Brd4蛋白抑制劑及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及藥物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及1個化合物及含有該化合物的，藥用組合物 以及它們的醫(yī)療用途，特別是作為BRD4蛋白抑制劑的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，腫瘤成為全球范圍內(nèi)導(dǎo)致人類死亡的主要原因之一。腫瘤普遍具有總體 治愈率低且復(fù)發(fā)率高等特點，因此預(yù)防、治療以及抑制腫瘤復(fù)發(fā)具有重要的科研價值，實現(xiàn) 腫瘤的預(yù)防和治愈具有相當(dāng)?shù)木o迫性和挑戰(zhàn)性。
[0003] 表觀遺傳調(diào)控的異常是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的重要因素之一。最新研究發(fā)現(xiàn)，BRD4蛋白 介導(dǎo)的表觀遺傳異常與癌基因的過表達(dá)密切相關(guān)，并與癌細(xì)胞的生長增殖關(guān)系密切。BRD4 是Bromo and extra C-terminal domain (BET)蛋白家族的一員，由于在抗腫瘤方面的潛在 價值，引起了各大制藥公司和科研機構(gòu)的極大關(guān)注。BET蛋白也稱為表觀遺傳識別蛋白，可 以識別細(xì)胞組蛋白中的表觀遺傳學(xué)信息變化，并傳遞激發(fā)細(xì)胞分裂等的信號。以白血病為 例，血細(xì)胞內(nèi)BET蛋白的基因突變會干擾這種信號傳輸，導(dǎo)致病變細(xì)胞不受控制地分裂，從 而損害人體的組織器官。BRD3/BRD4的Bromodomain編碼區(qū)與NUT(睪丸中的核蛋白）基 因染色質(zhì)易位形成BRD-NUT融合型原癌基因是中線癌的發(fā)病機理所在，也是目前BRD4蛋 白參與腫瘤發(fā)病過程的直接證據(jù)。同時研究也發(fā)現(xiàn)，在造血系統(tǒng)性癌癥包括AML，Burkitt 淋巴瘤，多發(fā)性骨髓瘤以及B細(xì)胞急性淋巴性白血病的模型中，通過干擾BRD4在MYC位點 上的結(jié)合而直接將MYC沉默。由于已知各種MYC的異構(gòu)體是細(xì)胞增殖和存活的重要調(diào)節(jié) 因子，而且MYC是在許多癌癥中過量表達(dá)的一個可能的癌基因，因此Bromodomain拮抗性 也首次為針對MYC驅(qū)動的腫瘤生成提供了一個作用機會。近期還發(fā)現(xiàn)BRD4在病毒基因的 轉(zhuǎn)錄調(diào)控中也扮演了重要角色，并且與病毒瘤的發(fā)病機制存在一定聯(lián)系。這些研究結(jié)果說 明BRD4與多種腫瘤存在密切聯(lián)系，尤其在一些至今難以治愈或者尚無有效治療手段的腫 瘤中具有重要作用，其與腫瘤關(guān)系的研究為腫瘤治療提供了新的策略。通過作用于BRD4蛋 白Bromodomain結(jié)構(gòu)域的小分子化合物，干擾Bromodomain結(jié)構(gòu)域與乙?；嚢彼岬奶禺?性結(jié)合，影響腫瘤細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和其它細(xì)胞過程，可以實現(xiàn)對腫瘤的靶向治療。因此， BRD4蛋白是一個非常有前景的表觀遺傳新革巴點，而作用于BRD4蛋白Bromodomain結(jié)構(gòu)域的 小分子抑制劑在腫瘤研究中也有著廣闊的應(yīng)用前景，而且有可能從中開發(fā)出新型抗腫瘤藥 物。
[0004] 已報道的BRD4蛋白的選擇性抑制劑JQ1和IBET151，其晶體復(fù)合物表明此類 小分子抑制劑正是結(jié)合在Bromodomain結(jié)構(gòu)域的乙酰化賴氨酸識別口袋中，從而阻斷了 Bromodomain結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的乙?；{(diào)控，這些抑制劑在幾種癌癥中的治療作用已經(jīng)得到了 證實。目前，BRD4蛋白的小分子抑制劑結(jié)構(gòu)類型少且選擇性還不夠突出，限制了人們對含 Bromodomain結(jié)構(gòu)域蛋白的生物功能及其在抗腫瘤潛力方面開展深入地研究。此外，現(xiàn)有 BRD4蛋白抑制劑作用效果尚待提高、機制有待進(jìn)一步闡明。因此，尋找高效、高選擇性的新 型小分子BRD4蛋白抑制劑是表觀遺傳抗腫瘤研究的一個熱點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明應(yīng)用虛擬篩選技術(shù)對含有10萬個分子的chembridge分子庫進(jìn)行篩選，依 據(jù)成藥性及經(jīng)驗原則，從篩選結(jié)果中選擇了多個結(jié)構(gòu)系列的目標(biāo)化合物，經(jīng)體外酶活性和 細(xì)胞活性篩選，獲得了 1個結(jié)構(gòu)新穎的BRD4蛋白抑制劑。
[0006] 本發(fā)明的目的在于，提供上述化合物或其藥學(xué)上可接受鹽及其藥用組合物的醫(yī)療 用途，尤其是在預(yù)防、延緩或治療BRD4參與或不參與介導(dǎo)的疾病，特別是腫瘤的藥物中的 用途。
[0007] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供具有如下所示結(jié)構(gòu)的化合物或其藥學(xué)上可接受的 鹽：
[0009] 以上化合物的合成方法可以從已發(fā)表的相關(guān)文獻(xiàn)和專利中獲取。
[0010] 根據(jù)本發(fā)明，藥學(xué)上可接受的鹽包括化合物1與下列酸形成的酸加成鹽：鹽酸、 氫溴酸、硫酸、磷酸、甲磺酸、苯磺酸、對甲苯磺酸、萘磺酸、檸檬酸、酒石酸、乳酸、丙酮酸、乙 酸、馬來酸或琥珀酸、富馬酸、水楊酸、苯基乙酸、杏仁酸。此外還包括無機堿的酸式鹽，如： 含有堿性金屬陽離子、堿土金屬陽離子、銨陽離子鹽。
[0011] 生物活性測試結(jié)果表明，本發(fā)明所提供化合物具有BRD4抑制效果，同時對腫瘤細(xì) 胞株的生長有一定的抑制作用。本發(fā)明化合物可用于治療各種實質(zhì)性器官癌，其中包括黑 色素瘤、肝癌、腎癌、肺癌、前列腺癌、甲狀腺癌、皮膚癌、結(jié)腸直腸癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺 癌、睪丸癌、骨癌、腦癌、食管癌、胃腸道癌、軟組織瘤、血癌、淋巴癌等，其中可以是由BRD4 介導(dǎo)的癌癥，也可以是不依賴于上述機制的癌癥。因此，本發(fā)明提出，本發(fā)明化合物可用于 抗癌藥物的制備。
【具體實施方式】
[0012] 實施例
[0013] 化合物1對BRD4蛋白結(jié)合能力和對腫瘤細(xì)胞株抑制活性的實驗研究
[0014] 1.BRD4蛋白結(jié)合能力測試
[0015] 1)實驗材料及設(shè)備：BRD4蛋白，HEPES，NaCl，熒光探針SYPRO 0range，96孔板， Mx3005p Real Time PCR machine(Stratagene)〇
[0016] 2)實驗原理：所得到的化合物均采取Differential Scanning Fluorimetry法 (DSF，也稱Thermal Shift Assay法）對BRD4蛋白的結(jié)合能力活性進(jìn)行測定，并與陽性對 照藥比較，篩選出活性相對較好的化合物。DSF法是基于受體在結(jié)合配體前后的熱力學(xué)量變 化來評估配體的結(jié)合能力的，是一種半定量的分子篩選方法。該方法具有快速、簡單、高效、 靈敏、技術(shù)路線可靠和無污染等優(yōu)點，已在碎片和小分子化合物篩選方面有著廣泛應(yīng)用，是 比較合適的BRD4抑制劑活性測試方法。
[0017] 3)實驗步驟：DSF 法在 Mx3005p Real Time PCR machine (Stratagene)設(shè)備上進(jìn) 行試驗。將BRD4蛋白加入含有ΙΟηΜ HEPES、500nM NaCl、PH值為7. 5的緩沖溶液中，在 96孔板中最終配成2 μ Μ/20 μ 1的溶液。待測化合物以10 μ Μ的濃度加入溶液中，同時以 1 : 1000的比例加入熒光探針SYPRO Orange。SYPRO Orange的激發(fā)光和發(fā)射光波長分別 設(shè)置在465nm和590nm處。溫度從25°C至96°C每分鐘升高:TC，并在每個間隔讀取熒光讀 數(shù)。然后根據(jù)熒光強度和溫度變化之間的理論換算公式，通過數(shù)理統(tǒng)計法擬合計算得到蛋 白在結(jié)合配體前后的溫度差，作為評估結(jié)合能力的方法。
[0018] 4)實驗結(jié)果
[0020] (表中化合物代號對應(yīng)于前面的化合物代號）
[0021] 2.體外腫瘤細(xì)胞抑制活性測試
[0022] 本發(fā)明化合物在體外對腫瘤細(xì)胞株的抑制活性。
[0023] 用MTT法測定對非小細(xì)胞肺癌NCI-H522，乳腺癌細(xì)胞株MCF7，白血病細(xì)胞株 HL-60,腎癌細(xì)胞株U0-31等腫瘤細(xì)胞株的抑制作用。
[0024] MTT法：利用活細(xì)胞線粒體中存在與NADP相關(guān)的脫氫酶能使外源性的MTT還原成 難溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶物（Formazan)，并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。再用二甲基亞 砜（DMS0)或三聯(lián)液（10% SDS-5%異丁醇-0.01m〇l/L HCL)溶解細(xì)胞中的紫色結(jié)晶物，用 酶聯(lián)免疫檢測儀在570nm波長處測定其0D值間接反應(yīng)其活細(xì)胞量。
[0025] 具體方法：將處于細(xì)胞對數(shù)生長期的要進(jìn)行實驗的腫瘤細(xì)胞按一定的細(xì)胞量接種 于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)24h后加入所篩的樣品（懸浮細(xì)胞接板后可直接加），細(xì)胞在37°C、 5 % C02條件下繼續(xù)培養(yǎng)48小時后，加入MTT繼續(xù)培養(yǎng)4小時，用DMS0溶解結(jié)晶，在酶標(biāo)儀 下進(jìn)行檢測。
[0026] 化合物1的體外細(xì)胞測試結(jié)果如下表所示：
[0028] (表中化合物代號對應(yīng)于前面的化合物代號）
[0029] 3.結(jié)論
[0030] BRD4蛋白體外活性測試表明，本發(fā)明所提供的化合物具有顯著的BRD4蛋白結(jié)合 能力，同時具有體外腫瘤細(xì)胞株的抑制活性。由于BRD4在腫瘤細(xì)胞生長增殖中具有關(guān)鍵性 作用，且有體外腫瘤細(xì)胞抑制活性實驗支持，本發(fā)明所提供的化合物可以用于預(yù)防或治療 與BRD4抑制劑有關(guān)的疾病的藥物中，尤其是腫瘤的藥物中。
【主權(quán)項】
1. 化合物1或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備用于預(yù)防或治療與BRD4蛋白抑制劑有關(guān)的 疾病的藥物中的用途。2. -種藥物組合物，其中含有權(quán)利要求1所包含化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽和藥學(xué) 上可接受的載體。3. 權(quán)利要求1的用途，其中與BRD4抑制劑有關(guān)的疾病是急性白血病、非小細(xì)胞肺癌、黑 色素瘤、肝癌、腎癌、前列腺癌、甲狀腺癌、皮膚癌、結(jié)腸直腸癌、膜腺癌、卵巢癌、乳腺癌、骨 髓增生異常綜合癥、食管癌、胃腸道癌或間皮瘤。4. 權(quán)利要求1的用途，其中藥學(xué)上可接受的鹽是化合物與鹽酸、氨漠酸、硫酸、磯酸、甲 礙酸、苯礙酸、對甲苯礙酸、蔡礙酸、巧樣酸、酒石酸、乳酸、丙麗酸、己酸、馬來酸或玻巧酸、 富馬酸、水楊酸、苯基己酸、杏仁酸等形成的酸加成鹽。
【專利摘要】本發(fā)明涉及藥物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及化合物1和含有該化合物的藥用組合物的醫(yī)療用途，特別是作為BRD4蛋白抑制劑的用途。
【IPC分類】A61P35/02, A61K31/4162, C07D491/048, A61P35/00
【公開號】CN105315290
【申請?zhí)枴緾N201410298478
【發(fā)明人】冉挺, 陸旖, 張智敏
【申請人】中國藥科大學(xué)
【公開日】2016年2月10日
【申請日】2014年6月25日