一種天然產(chǎn)物及用其制備高細(xì)胞毒活性cik細(xì)胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于細(xì)胞免疫領(lǐng)域，涉及一種新的化合物在細(xì)胞免疫領(lǐng)域的應(yīng)用，具體涉 及一種檸檬苦素類化合物以及利用該化合物制備高細(xì)胞毒活性的CIK細(xì)胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 構(gòu)樹Broussonetiapapyrifera(L. )Vent.為?？茦?gòu)樹屬植物，分布于中國黃河、 長(zhǎng)江和珠江流域，日本、越南、印度等國亦有分布，資源十分豐富。構(gòu)樹的根、葉、果實(shí)和樹皮 在中醫(yī)里皆有使用。構(gòu)樹皮能利尿消腫，祛風(fēng)濕，還可以用于治療神經(jīng)性皮炎及癬癥；樹液 可以利水解毒，治水腫癬疾和蛇、蟲、蜂、蝎、狗咬；構(gòu)樹葉具有清熱涼血、利濕和殺蟲作用， 可用于鼻衄，腸炎，痢疾。構(gòu)樹果實(shí)也是中東地區(qū)重要的民間藥材。
[0003] 構(gòu)樹在我國分布廣泛，是一種藥用價(jià)值很高的植物，其葉、樹皮、根皮和果實(shí)在臨 床均有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。構(gòu)樹的化學(xué)成分復(fù)雜，國內(nèi)外研究者主要關(guān)注的化學(xué)成分包括黃酮 類、木脂素類和萜類。其中萜類又以二萜研究較多。二萜廣泛分布于植物界，植物分泌的乳 汁、樹脂等均以二萜類衍生物為主，尤以松柏科植物最為普遍，是一類由4個(gè)異戊二烯單位 構(gòu)成、含20個(gè)碳原子的化合物類群。結(jié)構(gòu)顯示多樣性，主要類型有貝殼杉烷、克羅烷、松香 烷、烏頭烷等。許多二萜的含氧衍生物具有多方面的生物活性，如紫杉醇、穿心蓮內(nèi)酯、關(guān)附 甲素、雷公藤內(nèi)酯、甜菊苷等都具有較強(qiáng)的生物活性。
[0004] 免疫治療作為腫瘤綜合治療的第四種模式，越來越受到重視。腫瘤免疫治療主要 包括腫瘤疫苗治療、細(xì)胞因子治療、過繼性細(xì)胞免疫治療及單克隆抗體免疫治療等。腫瘤 疫苗是利用腫瘤細(xì)胞或腫瘤抗原物質(zhì)誘導(dǎo)機(jī)體的特異性細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)，增強(qiáng)機(jī) 體的抗癌能力，阻止腫瘤的生長(zhǎng)、擴(kuò)散和復(fù)發(fā)。用于抗腫瘤研究的細(xì)胞因子主要有干擾素 類、白細(xì)胞介素類、集落刺激因子類等，其中以IFN-α、IL-2、粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子為 多。過繼性細(xì)胞免疫包括淋巴細(xì)胞因子活化的殺傷細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì) 胞、DC-CIK等。單克隆抗體免疫療法的現(xiàn)有研究結(jié)果表明，腫瘤分子靶向治療具有較好的 安全性和有效性，如小分子表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR)、酪氨酸激酶抑制劑、抗EGFR單克隆 抗體、抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子單克隆抗體以及其他分子靶向治療藥物，已在臨床中取得較好 的療效。
[0005]目前用于腫瘤細(xì)胞免疫治療的免疫活性細(xì)胞主要有腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞（TIL)、 樹突狀細(xì)胞（DC)以及細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（CIK)等。CIK細(xì)胞是一種殺傷力強(qiáng)的免疫 活性細(xì)胞，其主要效應(yīng)細(xì)胞的表面標(biāo)志為CD3+CD56+，與其他過繼性免疫治療細(xì)胞相比，具有 增殖速度快、殺瘤活性高、殺瘤譜廣等優(yōu)點(diǎn)。但是，腫瘤病人免疫功能受損，免疫細(xì)胞功能減 弱，因此，來源于腫瘤病人外周血制備的CIK細(xì)胞殺傷腫瘤能力低下，影響CIK細(xì)胞療效。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種結(jié)構(gòu)新穎的化合物以及利用該該化合物制備高細(xì)胞 毒活性的CIK細(xì)胞的方法，獲得的CIK細(xì)胞具有很強(qiáng)的增殖力，⑶3+、⑶8+和⑶3 +⑶56+細(xì)胞 的比例高，并且對(duì)腫瘤治療效果優(yōu)異。
[0007] 上述目的是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0008] 具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物（I)，
[0009]
[0010] 所述的化合物（I)的制備方法，包含以下操作步驟：(a)將構(gòu)樹的干燥根粉碎， 用75~85%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水飽 和的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b)步驟（a) 中乙酸乙酯萃取物用AB-8型大孔樹脂除雜，先用5%乙醇洗脫10個(gè)柱體積，再用75%乙醇 洗脫8個(gè)柱體積，收集75 %乙醇洗脫液，減壓濃縮得75 %乙醇洗脫物浸膏；（c)步驟（b)中 75 %乙醇洗脫物浸膏用正相硅膠分離，依次用體積比為90:1、55:1、25:1、8:1和2:1的二氯 甲烷-甲醇梯度洗脫得到5個(gè)組分；（d)步驟（c)中組分4用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用 體積比為12:1、8:1和4:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分；（e)步驟（d)中組分 2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為65%的甲醇水溶液等度洗脫， 收集9~10個(gè)柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合物（I)。
[0011] -種利用所述的化合物（I)制備高細(xì)胞毒活性的CIK細(xì)胞的方法，包括如下步 驟：（1)取患者外周血，收集外周血的單個(gè)核細(xì)胞部分；（2)將步驟（1)收集的外周血的單 個(gè)核細(xì)胞部分離心，棄去上清液，獲得單個(gè)核細(xì)胞；（3)取單個(gè)核細(xì)胞按照1X106/mL細(xì)胞， 加入含500~2000IU/mLy干擾素和80~120ng/mL化合物（I)的完全培養(yǎng)基，開始誘 導(dǎo)培養(yǎng)；其中，完全培養(yǎng)基，包括含體積百分比為10%FBS的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液；（4) 步驟（3)的細(xì)胞培養(yǎng)20~28小時(shí)后，加入50~1000ng/mL抗人⑶3單克隆抗體和500~ 2000IU/mL重組人IL-2,繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)，其中，每隔2~3天傳代培養(yǎng)一次，整個(gè)誘導(dǎo)培養(yǎng)的 時(shí)間為13~21天，獲得CIK細(xì)胞。
[0012] 進(jìn)一步地，所述的制備高細(xì)胞毒活性的CIK細(xì)胞的方法步驟（1)中所述收集外 周血的單個(gè)核細(xì)胞部分的方法為：(a)患者外周血中，加入1~1. 5倍體積的不含血清的 細(xì)胞培養(yǎng)液或pH7. 2PBS緩沖液稀釋，充分混勻；其中，細(xì)胞培養(yǎng)液包括：RPMI1640培養(yǎng) 液和頂DM培養(yǎng)液；(b)將步驟（a)獲得的血液稀釋液加入到淋巴細(xì)胞分離液的界面上； (c) 1500~2500轉(zhuǎn)/分鐘，離心15~20分鐘，收集中間層，獲得單個(gè)核細(xì)胞。
[0013] 進(jìn)一步地，所述的制備高細(xì)胞毒活性的CIK細(xì)胞的方法步驟（1)中所述收集外周 血的單個(gè)核細(xì)胞部分的方法為：患者經(jīng)采用血細(xì)胞分離機(jī)上的淋巴細(xì)胞采集程序，單采集 患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞。
[0014] 進(jìn)一步地，所述的制備高細(xì)胞毒活性的CIK細(xì)胞的方法步驟（2)中，離心的轉(zhuǎn)速為 1000~1500轉(zhuǎn)/分鐘，離心的時(shí)間為7~10分鐘。
[0015] 進(jìn)一步地，所述的制備高細(xì)胞毒活性的CIK細(xì)胞的方法步驟（4)所述繼續(xù)誘導(dǎo)培 養(yǎng)，每2~3天用含500~2000IU/mL重組人IL-2的完全培養(yǎng)基或含500~2000IU/mL重 組人IL-2和100~500IU/mL重組人IL-1的完全培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)。
[0016] 所述的制備高細(xì)胞毒活性的CIK細(xì)胞的方法制備的CIK細(xì)胞。
[0017] 所述化合物（I)在制備高細(xì)胞毒活性的CIK細(xì)胞中的應(yīng)用。
[0018] 所述CIK細(xì)胞在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
[0019] 本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明提供了一種檸檬苦素類新化合物，利用該化合物可以 獲得高純度、高增殖力和高細(xì)胞毒活性的CIK細(xì)胞，可用于腫瘤的細(xì)胞免疫治療。
【附圖說明】
[0020] 圖1為化合物（I)結(jié)構(gòu)式；
[0021] 圖2為化合物（I)理論E⑶值與實(shí)驗(yàn)E⑶值比較；
[0022] 圖3為外周血單個(gè)核細(xì)胞誘導(dǎo)制備的CIK細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖；
[0023]圖4為外周血單個(gè)核細(xì)胞誘導(dǎo)制備的CIK細(xì)胞的殺傷腫瘤細(xì)胞活性圖。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容。以下實(shí)施例中，所用的原料或 試劑除特別說明外，均為市售可得。所述患者指需要進(jìn)行CIK細(xì)胞免疫治療的患者，如癌癥 患者。另外，以下實(shí)施例中，涉及的完全培養(yǎng)基為含10% (體積百分比）FBS的RPMI1640 培養(yǎng)液；冷凍保護(hù)劑是含10% (體積百分比）DMS0的培養(yǎng)基，其中，該培養(yǎng)基是由70% (體 積百分比）RPMI1640培養(yǎng)液和20 % (體積百分比）FBS(胎牛血清）所構(gòu)成。
[0025] 實(shí)施例1:化合物（I)分離制備及結(jié)構(gòu)確證
[0026] 試劑來源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷為分析純，購自上海凌峰化 學(xué)試劑有限公司，甲醇，分析純，購自江蘇漢邦化學(xué)試劑有限公司。
[0027] 制備方法：（a)將構(gòu)樹的干燥根（10kg)粉碎，用80%乙醇熱回流提?。?5LX3 次），合并提取液，濃縮至無醇味（3L)，依次用石油醚（3LX3次）、乙酸乙酯（3LX3次）和 水飽和的正丁醇（3LX3次）萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物（386g)和正丁 醇萃取物；(b)步驟（a)中乙酸乙酯萃取物用AB-8型大孔樹脂除雜，先用5%乙醇洗脫10個(gè) 柱體積，再用75 %乙醇洗脫8個(gè)柱體積，收集75 %乙醇洗脫液，減壓濃縮得75 %乙醇洗脫物 浸膏（155g) ;(c)步驟（b)中75%乙醇洗脫浸膏用正相硅膠分離，依次用體積比為90:1(8 個(gè)柱體積）、55:1 (8個(gè)柱體積）、25:1 (8個(gè)柱體積）、8:1 (10個(gè)柱體積）和2:1 (5個(gè)柱體積） 的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到5個(gè)組分；（d)步驟（c)中組分4 (41g)用正相