專利名稱：一種檢測幽門螺桿菌抗體的試劑裝置及其方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明申請涉及一種檢測幽門螺桿菌抗體的試劑裝置及其方法，屬于臨床免疫學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
幽門螺桿菌(HP)是人類胃粘膜內(nèi)的一種螺旋狀的革蘭陰性細菌。HP直徑約
0.85 μ m,長度約2.9 μ m，菌體光滑，呈S形，有4 6條鞭毛，易粘附在幽門附近的胃竇部及胃體部的粘膜上，位于胃粘液的深層，不與胃酸直接接觸。HP是人類常見的致病菌之一，在人與人之間通過經(jīng)口途徑傳播，具有活力的HP在河水中可存活I(lǐng)周，是慢性胃炎消化性潰瘍和非潰瘍性消化不良的重要致病因素。幽門螺桿菌受矚目的原因，是因為它與胃潰瘍，十二指腸潰瘍，以及胃炎有極為密切的關(guān)系。它在人體中只能寄居在胃黏膜的上皮，絕大多數(shù)的感染只造成無癥狀的慢性胃炎，只有少數(shù)毒性較強的菌株會產(chǎn)生胃潰瘍或十二指腸潰瘍。新近的研究表明，幾乎全部的十二指腸潰瘍(95 100% )以及人多數(shù)的胃潰瘍(70 80% )都與幽門螺桿菌有關(guān)。幽門螺桿菌除了與胃部疾病有關(guān)之外，還與肝硬化、膽石癥、高血壓、冠心病、糖尿病、缺鐵性貧血、腦血栓形成、偏頭痛、蕁麻疹等疾病關(guān)系密切。幽門螺桿菌菌體表面的鞭毛以及分泌的多種抗原組分均可激發(fā)宿主的免疫應(yīng)答而誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生，檢測血清中特異性抗體可以反映病原體的感染情況。幽門螺桿菌全身性抗體(即血清抗體)主要為IgG和IgA，IgM極為少見。血清抗體可反映機體對幽門螺桿菌的感染及免疫應(yīng)答能力，檢測抗體十分必要。臨床檢測幽門螺桿菌抗體的常見方法包括金標法、免疫印跡法、酶聯(lián)免疫吸附試驗的方法，但這些方法都存在著不足之處。一、金標法金標法是以膠體金作為示蹤標志物應(yīng)用于抗原抗體的一種新型的免疫標記技術(shù)。根據(jù)膠體金的一些物理性狀，如高電子密度、顆粒大小、形狀及顏色反應(yīng)，加上結(jié)合物的免疫和生物學(xué)特性，膠體金已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于免疫學(xué)、組織學(xué)、病理學(xué)和細胞生物學(xué)等領(lǐng)域。該方法快速、敏感性高，但其特異性差，假陽性率較高，且只能做定性檢測，不能定量。二、免疫印跡法免疫印跡是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，然后利用抗體進行檢測。對已知表達蛋白，可用相應(yīng)抗體作為一抗進行檢測，對新基因的表達產(chǎn)物，可通過融合部分的抗體檢測。其不足之處在于:(I)只能進行定性和半定量分析，無法得出被檢物質(zhì)具體的量。(2)操作步驟繁瑣，試驗用時較長。(3)檢測的靈敏度還有待提聞。三、酶聯(lián)免疫吸附法
酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)被廣泛應(yīng)用于檢測幽門螺桿菌抗體，但該方法也存在著下述的不足之處:(I)使用12X8型、6X8型、8X12型或整板型96孔專用微孔板作為抗原包被用具和反應(yīng)容器，在使用時只能分成12批次、6批次、8批次或整板一次使用，無法進行獨立的、單人份的檢測；(2)定量測定所用的試劑種類較多，每一種檢測試劑都要用試劑瓶來盛裝，并且每使用一種試劑時都需要更換吸液嘴來分別加注到微孔板的微孔中，不但試劑瓶種類多，力口注試劑的操作也極為繁瑣；(3)缺少對檢測信息的相應(yīng)標注，只能通過查看試劑盒外包裝盒的標識才能了解或知悉檢測試劑的生產(chǎn)批號及有效期信息，而且所知悉的信息在檢測過程中不受控，具有很大的隨意性；(4)檢測試劑在檢測過程中處于開放的空間，容易引起各種試劑之間的交叉污染而影響檢測結(jié)果的準確性；(5)檢測過程多采用手工操作，試劑或樣本的加量不很精確，操作過程極為繁瑣和復(fù)雜，容易發(fā)生操作差錯，檢測結(jié)果的準確度和精密度較差；(6)在檢測項目成套試劑的數(shù)量配置及使用上均為項目數(shù)X48/96人份，如果需要檢測10個項目，則試劑的配置及使用數(shù)須為10X48/96人份，如果只有一份樣本需要檢測10個不同的項目，也需要配置10X48/96人份的試劑，存在著不夠經(jīng)濟合理的缺點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明專利申請即是針對目前對于幽門螺桿菌抗體的檢測中存在的上述不足之處，提供一種能夠進行獨立單人份檢測的試劑裝置及其檢測方法。本發(fā)明專利申請基于酶聯(lián)免疫檢測的原理來實現(xiàn)幽門螺桿菌抗體的檢測，是一種獨立的、單人份的、一次性的檢驗方法；進一步的，本發(fā)明申請還提供了與該方法配套的相應(yīng)的試劑裝置，該試劑裝置將幽門螺桿菌抗體酶聯(lián)免疫檢測所需要的多種試劑盛裝在一個獨立的、多孔結(jié)構(gòu)的試劑裝置內(nèi)，通過分步加注移棄完成檢測步驟；進一步的，所述的試劑裝置還可以通過專用的免疫分析儀進行相應(yīng)的全自動檢測。本發(fā)明申請的目的之一是提供一種檢測幽門螺桿菌抗體的試劑裝置，該目的是通過下述的技術(shù)方案實現(xiàn)的:具體來說，本發(fā)明申請所述的檢測幽門螺桿菌抗體的試劑裝置為長條狀，包括具有八個孔位的基體和位于基體一端的手柄，八個孔位的排列順序從近手柄端開始依次為樣本孔、輔劑孔、酶結(jié)合物孔、底物孔、終止液孔、稀釋液孔、反應(yīng)孔和稀釋孔，樣本孔內(nèi)盛有待測樣本，輔劑孔供檢測有需要時加入輔助試劑使用，酶結(jié)合物孔內(nèi)盛有酶結(jié)合物溶液，底物孔內(nèi)盛有底物溶液，終止液孔內(nèi)盛有終止液，稀釋液孔內(nèi)盛有稀釋液，反應(yīng)孔為平底且具有高的光通透性，孔內(nèi)包被有幽門螺桿菌抗原，并作為反應(yīng)容器加注待測的液體樣本和檢測試劑及洗滌液，反應(yīng)終止后進行吸光度測定，稀釋孔作為樣本稀釋容器，供稀釋樣本時用。進一步的，所述的試劑裝置中，當檢測幽門螺桿菌抗體IgG時，輔劑孔不加入任何試劑，當檢測幽門螺桿菌抗體IgA時，吸附劑加入輔劑孔內(nèi)或與稀釋液一起加入稀釋液孔中。
進一步的，所述的試劑裝置中，輔劑孔、酶結(jié)合物孔、底物孔、終止液孔和稀釋液孔上覆蓋有密封薄膜，該密封薄膜主要起到在運輸和移動的過程中防止液體溢出的作用，另夕卜，也起到防塵防污染及增強穩(wěn)定性的作用。進一步的，所述的手柄上粘貼有條形碼，該條形碼標識有幽門螺桿菌抗體檢測試劑及分析裝置的相關(guān)信息。更進一步的，所述的信息包括檢測項目代碼、檢測試劑生產(chǎn)批號、試劑有效期、定量檢測標準曲線參數(shù)/定性校正系數(shù)、酶聯(lián)免疫反應(yīng)類型、試劑及分析裝置的序列號。進一步的，所述試劑裝置還包括若干個支撐柱，所述的支撐柱位于所述試劑裝置基體的下面，相鄰支撐柱之間間隔有一個以上的孔位，支撐柱的作用是為了加強基體的機械強度及平衡性。進一步的，所述試劑裝置中反應(yīng)孔由外孔和內(nèi)孔構(gòu)成，外孔的底部開有底孔，內(nèi)孔穿過底孔且與底孔緊配合，外孔和內(nèi)孔之間留有防溢腔，防溢腔的作用是在反應(yīng)過程中，如果液體溢出，可以留在腔內(nèi)，防止污染儀器和其他試劑裝置。更進一步的，所述試劑裝置中反應(yīng)孔的內(nèi)孔包被的幽門螺桿菌抗原包括純化且滅活的幽門螺桿菌或重組的幽門螺桿菌，重組的幽門螺桿菌包括但不僅限于幽門螺桿菌粘附素BabA重組蛋白、幽門螺桿菌oipA DNA重組質(zhì)粒蛋白。應(yīng)該明確的是，本發(fā)明申請中，所述試劑裝置中各孔位的大小、形狀并不加以限制，例如各孔位的開放口緣可為方形或圓形，其剖面的形狀也可以是方形、“U”型、或“V”型，但對于反應(yīng)孔來說，為了獲得較好的光通透性，底部應(yīng)為平底。進一步的，所述的樣本孔內(nèi)加入的樣本為待測血清或血漿，加入的量根據(jù)樣本孔的大小和檢測需要稀釋的倍數(shù)來確定。所述的輔劑孔是在必要的時候加入輔助試劑之用，例如吸附劑、中和劑、抑制劑、緩沖液等。如當檢測幽門螺桿菌抗體IgA時，吸附劑加入輔劑孔內(nèi)或與稀釋液一起加入稀釋液孔中，其主要成份為抗人IgG抗體或人葡萄球菌蛋白A(SPA)，以去除檢測過程中特異性IgG及類風濕因子等其他物質(zhì)對檢測結(jié)果的干擾。所述的酶結(jié)合物孔內(nèi)加入酶結(jié)合物溶液，主要成份為辣根過氧化物酶標記的抗人IgG或IgA抗體,堿性磷酸酶標記的抗人IgG或IgA抗體,葡萄糖氧化物酶標記的抗人IgA或IgA抗體,或β -半乳糖苷酶標記的抗人IgG或IgA抗體。所述的底物孔中加入的底物溶液主要成份為TMB、OPD或ABTS。TMB作為一種新型安全的色原試劑，已逐步取代強致癌物聯(lián)苯胺和其他致癌性的聯(lián)苯胺衍生物，應(yīng)用于臨床化驗、法醫(yī)檢驗、刑事偵破及環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域，尤其是在臨床生化檢驗方面，TMB作為過氧化物酶的新底物，在酶免疫分析法(EIA)和酶聯(lián)免疫吸附檢驗法(ELISA)中獲得了廣泛的應(yīng)用。所述的終止液孔中加入的終止液主要成份為濃度是0.1 0.5Μ的硫酸或鹽酸溶液。所述的稀釋液孔中加入的稀釋液主要成份為磷酸鹽緩沖液、Tris緩沖液、硼酸鹽緩沖液或碳酸鹽緩沖液，并含一定濃度的牛血清白蛋白、疊氮化鈉等組份，用于排除樣本中小分子物質(zhì)的非特異性反應(yīng)的干擾及增加穩(wěn)定性。本發(fā)明申請的另一個目的是提供利用上述試劑裝置進行幽門螺桿菌抗體的檢測方法，所述的方法包括如下的步驟:I)在所述的樣本孔中加入未稀釋的樣本；2)從稀釋液孔中吸取稀釋液加入稀釋孔中；3)移除稀釋液孔中的剩余液體，從稀釋孔中吸取部分液體回稀釋液孔；4)從樣本孔中吸取樣本加入稀釋液孔中，將樣本進行稀釋；5)從稀釋液孔中吸取液體加入稀釋孔中，將樣本進行進一步的稀釋；6)當檢測幽門螺桿菌抗體IgA且輔劑孔內(nèi)加入吸附劑時，從輔劑孔吸取液體加入反應(yīng)孔中，其他情況則不需要此步驟；7)從稀釋孔中吸取液體加入反應(yīng)孔中，25 37°C的條件下，孵育30 60min ；8)用洗滌液對反應(yīng)孔進行3 5次洗滌后移除液體；9)從酶結(jié)合物孔中吸取酶結(jié)合物溶液加入反應(yīng)孔中，25 37°C的條件下，反應(yīng)30 60min后移除液體；10)重復(fù)步驟8);11)從底物孔中吸取底物溶液加入反應(yīng)孔中，25 37°C的條件下，反應(yīng)10 20min ；12)從終止液孔中吸取終止液加入反應(yīng)孔中，I IOmin內(nèi)于450nm讀取OD值，或選擇雙波長法測定，波長范圍在620nm 690nm。進一步的，所述的方法包括如下的步驟:I)在所述的樣本孔中加入未稀釋的樣本，體積至少為樣本孔容量的1/4 ；2)從稀釋液孔中吸取稀釋液加入稀釋孔中，吸取的量為孔內(nèi)液體總量的7/10以上；3)移除稀釋液孔中的剩余液體，根據(jù)預(yù)期稀釋倍數(shù)從稀釋孔中吸取部分液體回稀釋液孔；4)從樣本孔中吸取樣本加入稀釋液孔中，將樣本進行稀釋，稀釋倍數(shù)為I 10倍;5)從稀釋液孔中吸取液體加入稀釋孔中，將樣本進行進一步的稀釋，稀釋倍數(shù)為I 100倍；6)當檢測幽門螺桿菌抗體IgA且輔劑孔內(nèi)加入吸附劑時，從輔劑孔吸取液體加入反應(yīng)孔中，其他情況則不需要此步驟；7)從稀釋孔中吸取液體加入反應(yīng)孔中，25 37°C的條件下，孵育30 60min ；8)用洗滌液對反應(yīng)孔進行3 5次洗滌后移除液體；9)從酶結(jié)合物孔中吸取酶結(jié)合物溶液加入反應(yīng)孔中，25 37°C的條件下，反應(yīng)30 60min后移除液體；10)重復(fù)步驟8)；11)從底物孔中吸取底物溶液加入反應(yīng)孔中，25 37°C的條件下，反應(yīng)10 20min ；12)從終止液孔中吸取終止液加入反應(yīng)孔中，I IOmin內(nèi)于450nm讀取OD值，或選擇雙波長法測定，波長范圍在620nm 690nm。更進一步的，所述的方法包括如下的步驟:
I)在所述的樣本孔中加入樣本80 150 μ L ;2)用精密加液器從稀釋液孔中吸取360 μ L液體到稀釋孔中；3)移除稀釋液孔中的剩余液體，從稀釋孔中吸取180 μ L液體回稀釋液孔；4)用精密加液器從樣本孔中吸取20 μ L液體到稀釋液孔中，樣本10倍稀釋；5)用精密加液器從稀釋液孔中吸取液體20 μ L到稀釋孔中，樣本100倍稀釋；6)當檢測幽門螺桿菌抗體IgA且輔劑孔內(nèi)加入吸附劑時，用精密加液器從輔劑孔吸取液體30 μ L加入反應(yīng)孔中，其他情況則不需要此步驟；7)用精密加液器從稀釋液孔中吸取液體IOOyL到反應(yīng)孔中，25 37°C下，孵育60min后移除液體；8)用洗滌液對反應(yīng)孔進行3 5次洗滌后移除液體；9)用精密加液器從酶結(jié)合物孔中吸取100 μ L辣根過氧化物酶標記的抗體酶結(jié)合物溶液至反應(yīng)孔進行反應(yīng)，25 37°C下，反應(yīng)30min后移除液體；10)重復(fù)步驟8)；11)用精密加液器從底物孔中吸取100 μ L的TMB底物溶液至反應(yīng)孔中反應(yīng)10 15min ；12)用精密加液器從終止液孔中吸取100 μ L的終止液加注至反應(yīng)孔中，I IOmin內(nèi)于450nm和630nm雙波長條件下進行檢測，讀取OD值。所述的洗滌液包括PBST溶液，PBST溶液是指PBS溶液加上Tween-20，PBS溶液是指磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffer Solution),滲透壓近似于生理條件,又有很強的pH緩沖能力，常用來洗細胞和作為細胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)液，而Tween-20為一種非離子表面活性劑，對細胞生長可產(chǎn)生影響，Tween-20有復(fù)性抗原的作用，可提高特異性的識別能力。本發(fā)明申請所述測定幽門螺桿菌抗體的試劑裝置及其方法，不但具有其他檢測方法所具有的特異性強、靈敏度高，準確性好、成本較低、使用要求不高、操作較為簡便、獲得檢測結(jié)果時間短、應(yīng)用廣泛等的優(yōu)點，而且解決了其他檢測方法的諸多不足，具體體現(xiàn)在以下幾個方面:1.所述的檢測方法運用酶聯(lián)免疫分析原理，利用特定的分析儀器，采用配套專用的檢測試劑盒及分析試劑裝置，自動實現(xiàn)幽門螺桿菌抗體定量測定，是一種全新的、適用的、實用的、高效的、快速的檢測幽門螺桿菌抗體的方案；2.它是一種獨立的、單人份的檢測試劑及分析裝置，無需像通用ELISA法那樣使用12X8型、6X8型、8X 12型或整板型96孔專用酶聯(lián)免疫微孔板作為抗原包被用品和反應(yīng)容器，在使用時只要有一份樣本即可進行對應(yīng)項目的檢測而無試劑的浪費，如果樣本的數(shù)量超過一份，按實際樣本數(shù)使用該試劑及分析裝置即可；3.它將每一檢測必需的試劑盛裝在一個分析試劑裝置的試劑孔位內(nèi)，而無須將檢測試劑分別用不同的試劑瓶來盛裝，不但操作極為簡便，而且不容易造成操作差錯，從而保證檢測結(jié)果的正確性；4.它對每一個分析試劑裝置都有一個專用條形碼，條形碼的數(shù)值包含檢測所對應(yīng)的檢測項目代碼、檢測試劑生產(chǎn)批號、試劑有效期、定量測定標準曲線參數(shù)、具體的酶聯(lián)免疫反應(yīng)類型、試劑及分析裝置的序列號等信息，不能隨意被改變，使用時嚴格受控，尤其是在使用超過有效期檢測試劑時，將被識別并阻止發(fā)出檢測報告，從而可以確保檢測的準確性；5.它將每一檢測試劑進行有效分隔和密封，不會引起各種試劑之間的交叉污染而影響檢測結(jié)果；6.它是一種專用于特定分析儀器的分析試劑裝置，在檢測過程中用全自動的精密加液器來加注檢測試劑、洗滌液或樣本，操作自動化，加量精確，檢測結(jié)果的準確度和精密
度高；7.在檢測項目成套試劑的數(shù)量配置及使用上，一切按實際使用需要來進行配備即可，尤其是在對多項目檢測上，配備更為適量，不會出現(xiàn)超配置及使用情況。


圖1是本發(fā)明申請所述試劑裝置的一個實施例的剖面結(jié)構(gòu)示意圖；圖2是圖1所述實施例的平面俯視圖；圖3是本發(fā)明申請所述試劑裝置的另一個實施例的剖面結(jié)構(gòu)示意圖；圖4是本發(fā)明申請所述試劑裝置的再一個實施例中反應(yīng)孔的平面俯視圖；圖5和圖6是圖4所述試劑裝置中反應(yīng)孔中內(nèi)孔和外孔的裝配示意圖；其中，10為基體、20為手柄、30為條形碼、40為密封薄膜、50為支撐柱、11為樣本孔、12為輔劑孔、13為酶結(jié)合物孔、14為底物孔、15為終止液孔、16為稀釋液孔、17為反應(yīng)孔、18為稀釋孔、171為外孔、172為內(nèi)孔、173為防溢腔、174為底孔。
具體實施例方式以下結(jié)合具體的檢測裝置與實施步驟對本發(fā)明申請所述的試劑裝置和檢測方法進行進一步的描述，目的是為了公眾更好的理解本發(fā)明申請所述的技術(shù)方案，而不是對所述技術(shù)方案的限制。事實上，以相同或近似的原理，對所述試劑裝置進行的改進，包括其形狀、尺寸、所用材質(zhì)的改變，以及相應(yīng)結(jié)構(gòu)的增減或替換，都在本發(fā)明申請所要求保護的技術(shù)方案之內(nèi)。實施例一檢測幽門螺桿菌抗體的試劑裝置一如圖1-2所示，本發(fā)明申請所述的檢測幽門螺桿菌抗體的試劑裝置為長條狀，包括具有八個孔位的基體10和位于基體10 —端的手柄20，八個孔位的排列順序從近手柄10端開始依次為樣本孔11、輔劑孔12、酶結(jié)合物孔13、底物孔14、終止液孔15、稀釋液孔16、反應(yīng)孔17和稀釋孔18，所述的樣本孔11內(nèi)盛有待測樣本，輔劑孔12供檢測需要時加入輔助試劑使用(如檢測IgA時輔劑孔內(nèi)加入吸附劑)，酶結(jié)合物孔13內(nèi)加入酶結(jié)合物溶液，底物孔14內(nèi)加入底物溶液，終止液孔15加入終止液，稀釋液孔16內(nèi)加入稀釋液，反應(yīng)孔17為平底并具有很高的光通透性，當盛裝無色或空白試劑溶液時，對可見光或紫外光或熒光的吸光度值接近于零，孔內(nèi)已包被有純化且滅活的幽門螺桿菌抗原，并作為反應(yīng)容器加注待測的液體樣本和檢測試劑及洗滌液，反應(yīng)終止后進行吸光度測定，稀釋孔18作為樣本稀釋容器，供稀釋樣本時用。進一步的，所述的試劑裝置中，輔劑孔12、酶結(jié)合物孔13、底物孔14、終止液孔15和稀釋液孔16上覆蓋有密封薄膜40，該密封薄膜40主要起到在運輸和移動的過程中，防止液體溢出的作用，另外，也起到防塵防污染及增加穩(wěn)定性的作用。
進一步的，所述的手柄20上粘貼有條形碼30，該條形碼30標識有幽門螺桿菌抗體檢測試劑及分析裝置的信息，所述的信息包括檢測項目代碼、檢測試劑生產(chǎn)批號、試劑有效期、定量檢測標準曲線參數(shù)/定性校正系數(shù)、酶聯(lián)免疫反應(yīng)類型、試劑及分析裝置的序列號。實施例二檢測幽門螺桿菌抗體的試劑裝置二如圖3所示，本實施例中的檢測幽門螺桿菌抗體的試劑裝置，其基本結(jié)構(gòu)與實施例一中的試劑裝置相同，在所述試劑裝置還包括若干個支撐柱50，所述的支撐柱50位于所述試劑裝置中基體10的下面，相鄰支撐柱50之間間隔有一個以上的孔位，支撐柱50的作用是為了加強基體的機械強度及平衡性。實施例三檢測幽門螺桿菌抗體的試劑裝置三如圖4-6所示，為本發(fā)明申請所述檢測幽門螺桿菌抗體的試劑裝置的優(yōu)選的實施例，其基本結(jié)構(gòu)與實施例一或?qū)嵤├嗤?，區(qū)別在于反應(yīng)孔17為可拆卸式的結(jié)構(gòu)，反應(yīng)孔17由外孔171和內(nèi)孔172構(gòu)成，外孔171的底部開有底孔174，內(nèi)孔172穿過底孔174且與底孔174緊配合，外孔171和內(nèi)孔172之間留有防溢腔173，防溢腔173的作用是在反應(yīng)過程中，如果液體溢出，可以留在腔內(nèi)，防止污染儀器和其他試劑裝置。進一步的，所述內(nèi)孔和外孔的配合固定方式還可以是將內(nèi)孔的外壁設(shè)計為兩段，上段外壁的厚度大于下段外壁的厚度，外孔的底孔的直徑與內(nèi)孔下段的外徑相等，這樣將內(nèi)孔下段插入底孔中，內(nèi)孔的上段恰好卡在底孔之上，同樣可以起到緊固的效果。實施例四試劑裝置或試劑盒的制作-間接法檢測幽門螺桿菌抗體本發(fā)明是基于酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)上的一種更加簡單、準確、有效的一套方法，其采用的基本原理為間接酶聯(lián)免疫法:將由純化且滅活的幽門螺桿菌抗原吸附于固相上，通過孵育使稀釋的人血清或血漿中的特異性抗體與抗原結(jié)合，洗滌去除未與固相結(jié)合的抗體，加入用辣根過氧化物酶標記的抗人免疫球蛋白酶聯(lián)物，孵育，去除未結(jié)合的酶聯(lián)物，加入酶色原底物，產(chǎn)生的顏色與檢測樣本中的特異性抗體濃度成正比。這種方法主要是通過用于酶聯(lián)免疫檢測的分析試劑裝置和配套試劑來實現(xiàn)幽門螺桿菌抗體的免疫檢測。通過這種酶聯(lián)免疫方法，同時運用特定分析儀器的分析試劑裝置和試劑，可快速，準確的做出判斷用于輔助臨床診斷。以孔位11作為樣本孔，在使用時加入液體樣本，供檢測時取用；以孔位12作為輔劑孔，檢測有需要時加入輔助試劑(如檢測IgA時加入吸附劑)，用密封薄膜封口，供檢測取用；以孔位13作為酶結(jié)合物孔，加入酶結(jié)合物溶液用密封薄膜封口，供檢測時取用；以孔位14作為底物孔，加入TMB底物溶液后用密封薄膜封口，供檢測時用；以孔位15作為終止液孔，加入終止液后用密封薄膜封口，供檢測時用；以孔位16作為稀釋液孔，加入樣本稀釋液后用密封薄膜封口，供檢測時用；以孔位17作為包被物孔/反應(yīng)孔/比色孔，已包被有純化且滅活的幽門螺桿菌抗原，并作為反應(yīng)容器加注待測的液體樣本和檢測試劑及洗滌液，反應(yīng)終止后進行吸光度測定;以孔位18作為稀釋孔，供稀釋樣本時用；在手柄20粘貼有幽門螺桿菌抗體檢測試劑及分析裝置信息的條形碼30，該條形碼包括檢測項目代碼、檢測試劑生產(chǎn)批號、試劑有效期、定量檢測校正系數(shù)、酶聯(lián)免疫反應(yīng)類型、試劑及分析裝置的序列號。按照上述方法制備若干分析裝置，另外制備相應(yīng)的校準品和質(zhì)控物。這樣即構(gòu)成了完整的幽門螺桿菌抗體測定試劑盒組份。將檢測幽門螺桿菌抗體的試劑裝置及配套使用組份裝入試劑盒的外包裝盒，即制成檢測幽門螺桿菌抗體試劑盒。實施例五幽門螺桿菌抗體IgG的檢測方法本發(fā)明申請?zhí)峁┮环N利用上述試劑裝置進行幽門螺桿菌抗體IgA檢測的方法，所述的方法包括如下的步驟:1.在所述的樣本孔中加入樣本80 150μ L ;2.用精密加液器從稀釋液孔中吸取360 μ L液體到稀釋孔中；3.移除稀釋液孔中的剩余液體，從稀釋孔中吸取180 μ L液體回稀釋液孔；4.用精密加液器從樣本孔中吸取20 μ L液體到稀釋液孔中，樣本10倍稀釋；5.用精密加液器從稀釋液孔中吸取液體20 μ L到稀釋孔中，樣本100倍稀釋；6.用精密加液器從稀釋液孔中吸取液體100μ L到反應(yīng)孔中，25°C下，孵育60min后移除液體；7.用洗滌液對反應(yīng)孔進行3 5次洗滌后移除液體；8.用精密加液器從酶結(jié)合物孔中吸取100 μ L辣根過氧化物酶標記的抗人IgG抗體酶結(jié)合物溶液至反應(yīng)孔進行反應(yīng)，25°C下,反應(yīng)30min后移除液體；9.重復(fù)步驟7;10.用精密加液器從底物孔中吸取100 μ L的TMB底物溶液至反應(yīng)孔中反應(yīng)10 15min ；11.用精密加液器從終止液孔中吸取100 μ L的終止液加注至反應(yīng)孔中，I IOmin內(nèi)于450nm和630nm雙波長條件下進行檢測，讀取OD值。實施例六通過全自動分析儀實現(xiàn)對樣本中幽門螺桿菌抗體IgG檢測的分析操作流程進一步的，本發(fā)明申請所述的檢測方法還包括相應(yīng)配合使用的全自動分析儀，該全自動分析儀包括一個分析裝置托盤，它是與分析裝置的形狀相配套的，一共有30個位置可供分析裝置放置，用于檢測分析，此外還包括模塊式集成機械電子結(jié)構(gòu)及軟件控制系統(tǒng)，可實現(xiàn)自動化的加注、稀釋、孵育、洗滌、讀數(shù)、分析過程。每個位置獨立定量分析，保證結(jié)果的準確性。儀器運行后，分析裝置托盤會自行轉(zhuǎn)動到不同的位置進行加注，稀釋，孵育，洗滌以及讀數(shù)的步驟。具體的操作包括如下的步驟:(I)檢查程序的準備:按要求配置好相應(yīng)的溶液，包括洗滌緩沖液，清洗液或消毒液，配制完畢裝入相應(yīng)的液體瓶中；(2)與外接計算機相連:儀器和外接計算機相連，從而將儀器正常工作所得結(jié)果交由集中式系統(tǒng)處理；(3)開機:打開儀器開關(guān)后，通過外接計算機的工作界面對儀器設(shè)置自動或手動自檢，從而為儀器的正常運行做準備；(4)預(yù)熱:在開機后，儀器會啟動加熱程序，將溫度調(diào)至待檢溫度；
(5)沖洗檢查；(6)幽門螺桿菌抗體IgG的檢測:I)從有密封口的一邊打開包裝袋，取用所需數(shù)量的分析試劑裝置，排除空氣后將袋口封緊；2)檢查分析試劑裝置TMB底物孔中的溶液，應(yīng)為無色澤改變，否則應(yīng)棄掉；3)分別在每個分析試劑裝置的樣本孔中加50 120 μ L未稀釋的樣本，建議加100 μ L的樣本，每更換一個批號的試劑，應(yīng)取其中一個分析試劑裝置及校準品進行儀器校準；4)按照所需檢測的數(shù)量在分析裝置托盤中放入相對應(yīng)數(shù)量的分析試劑裝置，點擊“開始”、“掃描”，儀器可自動地掃描分析試劑裝置條碼、質(zhì)控物條碼和校準品條碼，然后對樣本進行編號，或通過外部條碼掃描儀對樣本條碼進行掃描；5)點擊“運行”，儀器根據(jù)條碼信息自動運行，根據(jù)條碼，程序首先檢測校準品，通過校準，修正標準曲線；其次對質(zhì)控物進行檢測，如果其檢測結(jié)果在標示的范圍內(nèi)，則表示檢測的標準曲線符合要求，可用于樣本的檢測，最后開始樣本的檢測程序；6)稀釋:加注針刺破孔位密封薄膜自動吸取稀釋液360 μ L到稀釋孔中，并移除稀釋液孔中的剩余液體，再從稀釋孔中吸取稀釋液180μ L回稀釋液孔，加注針從樣本孔自動吸取樣品20 μ L到稀釋液孔進行樣本稀釋，再從稀釋液孔中吸取20 μ L到稀釋孔，動作完成后，被稀釋的樣本被加注針移至反應(yīng)孔孵育30 60min，通常儀器設(shè)定為60min，之后移除液體；7)洗滌:沖洗針從相應(yīng)的液瓶中吸取一定量的洗滌緩沖液對試劑孔進行三到五次洗滌后移除液體；8)加注針刺破酶結(jié)合物孔密封薄膜吸取IOOyL辣根過氧化物酶標記的抗人IgG抗體酶結(jié)合物溶液至反應(yīng)孔進行反應(yīng)，反應(yīng)30 60min后移除液體，通常儀器設(shè)定為30min ；9)重復(fù)步驟7);10)加注針刺破TMB底物孔密封薄膜吸取100 μ L的TMB底物至反應(yīng)孔反應(yīng)10 20min,通常儀器設(shè)定為IOmin ；11)加注針刺破終止液孔密封薄膜吸取100 μ L的終止液加注至反應(yīng)孔，在I IOmin內(nèi)于450nm/630nm雙波長下讀取OD值。(7)檢測結(jié)果:當檢測程序運行完畢，可通過計算機上的數(shù)據(jù)處理軟件分析，最后生成報告單以便查閱；(8)關(guān)機:檢測結(jié)束后，在儀器關(guān)機前，必須啟動清洗循環(huán)，這樣可以避免來自溶液中的殘留鹽份在液路中結(jié)晶，避免損壞儀器或?qū)е聶z測結(jié)果無效，清洗完成后，儀器電源自動關(guān)閉。實施例七患者樣本中幽門螺桿菌抗體IgG的檢測應(yīng)用、結(jié)果分析以及檢測的質(zhì)控采用實施例五的操作方法與程序，使用實施例四所述的試劑盒，可用于定量測定人血清或血漿中的幽門螺桿菌抗體IgG水平。檢測血清中特異性抗體可以反映病原體的感染情況。幽門螺桿菌抗體(即血清抗體)主要之一是IgG，血清抗體可反映機體對幽門螺桿菌的感染及免疫應(yīng)答能力?？筛鶕?jù)檢測的結(jié)果來輔助臨床診斷，初步判斷患者患病的情況，最終確診應(yīng)結(jié)合臨床表現(xiàn)或其他診斷方法/指標進行綜合考慮。以下為檢測結(jié)果的分析:(I)參考值(參考范圍)正常參考值:0 10AU/mL ;檢測一定數(shù)量(具有統(tǒng)計學(xué)意義)的陰性樣本，結(jié)果的平均值加3倍標準偏差(即X+3SD)為參考值的上限。各實驗室可根據(jù)實際情況建立適宜的參考范圍。(2)檢測結(jié)果的解釋若樣本值> 10AU/mL，提示抗體水平升高，但應(yīng)結(jié)合臨床表現(xiàn)或其他診斷方法/指標進行確診。為了方便臨床應(yīng)用，可參考如下判斷規(guī)則:樣本值< 8AU/mL陰性8AU/mL彡樣本值彡12AU/mL 可疑樣本值> 12AU/mL陽性當檢測結(jié)果為可疑時，應(yīng)重新檢測，若仍為可疑，需在2 3周后重新采集樣本檢測。

以下是將實施例六的檢測過程重復(fù)檢測陽性和陰性質(zhì)控血清，檢查結(jié)果的再現(xiàn)性，獲得如下的結(jié)果:
陽性質(zhì)控物
編號檢測值 I 結(jié)果 I I編號檢測值結(jié)果
1— 83.9P6107.1P
2— 98.2P793.7P
3— 97.4P885.8P
4— 81.5P989.2P
5— 108.3P1095.6 ~ P
測定結(jié)果均值為94.1AU/raL，CY%=9.7%。
陰性質(zhì)控物
13.5 N II 6I 3.1N
2— 4.0 N74.1~ N
3— 3.8 NB3.9~ N
4— 3.7 N93.4~ N
5— 3.6 N103.3~ N
測定結(jié)果均值為3.6 AU/mL, CV%=8.9%
實施例八患者樣本中幽門螺桿菌抗體IgA的檢測應(yīng)用、結(jié)果分析以及檢測的質(zhì)控采用實施例五的操作方法與程序，使用實施例四所述的試劑盒，可用于定性檢測人血清或血漿中的幽門螺桿菌抗體I gA水平。檢測血清中特異性抗體可以反映病原體的感染情況。幽門螺桿菌抗體(即血清抗體)主要之一是IgA，血清抗體可反映機體對幽門螺桿菌的感染及免疫應(yīng)答能力。可根據(jù)檢測的結(jié)果來輔助臨床診斷，初步判斷患者患病的情況，最終確診應(yīng)結(jié)合臨床表現(xiàn)或其他診斷方法/指標進行綜合考慮。以下為檢測結(jié)果的分析:(I)參考值(參考范圍)正常參考值:0 1.0。(2)檢測結(jié)果的解釋若樣本值> 1.0，提示抗體水平升高，但應(yīng)結(jié)合臨床表現(xiàn)或其他診斷方法/指標進行確診。為了方便臨床應(yīng)用，可參考如下判斷規(guī)則:樣本值<0.9陰性0.9≤樣本值≤1.1 可疑樣本值> 1.1陽性當檢測結(jié)果為可疑時，應(yīng)重新檢測，若仍為可疑，需在2 3周后重新采集樣本檢測。以下是將實施例六的檢測過程重復(fù)檢測陽性和陰性質(zhì)控血清，檢查結(jié)果的再現(xiàn)性，獲得如下的結(jié)果:
陽性質(zhì)控物
權(quán)利要求
1.一種檢測幽門螺桿菌抗體的試劑裝置，其特征在于:所述的試劑裝置為長條狀，包括具有八個孔位的基體和位于基體一端的手柄，八個孔位的排列順序從近手柄端開始依次為樣本孔、輔劑孔、酶結(jié)合物孔、底物孔、終止液孔、稀釋液孔、反應(yīng)孔和稀釋孔，樣本孔內(nèi)盛有待測樣本，輔劑孔供檢測有需要時加入輔助試劑使用，酶結(jié)合物孔內(nèi)盛有酶結(jié)合物溶液，底物孔內(nèi)盛有底物溶液，終止液孔內(nèi)盛有終止液，稀釋液孔內(nèi)盛有稀釋液，反應(yīng)孔為平底且具有高的光通透性，孔內(nèi)包被有幽門螺桿菌抗原，并作為反應(yīng)容器加注待測的液體樣本和檢測試劑及洗滌液，反應(yīng)終止后進行吸光度測定，稀釋孔作為樣本稀釋容器，供稀釋樣本時用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑裝置，其特征在于:所述的試劑裝置中，當檢測幽門螺桿菌抗體gIG時，輔劑孔內(nèi)不加入任何試劑，當檢測幽門螺桿菌抗體IgA時，吸附劑加入輔劑孔內(nèi)或與稀釋液一起加入稀釋液孔中。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑裝置，其特征在于:所述的試劑裝置中，輔劑孔、酶結(jié)合物孔、底物孔、終止液孔和稀釋液孔上覆蓋有密封薄膜。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的試劑裝置，其特征在于:所述的手柄上粘貼有條形碼，該條形碼標識有幽門螺桿菌抗體檢測試劑及分析裝置的相關(guān)信息。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的試劑裝置，其特征在于:所述試劑裝置還包括若干個支撐柱，所述的支撐柱位于所述試劑裝置中基體的下面，相鄰支撐柱之間間隔有一個以上的孔位。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的試劑裝置，其特征在于:所述試劑裝置中反應(yīng)孔由外孔和內(nèi)孔構(gòu)成，外孔的底部開有底孔，內(nèi)孔穿過底孔且與底孔緊配合，外孔和內(nèi)孔之間留有防溢腔。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的試劑裝置，其特征在于:所述試劑裝置中反應(yīng)孔的內(nèi)孔包被的幽門螺桿菌抗原包括純化且滅活的幽門螺桿菌或重組的幽門螺桿菌。
8.利用權(quán)利要求1-7所述的試劑裝置進行幽門螺桿菌抗體檢測的方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步驟: 1)在所述的樣本孔中加入未稀釋的樣本； 2)從稀釋液孔中吸取稀釋液加入稀釋孔中； 3)移除稀釋液孔中的剩余液體，從稀釋孔中吸取部分液體回稀釋液孔； 4)從樣本孔中吸取樣本加入稀釋液孔中,將樣本進行稀釋； 5)從稀釋液孔中吸取液體加入稀釋孔中，將樣本進行進一步的稀釋； 6)當檢測幽門螺桿菌抗體IgA且輔劑孔內(nèi)加入吸附劑時，從輔劑孔吸取液體加入反應(yīng)孔中，其他情況則不需要此步驟； 7)從稀釋孔中吸取液體加入反應(yīng)孔中，25 37°C的條件下，孵育30 60min； 8)用洗滌液對反應(yīng)孔進行3 5次洗滌后移除液體； 9)從酶結(jié)合物孔中吸取酶結(jié)合物溶液加入反應(yīng)孔中，25 37°C的條件下，反應(yīng)30 60min后移除液體； 10)重復(fù)步驟8)； 11)從底物孔中吸取底物溶液加入反應(yīng)孔中，25 37°C的條件下，反應(yīng)10 20min； 12)從終止液孔中吸取終止液加入反應(yīng)孔中，I IOmin內(nèi)于450nm讀取OD值，或選擇雙波長法測定，波長范圍在620nm 690nm。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步驟: 1)在所述的樣本孔中加入未稀釋的樣本，體積至少為樣本孔容量的1/4； 2)從稀釋液孔中吸取稀釋液加入稀釋孔中，吸取的量為孔內(nèi)液體總量的7/10以上； 3)移除稀釋液孔中的剩余液體，根據(jù)預(yù)期稀釋倍數(shù)從稀釋孔中吸取部分液體回稀釋液孔； 4)從樣本孔中吸取樣本加入稀釋液孔中，將樣本進行稀釋，稀釋倍數(shù)為I 10倍； 5)從稀釋液孔中吸取液體加入稀釋孔中，將樣本進行進一步的稀釋，稀釋倍數(shù)為1 100 倍； 6)當檢測幽門螺桿菌抗體IgA且輔劑孔內(nèi)加入吸附劑時，從輔劑孔吸取液體加入反應(yīng)孔中，其他情況則不需要此步驟； 7)從稀釋孔中吸取液體加入反應(yīng)孔中，25 37°C的條件下，孵育30 60min； 8)用洗滌液對反應(yīng)孔進行3 5次洗滌后移除液體； 9)從酶結(jié)合物孔中吸取酶結(jié)合物溶液加入反應(yīng)孔中，25 37°C的條件下，反應(yīng)30 60min后移除液體； 10)重復(fù)步驟8)；11)從底物孔中吸取底物溶液加入反應(yīng)孔中，25 37°C的條件下，反應(yīng)10 20min； 12)從終止液孔中吸取終止液加入反應(yīng)孔中，1 1Omin內(nèi)于450nm讀取OD值，或選擇雙波長法測定，波長范圍在620nm 690nm。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步驟: 1)在所述的樣本孔中加入樣本80 150μ L ; 2)用精密加液器從稀釋液孔中吸取360μ L液體到稀釋孔中； 3)移除稀釋液孔中的剩余液體，從稀釋孔中吸取ISOyL液體回稀釋液孔； 4)用精密加液器從樣本孔中吸取20μ L液體到稀釋液孔中，樣本10倍稀釋； 5)用精密加液器從稀釋液孔中吸取液體20μL到稀釋孔中，樣本100倍稀釋； 6)當檢測幽門螺桿菌抗體IgA且輔劑孔內(nèi)加入吸附劑時，用精密加液器從輔劑孔吸取液體30 μ L加入反應(yīng)孔中，其他情況則不需要此步驟； 7)用精密加液器從稀釋液孔中吸取液體100μ L到反應(yīng)孔中，25 37°C下，孵育60min后移除液體； 8)用洗滌液對反應(yīng)孔進行3 5次洗滌后移除液體； 9)用精密加液器從酶結(jié)合物孔中吸取100μ L辣根過氧化物酶標記的抗體酶結(jié)合物溶液至反應(yīng)孔進行反應(yīng)，25 37°C下，反應(yīng)30min后移除液體； 10)重復(fù)步驟8)； 11)用精密加液器從底物孔中吸取1OOμL的TMB底物溶液至反應(yīng)孔中反應(yīng)10 15min ； 12)用精密加液器從終止液孔中吸取100μ L的終止液加注至反應(yīng)孔中，1 1Omin內(nèi)于450nm和630nm雙波長條件下進行檢測，讀取OD值。
全文摘要
本發(fā)明申請公開一種檢測幽門螺桿菌抗體的試劑裝置及其方法，所述的試劑裝置為長條狀，包括具有八個孔位的基體和位于基體一端的手柄，八個孔位的排列順序從近手柄端開始依次為樣本孔、輔劑孔、酶結(jié)合物孔、底物孔、終止液孔、稀釋液孔、反應(yīng)孔和稀釋孔。本發(fā)明申請基于酶聯(lián)免疫檢測的原理，利用上述的試劑裝置對幽門螺桿菌抗體進行檢測，是一種獨立的、單人份的分析檢測方法，并且可以與相應(yīng)的特定分析儀器配合使用，在檢測過程中，用全自動的精密加液器來加注檢測試劑或樣本，具有操作自動化，加量精確，檢測結(jié)果的準確度和精密度高的優(yōu)點，具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號G01N33/569GK103185793SQ20111045183
公開日2013年7月3日 申請日期2011年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月30日
發(fā)明者胡德明, 劉清波, 何林, 陽輝 申請人:深圳市亞輝龍生物科技有限公司