一種轉基因生物定量檢測中修正偏差的方法
【專利說明】-種轉基因生物定量檢測中修正偏差的方法
[0001] 本發(fā)明是申請?zhí)枮?012101041601，發(fā)明名稱為"轉基因水稻克懼稻2號核酸定量 檢測試劑盒"的專利申請的分案申請。
技術領域：
[0002] 本發(fā)明設及一種轉基因生物定量檢測中修正轉基因檢測值與真實值間的偏差方 法，具體地說，是建立一種計算修正偏差的校正系數(shù)的方法。
【背景技術】：
[0003] 轉基因生物檢測首先需要提取轉基因植物的DNA。從理論上來講，轉基因植物與其 受體植物的DNA提取效率應該相同。但有些生物在插入外源基因形成轉基因生物后，會引 起該轉基因生物的某些特性發(fā)生變化，因此轉基因生物的基因組在提取時會受到影響。
[0004] 因此在轉基因生物檢測中，提取的外源基因DNA濃度往往偏離其理論提取DNA濃 度，導致轉基因成分的檢測值（即外源基因拷貝數(shù)/內(nèi)標準基因的拷貝數(shù)分數(shù)）偏離其實 際值。
[0005] 歐盟IRMM的轉基因植物標準物質(zhì)研制中首先要將轉基因植物與其受體植物的種 子粉末的分別提取其核酸。但每次稱量粉末的質(zhì)量和提取的核酸體積都有可能不同或存在 差異，單純用核酸濃度進行比較，可能有失偏頗。
[0006] 因此，需要建立一種新的在轉基因生物檢測中用于修正轉基因檢測值與真實值間 的偏差方法。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種精確定量檢測轉基因的方法，W消除插入外源基因形成 轉基因生物后，提取的外源基因DNA濃度偏離其真實濃度而造成的誤差。
[0008] 本發(fā)明的直接目的是，建立一種用于修正轉基因檢測值與真實值間的偏差方法， 具體地說，是建立一種計算修正偏差的校正系數(shù)的方法。
[0009] 本發(fā)明建立了一種在轉基因生物的外源基因定量檢測中計算修正偏差的校正系 數(shù)方法，用此校正系數(shù)校正測定值，能夠修正轉基因檢測值與真實值間的偏差。
[0010]本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，受體生物在插入外源基因形成轉基因生物后，會引起該轉基因生 物的某些特性發(fā)生變化，影響外源基因的提取，提取的外源基因DNA濃度偏離其真實濃 度，導致轉基因成分的檢測值（即外源基因拷貝數(shù)/內(nèi)標準基因的拷貝數(shù)分數(shù)）偏離其實 際值。
[0011] 例如，受體水稻秀水11在插入外源基因化ylAb所形成的轉基因克懼稻2號的基 因組在提取時會受到影響，測得的外源基因DNA濃度偏離其真實濃度。
[0012] 因此為了使檢測結果接近于真實情況，需要建立一種校正方法。
[0013] 歐盟IRMM的轉基因植物標準物質(zhì)研制中首先要將轉基因植物與其受體植物的種 子粉末的分別提取其核酸。
[0014] 本發(fā)明先是發(fā)現(xiàn)兩種植物種子粉末的核酸濃度的比值可作為校正系數(shù)，可W得到 與質(zhì)量配比值接近的校正值。
[0015] 但考慮到每次稱量粉末的質(zhì)量和提取的核酸體積都有可能不同或差異，單純用核 酸濃度進行比較，可能有失偏頗。
[0016] 為了使運個值顯得更加準確，本發(fā)明人經(jīng)研究后，又發(fā)現(xiàn)用提取效率運個概念來 替代核酸濃度，所W用核酸濃度乘W其核酸體積再除W稱量粉末質(zhì)量得到了該植物種子粉 末的核酸提取效率，然后將轉基因植物的核酸提取效率與非轉基因植物的核酸提取效率進 行比較，來看其核酸提取效率的比較，由于質(zhì)量分數(shù)（質(zhì)量配比值）是W粉末的質(zhì)量為特性 量值，而PCR反應是W核酸的拷貝數(shù)作為特性量值，核酸又與其提取效率有密切相關，所W 該值可W作為校正測定值的校正系數(shù)。
[0017] 本發(fā)明建立了一種方法，可W測算出轉基因檢測值與真實值的校正系數(shù)，步驟如 下：
[0018] 1)精確稱取轉基因生物與受體非轉基因生物樣品各一份；
[001引。分別提取轉基因生物與受體非轉基因生物基因組DNA，分別測定其DNA濃度，并 分別測定所提取DNA的體積；
[0020] 3)按照下列公式，分別計算轉基因生物與受體非轉基因生物的核酸提取效率E
[0021]
[0022] 4)按下列公式計算校正系數(shù)C:
[0023]
[0024]
[002引式中，Ett。。,,。。。為轉基因生物核酸提取效率，Et。。。。,。為受體非轉基因生物核酸提取 效率；
[0026] 5)按下列公式計算轉基因生物樣品轉基因成分的含量
[0027] 轉基因成分的含量=轉基因成分的檢測值/C
[0028] 為了計算結果更加準確可靠，最好應重復進行測量，即在步驟1)中分別稱取多份 樣品，并分別進行上述步驟2)~步驟4)，得到每份樣品的校正系數(shù)C;然后計算所有樣品校 正系數(shù)C的算術平均值。
[0029] 重復次數(shù)越多，所得計算結果越準確，但檢測成本和時間越長，通常應重復5~10 次。
[0030] 在本發(fā)明的實例中，所得到的轉基因水稻克懼稻2號的校正系數(shù)C是經(jīng)過10次重 復實驗后所獲得的。每次實驗中，每份樣品稱取了lOOmg。測算出了轉基因水稻克懼稻2號 與受體水稻秀水11的校正系數(shù)為22. 7%。用此校正系數(shù)計算出了待測克懼稻2號樣品中 的轉基因成分精確含量（見實施例）。
[0031] 根據(jù)上述本發(fā)明建立的檢測方法，本發(fā)明還提供了一種轉基因水稻克懼稻2號核 酸定量檢測試劑盒，所述試劑盒中除常規(guī)的巧光定量PCR應有的試劑、PCR酶預混液外，還 含有W下成分：
[0032] 內(nèi)標準基因RBE4的上游引物、下游引物、探針；外源基因克懼稻2號的上游引物、 下游引物、探針；具體詳見表1。
[0033] 質(zhì)控品（為含量1%和5%的轉基因水稻克懼稻2號種子粉末標準物質(zhì)）
[0034] 標準品：為含有不同濃度的克懼稻2號和RBE4基因片段的質(zhì)粒分子標準物質(zhì)，數(shù) 量為3~8個；
[0035] 盡管檢測精度與標準品數(shù)量成正比，但檢測成本也與標準品數(shù)量成正比。本發(fā)明 人經(jīng)實驗證明，標準品優(yōu)選數(shù)量是4~6個
[0036] 在本發(fā)明一個實例中，用了 5種不同濃度的標準品（分別含有106、105、104、103、 10 2copy/ml的克懼稻2號和RBE4基因片段）。
[0037] 表1轉基因水稻克懼稻2號（KMD2)定量檢測用內(nèi)標準基因和外源基因探針序列
[0038]
[0039] 注：表中FAM為探針的發(fā)光基團，B冊1和MGBNFQ為探針的澤滅基團。
[0040] 用本發(fā)明的試劑盒進行轉基因水稻克懼稻2號核酸定量檢測的操作方法，其特征 為：
[0041] 1、精確稱取質(zhì)巧品和待測樣品；
[0042] 為保證稱量精確，應使用經(jīng)過校準的天平；通常，稱取質(zhì)控品和待測樣品各 lOOmgo
[004引 2、分別提取質(zhì)控品和待測樣品的基因組DNA，所得DNA純度應為Azwl. 8~2. 0,且 濃度大于20ng/yL。
[0044] 其中，提取DM可按現(xiàn)有技術方法，比如，可采用植物基因組提取試劑盒Wizard.常 GenomicDNAPurificationKit(美國普羅麥格公司），提取步驟按照該產(chǎn)品的說明書進行 操作。
[0045] 測定DNA純度可采用現(xiàn)有技術方法或產(chǎn)品，如用PicoGreen試劑盒進行測定；
[0046] 3、將表1所述RBE4內(nèi)標引物對和探針及克懼稻2號外源引物對和探針用去離子 水溶解配制成濃度為10μΜ的工作液；
[0047] 4、將每個標準品、質(zhì)控品DNA和待測樣品DNA分別進行巧光定量PCR擴增，所述標 準品如權利要求1所述；
[0048] 5、按照表3所示PCR程序設置進行巧光定量PCR檢測，根據(jù)每個標準品的所示濃 度和測得的Ct值可W得出內(nèi)標準基因和外源基因的標準曲線，W及待測樣品DNA和質(zhì)控品 DNA的內(nèi)標準基因和外源基因的Ct值，根據(jù)標準曲線計算得出待測樣品和質(zhì)控品的內(nèi)標準 基因和外源基因的拷貝數(shù)及其比值，從而得出待測樣品和質(zhì)控品中轉基因水稻克懼稻2號 的精確含量，通過使用質(zhì)控品監(jiān)控整個實驗流程和確保實驗數(shù)據(jù)的準確和可靠。
[004引步驟4中，按照表2中所示，配制內(nèi)標準基因和外源基因的PCR體系，DNA模板分 別是5個標準品、待測樣品DNA和質(zhì)控品DNA;巧光定量PCR反應程序按表3進行；
[0050] 步驟4中，每個樣品做Ξ個重復試驗；
[0051] 步驟5中，根據(jù)外源基因和內(nèi)標準基因的標準曲線的方程分別計算外源基因和內(nèi) 標準基因的拷貝數(shù)，最后計算外源基因