一種抗齲齒菌抗體的制備方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種齲齒抗體的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]變異鏈球菌被公認(rèn)為是齲齒主要的致齲菌。目前對(duì)變異鏈球菌進(jìn)行被動(dòng)免疫的措施有兩種，一是將單一的或混合的變異鏈球菌菌體蛋白作抗原，免疫馬牛羊兔等哺乳類動(dòng)物，從動(dòng)物血清中提取抗體，進(jìn)行被動(dòng)免疫防齲；二是將變異鏈球菌菌體中的葡糖基轉(zhuǎn)移酶作為抗原，免疫脯乳類動(dòng)物，從血清中提取抗體，進(jìn)行被動(dòng)免疫防齲。但現(xiàn)有的抗體制備技術(shù)存在以下問(wèn)題:(1)抗體制備成本過(guò)高，特別是用葡糖基轉(zhuǎn)移酶作抗原時(shí)，抗原提取困難；(2)抗體的效價(jià)較低，現(xiàn)有制備技術(shù)抗體效價(jià)最高也只有1:320。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供一種抗齲齒菌抗體IgG的制備方法，使抗體的生產(chǎn)成本降低，抗體效價(jià)提高。本發(fā)明的另一目的，是抗齲齒菌抗體IgG的應(yīng)用，提供以本發(fā)明制備的抗變異鏈球菌抗體IgG和抗菌劑作為有效成份的防止齲齒的組合物。
[0004]采用的技術(shù)方案是:
一種抗齲齒菌抗體的制備方法，包括下述步驟:
1、取C型和d型兩種變異鏈球菌，分別在BHI培養(yǎng)基或TTY培養(yǎng)基中培養(yǎng)2-3天；將培養(yǎng)好的兩種變異鏈球菌分別進(jìn)行離心處理，收集菌體，用pH值為6-7、濃度為0.05-0.2M的磷酸緩沖生理鹽水洗菌體4-6次，50-65°C的溫度下，加熱25-35分鐘，進(jìn)行熱處理，得到c型變異鏈球菌液和d型變異鏈球菌液。
[0005]將c型變異鏈球菌液和d型變異鏈球菌液，按1-2:1的比例混合，并加入與上述兩液體之總量等量的福氏佐劑，用高速勻漿器處理，制得菌體抗原。
[0006]c型變異鏈球菌液，d型變異鏈球菌液和其它型菌液的混合比例最好為1:1:1。
[0007]每次取本發(fā)明的變異鏈球菌抗原1.0ml，對(duì)脯乳類動(dòng)物進(jìn)行淋巴結(jié)和背部皮下多點(diǎn)注射，注射三次，每隔三周一次；經(jīng)檢測(cè)效價(jià)合格后采集血清。取免疫血清攪拌下加入適量鹽水稀釋，調(diào)節(jié)pH值至7.5-8.5，加入等量飽和硫酸銨溶液，在2-8°C溫度下靜置20-30小時(shí)，高速離心20-30分鐘，取其沉淀，經(jīng)復(fù)融超濾濃縮除鹽、除菌后冷凍干燥，即得抗齲齒菌抗體IgG粗提物(粗品)。
[0008]
3、將抗齲齒菌抗體IgG粗提物離心純化，離心純化速度為5000-2500rpm，離心次數(shù)為2-5次，再經(jīng)DEAE-S印hadex A50層析柱層析。用含0.03_0.1M NaCl的磷酸緩沖液進(jìn)行連續(xù)或分段梯度洗脫，洗脫液磷酸緩沖液濃度為0.003-0.02M。再用凝膠過(guò)濾柱層析洗脫液磷酸緩沖液濃度為0.01-0.2M，所含NaCl的濃度為0.1-0.5M。親和層析洗脫液濃度為0.1-0.5M。
[0009]自動(dòng)收集洗脫液；收集各蛋白洗脫峰，并以ELISA檢測(cè)各蛋白的抗體活性；收集留取有抗體活性的蛋白洗脫液，調(diào)節(jié)蛋白含量為20mg/ml。
[0010]將前一步驟所得的蛋白洗脫液再經(jīng)S印hadex G200凝膠柱層析。用含0.05_0.2MNaCl的磷酸緩沖液進(jìn)行連續(xù)或分段梯度洗脫，自動(dòng)收集洗脫液；收集各蛋白洗脫峰，并以ELISA檢測(cè)各蛋白的抗體活性；收集留取有抗體活性的蛋白洗脫液，0.22 μ膜過(guò)濾除菌，冷凍干燥，即得抗齲齒菌抗體IgG純品。
[0011]本發(fā)明制備的抗變異鏈球菌抗體IgG用于抗齲齒菌產(chǎn)品的添加量為每5-20g/Kg。其產(chǎn)品為以抗齲齒菌抗體IgG為有效成份的防齲齒的組合物。
[0012]本發(fā)明選擇c型和d型變異鏈球菌作為抗原菌體，是基于以下研究結(jié)果考慮的。
[0013]變異鏈球菌按其血清分型，有a、b、c、d、e、f、g、h等血清型，但是對(duì)口腔中變異鏈球菌的檢測(cè)表明，c型菌株約占60-90%，d型菌株約占10%，其它幾種血清型菌的檢出率很低。所以，c型和d型變異鏈球菌是引起齲齒的主要血清型菌，選擇c型和d型變異鏈球菌作為主要抗原菌體，既避免了多種血清型混合菌作抗原時(shí)，主要血清型菌效用降低的問(wèn)題；也避免了當(dāng)單一血清型菌作抗原時(shí)，交叉免疫反應(yīng)范圍偏窄的問(wèn)題。
[0014]另外，研究表明，從口腔變異鏈球菌的細(xì)胞壁提取出A和B蛋白抗原，其中c型變異鏈球菌的細(xì)胞壁含有A和B蛋白抗原，b型變異鏈球菌僅含有A蛋白抗原，a、d、e、f和g型變異鏈球菌則只含B蛋白抗原，所以，以c型菌和d型菌作為抗原，保證了抗體具有很大范圍的交叉反應(yīng)。
[0015]經(jīng)檢測(cè)表明本發(fā)明抗體IgG達(dá)到了 PAGE純，經(jīng)分子量測(cè)定，抗體IgG分子量為160, 000道爾頓。
[0016]抗體IgG理化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明抗體IgG在65°C條件下，90分鐘內(nèi)仍保持有活性；在pH4.0-11.0的環(huán)境中，37°C、8小時(shí)候活性無(wú)明顯變化，但在pH2.0和pH12.0時(shí)活性迅速下降，并且很快失活；本發(fā)明抗體IgG具有較大的抗?jié)B透壓性質(zhì)，可耐受40%的蔗糖滲透壓。
[0017]抗體IgG間接血凝抑制實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明抗體IgG能有效地抑制變異鏈球菌凝聚，其效價(jià)高達(dá)1:512 ;抗體IgG抑制變異鏈球菌粘附實(shí)驗(yàn)觀察表明，本發(fā)明的抗體IgG稀釋到1:8，仍具有明顯的抑制變異鏈球菌粘附作用；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，用本發(fā)明抗體IgG喂養(yǎng)感染變異鏈球菌的大白鼠，能有效地防止齲齒的發(fā)生，檢測(cè)表明菌斑中變異鏈球菌數(shù)下降了70-80%ο
[0018]本發(fā)明所述的防齲齒組合物是指以本發(fā)明抗體IgG和山梨酸鉀、苯甲酸鈉兩種抗菌劑中至少一種作為有效成份的組合物。這種防齲齒組合物，可以是牙膏、口含液、漱口水等口腔用產(chǎn)品，也可以是口香糖、巧克力、雪糕、冰激凌等食物。本發(fā)明抗體IgG的加入量通常為0.05-0.2%，山梨酸鉀、苯甲酸鈉的加入量通常為0.01-0.02%。
[0019]本發(fā)明的防齲齒組合物為液體狀態(tài)時(shí)，可將其裝入小型攜帶式噴霧罐中噴霧使用。
[0020]本發(fā)明抗體IgG還可與牙齒著色除去劑、預(yù)防口臭劑等蛀牙預(yù)防劑配合，制成各種防治產(chǎn)品。也可以加入到各種口腔清新劑中，增加口腔清新劑的防齲齒功能。
[0021]本發(fā)明抗體IgG制備技術(shù)生產(chǎn)成本低，抗體效價(jià)高，抗?jié)B透壓強(qiáng)，對(duì)變異鏈球菌具有較強(qiáng)的免疫活性，且對(duì)變異鏈球菌具有很大范圍的交叉反應(yīng)。本發(fā)明的防齲齒組合物，具有抗體IgG加量小，使用安全，防治效果好等特點(diǎn)，能有效地防止齲齒的發(fā)生。
[0022]本發(fā)明將通過(guò)以下實(shí)施例作進(jìn)一步的描述。
[0023]—、抗體的制備。
[0024]實(shí)施例1用BHI培養(yǎng)基，在37°C溫度條件下，分別靜置培養(yǎng)c型和d型變異鏈球菌48小時(shí)，將培養(yǎng)后的c型和d型變異鏈球菌分別用4000rpm離心10分鐘，收集菌體；用pH值為6.0、濃度為0.2M的磷酸緩沖生理鹽水洗菌體5次，50°C、25分鐘加熱處理，分別制得c型變異鏈球菌液(20億/ml)和d型變異鏈球菌液(20億/ml);取c型變異鏈球菌液和d型變異鏈球菌液，按2:1的比例混合，得變異鏈球菌混合液(20億/ml )，然后加入與變異鏈球菌混合液等量的福氏佐劑，用高速勻漿器處理，制得變異鏈球菌菌體抗原。
[0025]每次取菌體抗原1.0ml，對(duì)動(dòng)物進(jìn)行皮下注射，免疫三次，每隔三周一次。
[0026]第三次免疫脯乳類動(dòng)物20天后開(kāi)始收集抗血清用鹽水稀釋，調(diào)節(jié)pH值至8.0，攪拌下加入等量飽和硫酸銨溶液置2-8°C靜置24小時(shí)，8000rpm離心20分鐘，取沉淀，經(jīng)超濾除鹽、濃縮、除菌后冷凍干燥，制得抗齲齒菌抗體IgG粗提物。
[0027]將抗齲齒菌抗體IgG粗提物經(jīng)DEAE-S印hadex A50層析柱層析。柱床2.5 X 35cm，加樣3.0ml(10mg/ml)，用含0.07M NaCl的0.01Μ、ρΗ7.0磷酸緩沖液進(jìn)行洗脫，流速20ml/h，洗脫液按每管5.0ml自動(dòng)收集；收集各蛋白洗脫峰，并以ELISA檢測(cè)各蛋白的抗體活性；收集留取有抗體活性的蛋白洗脫液，調(diào)節(jié)蛋白含量為20mg/ml。繼而將該液進(jìn)一步經(jīng)SephadexG200凝膠柱層析。柱床2.0X65cm，加樣1.5ml，用含0.1M NaCl的0.01Μ、ρΗ7.0磷酸緩沖液進(jìn)行洗脫，流速8.0ml/h，洗脫液按每管5.0ml自動(dòng)收集，收集各蛋白洗脫峰，并以ELISA檢測(cè)各蛋白的抗體活性。收集留取有抗體活性的蛋白洗脫液，0.22 μ膜過(guò)濾除菌，冷凍干燥，即得抗齲齒菌抗體IgG純品。
[0028]二、防齲齒組合物產(chǎn)品的制備。
[0029]實(shí)施例2、抗體IgG 口含液的制備。取本發(fā)明抗體IgG2.0g，山梨酸鉀0.15g，苯甲酸鈉0.15g，阿斯巴甜0.8g，薄荷腦0.15g，蘋果香精0.4ml。將薄荷腦加入100ml的蒸餾水中，60°C溶化；其它固體成份各溶解于450ml的蒸餾水中，然后將各種溶解的液體均勻混合，用蒸餾水定容到1000ml。
[0030]實(shí)施例3、抗體IgG 口香糖的