一種胰蛋白酶的制備方法及提高胰蛋白酶復(fù)溶性的藥物組合物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域，設(shè)計(jì)藥用胰蛋白酶的生化分離技術(shù)。具體地說(shuō)是采用鹽析、多重結(jié)晶結(jié)合透析等技術(shù)來(lái)提取胰蛋白酶。
【背景技術(shù)】
[0002]胰蛋白酶是從牛胰腺或豬胰腺中分離純化得到的一種蛋白酶。它主要的功用有:能使膿、痰液、血凝塊等分解、變稀，易于引流排除，加速創(chuàng)面凈化，促進(jìn)肉芽組織新生，此外還有抗炎癥作用。臨床上用于膿胸、血胸、外科炎癥、潰瘍、創(chuàng)傷性損傷、瘺管等所產(chǎn)生的局部水腫、血腫及膿腫等。噴霧吸入，用于呼吸道疾病。也可用于治療毒蛇咬傷。還常用于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)前對(duì)組織的處理。
[0003]用傳統(tǒng)的方法僅提取胰蛋白酶是相當(dāng)困難的。2006年7月上海阿敏制藥有限公司公開了一種糜胰蛋白酶的制備方法(200610023582.0)，其采用低溫酸提、梯度鹽析、冰水透析、親和層析、乙醇醇析的產(chǎn)品工藝，得到糜胰蛋白酶。2011年1月馬忠仁等申請(qǐng)了一種提取糜胰蛋白酶的方法(200910170682.X)，其采用了 CaC12激活糜胰蛋白酶原成為糜胰蛋白酶的同時(shí)加入飽和度的(NH4)2S04，使其生成硫酸鈣沉淀吸附糜胰蛋白酶，經(jīng)過(guò)洗脫、鹽析、超濾和凍干獲得白色的糜胰蛋白酶的凍干粉末。產(chǎn)品均為糜胰蛋白酶，沒(méi)有單純的胰蛋白酶提取分離純化。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的就是為了生產(chǎn)高質(zhì)量的胰蛋白酶而又降低生產(chǎn)成本，對(duì)傳統(tǒng)工藝加以改造，尤其是參數(shù)的改造，提供了一種提取胰蛋白酶方法。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案是:利用硫酸溶液將胰腺細(xì)胞中含有的酶原提取出來(lái)，然后根據(jù)等電點(diǎn)沉淀的原理，調(diào)節(jié)PH，硫酸銨分級(jí)鹽溶、鹽析將胰蛋白酶原等沉淀析出，再將胰蛋白酶粗品溶解后，經(jīng)鹽溶、鹽析，再用活性胰蛋白酶激活，被激活的酶溶液再經(jīng)結(jié)晶透析、凍干的方法，即可得較高純度的胰蛋白酶，包括如下步驟:
1、胰蛋白酶粗制生產(chǎn)操作:
(1)提取工序:將新鮮的胰臟絞碎成胰漿，稱重。按每千克胰漿加入2~3L的
0.1-0.2mol/L硫酸溶液，浸漬20~28小時(shí)，將浸漬物置濾袋過(guò)濾，濾干后棄去濾渣，留取濾液；
(2)鹽溶工序:浸漬液中加入硫酸銨，達(dá)到30~50%飽和度，靜置10~16小時(shí)，過(guò)濾，留取濾液；
(3)鹽析工序:濾液中加入硫酸銨，達(dá)到50~80%飽和度，靜置10~16小時(shí)，過(guò)濾，留取濾餅；
(4)每克濾餅加入2~5ml的水溶解，重復(fù)上述(2)、(3)操作；
(5)每克濾餅用l~3ml的水溶解，然后每克濾餅中加入0.l~lml的飽和硫酸銨溶液，調(diào)節(jié) pH 至 4.0~6.Ο ；
(6)結(jié)晶工序:溶液在20~30°C溫度中靜置24~72小時(shí)，有針狀糜蛋白酶結(jié)晶析出；離心，調(diào)節(jié)pH至2.0-5.0，每1000ml溶液中加300~400g固體硫酸銨，達(dá)到50~80%飽和度，靜置12~16小時(shí)，抽濾；
(7 )干燥工序:取沉淀物，干燥，S卩得胰蛋白酶粗品。
[0006]2、胰蛋白酶精制生產(chǎn)操作:
(1)投料:稱取胰蛋白酶粗品，按每克胰蛋白酶粗品加2?4ml的水?dāng)嚢枞芙?，調(diào)節(jié)pH至3.0±0.5，以助其溶解，攪拌10?16小時(shí)；計(jì)量溶液體積，按400?500g/L比例加入固體硫酸銨，待其溶解后，靜置沉淀10?16小時(shí)；
(2)鹽溶:將溶液過(guò)濾，稱量濾餅重量，先按每克濾餅加入2~4ml的水，攪拌溶解后，調(diào)節(jié)pH至3.0±0.4，再按每克濾餅加入1?3ml的飽和硫酸銨溶液靜止沉淀10?16小時(shí)；
(3)鹽析:將溶液過(guò)濾，量取濾液體積，加入等體積量的飽和硫酸銨溶液，靜置沉淀10?16小時(shí)；
(4)洗鎂:將上清液棄去，沉淀物真空抽濾，并在濾餅上加入飽和硫酸鎂溶液，靜置1分鐘，抽濾，待濾液開始流出，將漏斗上剩余的硫酸鎂溶液傾去，將濾餅取出稱重，待活化；
(5)活化:稱濾餅重量為A千克，將濾餅溶于3A?5A升的0.001?0.01mol/L鹽酸溶液，另加入0.5?2mol/L氯化鈣溶液A?3A升及pH7.5?8.5硼酸緩沖液4A?6A升，再加入6A?9A升的水，調(diào)節(jié)pH至7.0?8.0，最后每克濾餅加5?15mg的結(jié)晶胰蛋白酶進(jìn)行活化，將溶液置0?10°C中靜置60?80小時(shí)進(jìn)行活化，pH控制在7.0?8.0 ;
(6)除鈣:活化后的溶液，調(diào)節(jié)pH至3.0±0.4，再按200?300g/L加入固體硫酸銨，攪拌溶解，在0?10°C中存放32?60小時(shí)使硫酸鈣沉淀，過(guò)濾，濾液按150?250g/L加入固體硫酸銨，在0?10°C中靜置10?14小時(shí)，過(guò)濾，得濾餅；
(7)結(jié)晶:按每克濾餅加入1?2mlpH8.0?10.0硼酸緩沖液，調(diào)節(jié)pH至8.0±0.4，攪拌均勻，再將溶液裝透析袋，0?10°C時(shí)浸于外透液中，結(jié)晶3?7天;
(8)透析:取出結(jié)晶液過(guò)濾得結(jié)晶物，再按每克結(jié)晶物加入1?3ml水溶解，調(diào)節(jié)pH至
3.0±0.5 ;將溶液透析2?4天，去除雜質(zhì)，每10?14小時(shí)左右透析池?fù)Q水一次，溫度控制在0?10°C ；
(9)凍干:取出透析液，加入少量硅藻土，抽濾，得濾液，調(diào)節(jié)pH至6.0±0.4，進(jìn)凍干機(jī)凍干后得結(jié)晶胰蛋白酶成品。
[0007]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是:
本發(fā)明采用鹽析、多重結(jié)晶結(jié)合透析等技術(shù)來(lái)提取胰蛋白酶，通過(guò)對(duì)傳統(tǒng)工藝的改進(jìn)和創(chuàng)新，不僅生產(chǎn)出了高質(zhì)量的胰蛋白酶，同時(shí)又具有簡(jiǎn)單、低成本等優(yōu)點(diǎn)。
[0008]本發(fā)明已建立起一套規(guī)?；纳a(chǎn)工藝，制備的胰蛋白酶精品效價(jià)高達(dá)2500單位/毫克以上，符合《中國(guó)藥典》(2010版)要求，具有極大的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。
【具體實(shí)施方式】
[0009]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。
[0010]實(shí)施例1
胰蛋白酶粗制生產(chǎn)操作: 1.提取工序:
1.1新鮮的胰臟，用鑷子和剪刀將脂肪結(jié)締組織等除去，置絞碎機(jī)中絞碎，稱重15Kg ;
1.2絞碎物置塑料桶中，用0.125mol/L硫酸溶液30L浸漬24小時(shí)，在浸漬期中每小時(shí)攪拌1次；
1.3將浸漬物置濾袋過(guò)濾，濾渣再用0.125mol/L硫酸溶液15L浸漬1小時(shí)，濾干后棄去濾渣。
[0011]2.鹽溶、鹽析工序:
2.1將兩次浸漬液合并，體積為44.9L，置塑料桶中，每1000ml溶液中加入固體硫酸銨242g，達(dá)到40%飽和度，共加10.866Kg固體硫酸銨，靜置12小時(shí)；
2.2過(guò)濾，留取過(guò)濾液，濾液體積為44L，固體棄去；
2.3在每1000ml清液中加入固體硫酸銨205g，達(dá)到70%飽和度，共用硫酸銨9.020kg，靜置12小時(shí)；
2.4過(guò)濾，留取濾餅，稱重269.2g，棄濾液；
2.5用807.6ml水溶解，再按2.1,2.2,2.3、2.4步驟分次加固體硫酸銨近40%和70%飽和度沉淀；
2.6取70%飽和度沉淀物，稱重178.5g，用267.8ml水溶解，加入89.3ml飽和硫酸銨溶液，并用5mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至5.00 ;
2.7將溶液靜置25°C恒溫箱中48小時(shí)，有針狀的糜蛋白酶粗品結(jié)晶析出；
2.8過(guò)濾，母液用0.25mol/L硫酸調(diào)節(jié)pH至3.0，其體積為328.4ml加入硫酸銨100.8g，靜置12小時(shí)。
[0012]3.干燥工序:
取沉淀物，置真空干燥箱內(nèi)干燥，即得胰蛋白酶粗品，稱重100.0g，即每千克胰臟可得6.67克胰蛋白酶。
[0013]胰蛋白酶精制生產(chǎn)操作:
1.投料
1.1稱取胰蛋白酶粗品100.0g，先用300ml純化水?dāng)嚢枞芙猓?.5mol/L硫酸溶液調(diào)節(jié)pH至3.0，以助其溶解，攪拌12小時(shí)；
1.2計(jì)量溶液體積298.4ml，加入固體硫酸銨140.9g，待其溶解后，靜置沉淀12小時(shí)；
1.3將溶液真空過(guò)濾，稱量濾餅重量96.6g，加純化水289.9ml，攪拌溶解后加2.5mol/L硫酸溶液調(diào)節(jié)pH至3.0，加入飽和硫酸銨溶液193.2ml，靜止沉淀12小時(shí)；
1.4將溶液過(guò)濾，量取濾液體積479.3ml，加入飽和硫酸銨溶液479.3ml，靜置沉淀12小時(shí)；
1.5洗鎂:將上清液棄去，沉淀物真空抽濾，并在濾餅上加入飽和硫酸鎂溶液，靜置1分鐘，抽濾，待濾液開始流出，將漏斗上剩余的硫酸鎂溶液傾去，將濾餅取出稱重93.3g，待活化。
[0014]2.活化
將濾餅溶于373.2ml0.005mol/L鹽酸溶液，另加入lmol/L氯化鈣溶液186.6ml及ρΗ8.0硼酸緩沖液466.5ml，再加入746.4ml純化水，調(diào)節(jié)pH至7.4，最后加933mg活力較高的結(jié)晶胰蛋白酶進(jìn)行活化處理，將溶液在5?10°C中靜置72小時(shí)進(jìn)行活化，第二天測(cè)pH值為7.4ο
[0015]3.除鈣
活化后的溶液用2.5mol/L硫酸溶液調(diào)節(jié)pH至3.1，溶液體積為1873ml，再加入固體硫酸銨455.2g，攪拌溶解，在0?10°C中存放48小時(shí)使硫酸鈣沉淀，過(guò)濾，濾液加入固體硫酸銨369.0g，在0?10°C靜置12小時(shí)，過(guò)濾，得濾餅重量45.6g。
[0016]4.結(jié)晶
濾餅加入pH9.0硼酸緩沖液68.4ml，用2.5mol/L硫酸溶液調(diào)節(jié)pH至8.0，攪拌均勻，再將溶液裝透析袋，5?10°C浸于外透液中，結(jié)晶5天，每2小時(shí)搖包一次。
[0017]5.透析
取出結(jié)晶液過(guò)濾得結(jié)晶物28.7g，加純化水43.lml溶解，用2.5mol/L硫酸調(diào)節(jié)pH至
3.0 ;將溶液裝透析袋，然后掛于透析池中透析3天，去除鹽類雜質(zhì)，每12小時(shí)左右透析池?fù)Q水一次，溫度控制在5?10°C。
[0018]6.凍干
取出透析液，加入少量硅藻土，用布氏漏斗抽濾，得濾液，用5mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至6.0，進(jìn)凍干機(jī)凍干后得結(jié)晶胰蛋白酶成品6.2g，經(jīng)測(cè)定其活性效價(jià)為2600iu/mg。
[0019]實(shí)施例2
胰蛋白酶粗制生產(chǎn)操作:
1.提取工序: