精生物高科技有限公司）（比重1. 077)的界面上（不要破壞界面），以2000轉(zhuǎn)/分鐘， 離心20分鐘，取中間層一富含淋巴細(xì)胞的白膜層，加入完全培養(yǎng)基20mL。取少量細(xì)胞進(jìn)行 細(xì)胞計(jì)數(shù)及苔盼蘭活細(xì)胞計(jì)數(shù)染色，結(jié)果顯示，活細(xì)胞達(dá)99%。
[0084] (3)將步驟⑵獲得的含有完全培養(yǎng)基的白膜層，以1000轉(zhuǎn)/分鐘，離心10分鐘， 棄上清液，沉淀為單個(gè)核細(xì)胞。
[0085] (4)加入完全培養(yǎng)基，細(xì)胞計(jì)數(shù)，用完全培養(yǎng)基調(diào)整單個(gè)核細(xì)胞濃度為1X106/mL。
[0086] (5)按照1X106/mL細(xì)胞，加入γ-IFN(P印rotech公司）使其濃度為1000IU/mL， 置37°C、5 % 0)2培養(yǎng)箱中，開始誘導(dǎo)培養(yǎng)。
[0087] (6)步驟（5)的細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)后，在培養(yǎng)的細(xì)胞中，加入500ng/mL抗人⑶3單 克隆抗體（Biolegend公司）和 1000IU/mL重組人IL-2(P印rotech公司），置 37°C、5%C02 培養(yǎng)箱中，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)，從而獲得CIK細(xì)胞。其中，單個(gè)核細(xì)胞中加入γ-IFN，經(jīng)培養(yǎng)24 小時(shí)后（誘導(dǎo)第1天），光鏡觀察發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞折光性一般。在單個(gè)核細(xì)胞中加入抗人CD3單 克隆抗體和重組人IL-2,經(jīng)培養(yǎng)24小時(shí)后（誘導(dǎo)第2天），光鏡觀察發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞有一定程度 的聚集，零零散散有小集落開始形成，細(xì)胞略有增大。
[0088] (7)誘導(dǎo)培養(yǎng)的第四天，細(xì)胞傳代。按照1份CIK細(xì)胞原液，加入3份含1000IU/ mL重組人IL-2的完全培養(yǎng)基。同時(shí)，取樣檢測(cè)CIK細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)⑶3、 ⑶56、⑶4、⑶8陽性細(xì)胞數(shù)，檢測(cè)CIK細(xì)胞殺傷K562腫瘤細(xì)胞（中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫）活性。
[0089] (8)此后，每3天按照上述方法，傳代一次，并做相同的檢測(cè)。誘導(dǎo)培養(yǎng)的第19天 終止培養(yǎng)。以上方法均在嚴(yán)格無菌環(huán)境內(nèi)進(jìn)行。
[0090] 該實(shí)施例制備的CIK細(xì)胞的相應(yīng)檢測(cè)結(jié)果表明：
[0091] (l)CIK細(xì)胞在誘導(dǎo)培養(yǎng)的第4天開始增值，第7天到第16天進(jìn)入快速增長(zhǎng)期，16 天后增殖速度趨緩，第19天CIK細(xì)胞最高增殖313倍，最低35倍，平均增殖174倍，顯著低 于實(shí)施例2制備方法制備的CIK細(xì)胞。
[0092] (2)單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)過1-19天的誘導(dǎo)，第7天，CIK細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞K562活性最 高，平均達(dá)54. 1% (范圍54. 1±3. 3%)，此后逐步下降，第19天最低，平均36% (范圍 36±7. 5% )，對(duì)靶細(xì)胞K562的殺傷率明顯不及實(shí)施例2。
[0093] (3)采用流式細(xì)胞儀（BD公司FACSCalibur)，對(duì)誘導(dǎo)前的外周血單個(gè)核細(xì)胞和誘 導(dǎo)后的第19天進(jìn)行⑶3、⑶4、⑶8、⑶3⑶56檢測(cè)。結(jié)果：誘導(dǎo)CIK細(xì)胞前，外周血單個(gè)核細(xì) 胞的CD3+為 52. 84%，CD4 + 為 36. 58%，CD8 + 為 24. 98%，CD3 +CD56+為L(zhǎng)35% ;誘導(dǎo)CIK細(xì) 胞的第 19 天，CD3+為 68. 81%，CD4 + 為 2. 03%，CD8 + 為 44. 77%，CD3 +CD56+為 22. 54%，顯 著不及實(shí)施例2。
[0094] (4)用pH7.4的1XPBS調(diào)整細(xì)胞密度至lX106/mL，加入到流式細(xì)胞檢測(cè)管中， 200μL/管，分別加入不同熒光標(biāo)記的抗人CD3-FITC、CD4-FITC、CD8-PE、CD56-PE抗體（BD 公司），置暗處，4°C標(biāo)記20分鐘，ρΗ7. 4的1XPBS洗滌2次，1500轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘， 1%甲醛固定后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。結(jié)果表明隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，CIK主要效應(yīng)細(xì)胞 ⑶3+⑶56+雙陽性細(xì)胞所占比例上升不明顯。
[0095] 對(duì)比實(shí)施例4和實(shí)施例2可發(fā)現(xiàn)，化合物（I)可協(xié)同γ干擾素誘導(dǎo)產(chǎn)生高純度、 高增殖力、高細(xì)胞毒活性的CIK細(xì)胞。
[0096] 上述實(shí)施例的作用在于說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明的保護(hù) 范圍。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換， 而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和保護(hù)范圍。比如，收集外周血的單個(gè)核細(xì)胞部分的方法 也可以為：采用COBESpectra型血細(xì)胞分離機(jī)（GambroBC公司）上的淋巴細(xì)胞采集程序， 單采正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞30mL。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物（I)，2. 權(quán)利要求1所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于包含W下操作步驟：(a)將 構(gòu)樹的干燥根粉碎，用75~85 %乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油 酸、乙酸乙醋和水飽和的正下醇萃取，分別得到石油酸萃取物、乙酸乙醋萃取物和正下醇萃 取物；化）步驟（a)中乙酸乙醋萃取物用AB-8型大孔樹脂除雜，先用5%乙醇洗脫10個(gè)柱 體積，再用75 %乙醇洗脫8個(gè)柱體積，收集75 %乙醇洗脫液，減壓濃縮得75 %乙醇洗脫物 浸膏；（C)步驟化）中75%乙醇洗脫物浸膏用正相硅膠分離，依次用體積比為90:1、55:1、 25:1、8:1和2:1的二氯甲燒-甲醇梯度洗脫得到5個(gè)組分；（d)步驟（C)中組分4用正相娃 膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為12:1、8:1和4:1的二氯甲燒-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分； (e)步驟（d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為65%的甲 醇水溶液等度洗脫，收集9~10個(gè)柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合物（I)。3. -種利用權(quán)利要求1所述的化合物（I)制備高細(xì)胞毒活性的CIK細(xì)胞的方法，其 特征在于包括如下步驟：（1)取患者外周血，收集外周血的單個(gè)核細(xì)胞部分；(2)將步驟（1) 收集的外周血的單個(gè)核細(xì)胞部分離屯、，棄去上清液，獲得單個(gè)核細(xì)胞；（3)取單個(gè)核細(xì)胞按 照1X1〇6/血細(xì)胞，加入含500~2000IU/mL丫干擾素和80~120ng/mL化合物（I)的 完全培養(yǎng)基，開始誘導(dǎo)培養(yǎng)；其中，完全培養(yǎng)基，包括含體積百分比為10%FBS的RPMI1640 細(xì)胞培養(yǎng)液；（4)步驟（3)的細(xì)胞培養(yǎng)20~28小時(shí)后，加入50~lOOOng/mL抗人CD3單 克隆抗體和500~2000IU/mL重組人IL-2,繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)，其中，每隔2~3天傳代培養(yǎng)一 次，整個(gè)誘導(dǎo)培養(yǎng)的時(shí)間為13~21天，獲得CIK細(xì)胞。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備高細(xì)胞毒活性的CIK細(xì)胞的方法，其特征在于，步驟 (1)中所述收集外周血的單個(gè)核細(xì)胞部分的方法為：(a)患者外周血中，加入1~1. 5倍體 積的不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液或抑7. 2PBS緩沖液稀釋，充分混勻；其中，細(xì)胞培養(yǎng)液包括： RPMI1640培養(yǎng)液和IMDM培養(yǎng)液；化）將步驟（a)獲得的血液稀釋液加入到淋己細(xì)胞分離液 的界面上；（C)1500~2500轉(zhuǎn)/分鐘，離屯、15~20分鐘，收集中間層，獲得單個(gè)核細(xì)胞。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備高細(xì)胞毒活性的CIK細(xì)胞的方法，其特征在于，步驟（1) 中所述收集外周血的單個(gè)核細(xì)胞部分的方法為：患者經(jīng)采用血細(xì)胞分離機(jī)上的淋己細(xì)胞采 集程序，單采集患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞。6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備高細(xì)胞毒活性的CIK細(xì)胞的方法，其特征在于：步驟（2) 中，離屯、的轉(zhuǎn)速為1000~1500轉(zhuǎn)/分鐘，離屯、的時(shí)間為7~10分鐘。7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備高細(xì)胞毒活性的CIK細(xì)胞的方法，其特征在于：步驟（4) 所述繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)，每2~3天用含500~2000IU/mL重組人IL-2的完全培養(yǎng)基或含500~ 2000IU/mL重組人IL-2和100~500IU/mL重組人IL-1的完全培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)。8. 權(quán)利要求3-7任一所述的制備高細(xì)胞毒活性的CIK細(xì)胞的方法制備的CIK細(xì)胞。9. 權(quán)利要求1所述化合物（I)在制備高細(xì)胞毒活性的CIK細(xì)胞中的應(yīng)用。10. 權(quán)利要求8所述CIK細(xì)胞在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開一種天然產(chǎn)物及用其制備高細(xì)胞毒活性CIK細(xì)胞的方法，該天然產(chǎn)物為首次報(bào)道的新化合物，用該化合物制備高細(xì)胞毒活性CIK細(xì)胞包括：(1)取患者外周血，收集外周血單個(gè)核細(xì)胞部分；(2)將步驟(1)收集的外周血單個(gè)核細(xì)胞部分離心，棄去上清液，獲得單個(gè)核細(xì)胞；(3)取單個(gè)核細(xì)胞按照1×106/mL細(xì)胞，加入含500～2000IU/mLγ干擾素和80～120ng/mL該化合物的完全培養(yǎng)基，開始誘導(dǎo)培養(yǎng)；完全培養(yǎng)基包括含體積百分比為10％FBS的RPMI？1640細(xì)胞培養(yǎng)液；(4)步驟(3)的細(xì)胞培養(yǎng)20～28小時(shí)后，加入50～1000ng/mL抗人CD3單克隆抗體和500～2000IU/mL重組人IL-2，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)，每隔2～3天傳代培養(yǎng)一次，誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間為13～21天，獲得CIK細(xì)胞。該CIK細(xì)胞可用于免疫治療。
【IPC分類】C07D307/54, A61K35/17, C12N5/0783
【公開號(hào)】CN105237499
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510633403
【發(fā)明人】楊廷穩(wěn)
【申請(qǐng)人】楊廷穩(wěn)
【公開日】2016年1月13日
【申請(qǐng)日】2015年9月29日