很多形 式，這些均屬于本發(fā)明的保護范圍之內。
【主權項】
1. 一種乳酸片球菌與片球菌素同步生產的方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 將含有乳酸片球菌和片球菌素的發(fā)酵液調節(jié)pH為2. 8-3. 2,攪拌進行解吸附； (2) 將步驟⑴解吸附的發(fā)酵液離心處理，得到上清液和菌體； (3) 將步驟（2)所得上清液依次經過微濾、超濾、納濾、冷凍干燥工藝獲得片球菌素產 品； (4) 將步驟（2)所得菌體進行噴霧干燥獲得乳酸片球菌噴干制劑。2. 根據(jù)權利要求1所述乳酸片球菌與片球菌素同步生產的方法，其特征在于，所述步 驟（1)攪拌解吸附速率為200r/min，時間2h。3. 根據(jù)權利要求1所述乳酸片球菌與片球菌素同步生產的方法，其特征在于，所述步 驟（2)離心的條件為4°C，lOOOOrpm。4. 根據(jù)權利要求1所述乳酸片球菌與片球菌素同步生產的方法，其特征在于，所述步 驟⑶微濾的條件為0.45μm水系微濾膜，室溫，壓力為0·IMpa。5. 根據(jù)權利要求1所述乳酸片球菌與片球菌素同步生產的方法，其特征在于，所述步 驟（3)超濾工藝的條件為：選擇截留分子量為5000Da的聚醚砜膜，在室溫，0. 02MPa的條件 下進行超濾處理，超濾濃縮比為3時，進行洗濾操作，加入與初始料液等體積的去離子水進 行全過濾工藝，待超濾濃縮比為5時停止超濾處理。6. 根據(jù)權利要求1所述乳酸片球菌與片球菌素同步生產的方法，其特征在于，所述步 驟（3)納濾工藝的條件為：選擇截留分子量為650Da的聚醚砜膜，在室溫，0. 02MPa的條件 下進行納濾處理，納濾濃縮比為4時停止納濾濃縮。7. 根據(jù)權利要求1所述乳酸片球菌與片球菌素同步生產的方法，其特征在于，所述步 驟（3)冷凍干燥獲得片球菌素產品工藝為：將納濾濃縮液中加入一定量的氯化鈉，最終濃 度為70%-80%，首先-45°(：預凍211，溫度為-56°(：，干燥611。8. 根據(jù)權利要求1所述乳酸片球菌與片球菌素同步生產的方法，其特征在于，所述步 驟（4)噴霧干燥獲得乳酸片球菌噴干制劑工藝為：保護劑為海藻糖48-52g/L，β-環(huán)糊精 28-32g/L，乳糖 38-42g/L，脫脂乳粉 98-102g/L;進 口溫度 145-155°C，進料流速為 65-75mL/ h，保護劑與菌泥的比例為0. 235-0. 245 (L:g)。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株乳酸片球菌PA003(Pediococcus？acidilactici？PA003)與片球菌素同步生產的方法。利用解析附片球菌素、離心將發(fā)酵液中的片球菌素與乳酸片球菌菌體分開，然后經過微濾、超濾、納濾、冷凍干燥獲得片球菌素產品，經噴霧干燥獲得乳酸片球菌菌體。其中乳酸片球菌噴干制劑的活菌數(shù)可達到8.5×1012-8.6×1012CFU/g，存活率為20-25％。片球菌素產品的純化倍數(shù)為2.5％-2.6％以上，收率可達到80％-85％。為實現(xiàn)同時獲得乳酸片球菌制劑及其片球菌素產品提供了依據(jù)。
【IPC分類】C12P21/02, C12R1/01, C12N1/20
【公開號】CN105420318
【申請?zhí)枴緾N201510974531
【發(fā)明人】周志江, 韓燁, 肖華志, 王靜
【申請人】天津大學
【公開日】2016年3月23日
【申請日】2015年12月22日