分離發(fā)酵液成分的方法
【專利說明】分離發(fā)醒液成分的方法
[0001] 本申請是申請日為2010年06月03日、申請?zhí)枮?01080034314. 3、名稱為"分離 發(fā)酵液成分的方法"的發(fā)明申請的分案。
[0002] 本申請要求享有2009年6月4日提交的美國臨時申請第61/184, 292號的優(yōu)先權(quán)， 其全部內(nèi)容W引用方式并入本發(fā)明。
[000引發(fā)明背景
[0004] 本發(fā)明主要設(shè)及發(fā)酵液成分的分離W及，更具體地設(shè)及具有高于水的沸點的與水 可混溶化合物與其它發(fā)酵液成分的分離。
[0005]從環(huán)境和減少成本的角度考慮，存在設(shè)計能夠分離且可選地再循環(huán)發(fā)酵成分的工 藝方案的動機，所述的發(fā)酵成分包括細胞團塊、殘余培養(yǎng)基和培養(yǎng)基鹽、殘余基質(zhì)（例如薦 糖和/或葡萄糖）、W及水。人們也試圖為了循環(huán)細胞團塊W改善發(fā)酵的生產(chǎn)率作出努力。 在回收殘余培養(yǎng)基和培養(yǎng)基鹽W重新用于發(fā)酵的領(lǐng)域上就作比較少的努力。就此而言，大 多數(shù)努力都著重于減少初始培養(yǎng)基的成本而非下游回收。所得"低成本"培養(yǎng)基對于細胞 生長和產(chǎn)品生產(chǎn)而言通常并非最佳。通過開發(fā)有效回收培養(yǎng)基成分的方法，更優(yōu)化的培養(yǎng) 基配方可在初始原料成本的較少限制下使用。
[0006]大規(guī)模且有用純度的化合物分離是工藝化學(xué)中復(fù)雜的難題。僅在規(guī)模上的差異即 導(dǎo)致在實驗臺規(guī)模中開發(fā)的分離工藝變得不切實際或甚至在中試或商業(yè)規(guī)模中變得不可 行。從復(fù)雜混合物中分離化合物取決于很多因素，包括：化合物在室溫下是固體還是液體、 化合物的沸點、密度、極性、存不存在抑敏感官能團、相對于水在有機溶劑中的溶解度。運 些因素也適用于混合物中的所有其它成分，目標化合物將從中被分離。影響化合物（尤其 是有機化合物）的分離的另一性質(zhì)是其如何在兩種不混溶相之間分配，例如在水與有機溶 劑之間。強極性化合物在水中的溶解度通常高于在萃取過程中使用的常用有機溶劑。一些 化合物由于具有兩親性特性而尤其難W通過萃取方法從水中分離。兩親分子是同時具有極 性部分和親脂性部分的化合物。運些化合物可因產(chǎn)生難W處理的乳液而使通過萃取來分離 變得復(fù)雜。
[0007]另外，當一種化合物從發(fā)酵制備時，水量可明顯地高于目標化合物的量，從而需要 從復(fù)雜的混合物中分離次要成分。分離與水相比在更高溫度沸騰的化合物進一步增加了分 離的復(fù)雜性和成本，因為該化合物不能從發(fā)酵液直接蒸饋，例如乙醇發(fā)酵工藝中的情形。在 運點上，目標化合物與水的相互作用可導(dǎo)致兩種物質(zhì)在不同于兩種純的成分的沸點下W共 沸物形式進行共蒸饋。共沸物的形成不易預(yù)測。試圖從水中分離目標化合物時可能會減少 目標化合物的回收率。當化合物具有極性官能團時，另一關(guān)注的問題是其如何與在水相中 存在的其它化合物（例如，包括任何鹽和金屬離子）相互作用。
[0008] 存在于目標化合物中的官能團的性質(zhì)可能使鹽的分離變復(fù)雜。例如，化合物的一 個或多個官能團可能與陽離子或陰離子相互作用或馨合。陽離子或陰離子的馨合作用是W 尺寸依賴性的方式發(fā)生，并且也取決于官能團在目標化合物上的位置。馨合作用及其它相 互作用可使得一些鹽即使在不存在水的情況下也可溶于液體化合物中，而其它鹽可在不存 在水的情況下不可溶，盡管存在具有能夠與鹽相互作用的官能團的化合物。運些作用對鹽 的溶解度是難W預(yù)測的。進一步增加化合物與鹽相互作用的復(fù)雜性是任何共溶劑的性質(zhì)。 例如，在分離水可混溶性目標化合物期間，與水之間的氨鍵和其它相互作用可破壞鹽與目 標化合物的相互作用。因此，在一些情況下，在一定量水存在下，鹽能更易于與化合物分離。 然而，能夠平衡鹽過飽和從而使鹽通過結(jié)晶分離的水量（例如，在維持水破壞目標化合物 與任何鹽的馨合作用和其它相互作用的能力時）是難W預(yù)測的。
[0009] 開發(fā)分離方法中的又一難題是生物合成副產(chǎn)物（例如有機酸、過量基質(zhì)等等）的 潛在反應(yīng)活性。在加熱條件下，過量基質(zhì)可能會降解并導(dǎo)致產(chǎn)物具有不期望的顏色。此外， 一些副產(chǎn)物可與目標產(chǎn)物發(fā)生反應(yīng)，令到分離產(chǎn)率顯著降低。運些副產(chǎn)物可包括那些在發(fā) 酵期間形成的副產(chǎn)物W及在其分離工藝本身的步驟中所形成的副產(chǎn)物，例如在蒸饋、水份 蒸發(fā)等等期間升溫時由于降解過程而形成的副產(chǎn)物。
[0010] 因此，需要開發(fā)可從微生物發(fā)酵液分離沸點高于水的水可混溶性化合物的方法， 同時考慮循環(huán)其他發(fā)酵成分的環(huán)境和成本效益。本發(fā)明可滿足運需要也提供相關(guān)的優(yōu)點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 在某些方面，本發(fā)明所公開的實施方式設(shè)及從發(fā)酵液分離1，4-下二醇（1，4-BD0) 的方法，其包括：從包含細胞的固體部分分離富含1，4-BD0的液體部分，從所述的液體部分 去除水，從所述的液體部分去除鹽，和純化1，4-BD0。
[0012] 在其它方面，本發(fā)明所公開的實施方式設(shè)及從發(fā)酵液分離1，4-BD0的方法，其包 括：通過圓盤堆疊式離屯、去除一部分固體W取得液體部分，通過超濾從液體部分去除另一 部分固體，通過蒸發(fā)結(jié)晶從液體部分去除一部分鹽，通過離子交換從液體部分去除另一部 分鹽，和蒸饋1，4-BD0。
[0013] 在其它方面，本發(fā)明所公開的實施方式設(shè)及從發(fā)酵液分離1，4-BD0的方法，其包 括：通過圓盤堆疊式離屯、除去一部分固體W取得液體部分，通過超濾從液體部分去除另一 部分固體，通過納濾從液體部分去除一部分鹽，通過離子交換從液體部分去除另一部分鹽， 蒸發(fā)一部分水，和蒸饋1，4-BD0。
[0014] 在其它方面，本發(fā)明所公開的實施方式設(shè)及生產(chǎn)1，4-BD0的方法，其包括將產(chǎn)生 1，4-BD0的微生物在發(fā)酵罐中培養(yǎng)足夠時間W生產(chǎn)1，4-BD0。產(chǎn)生1，4-BD0的微生物包括具 有1，4-BD0途徑的微生物，該1，4-BD0途徑具有一個或多個編碼1，4-BD0途徑酶的外源基 因和/或一個或多個基因破壞。所述的方法進一步包括根據(jù)所述的分離方法分離1，4-BD0。
【附圖說明】
[0015] 圖1顯示從發(fā)酵液中純化1，4-BD0的方法的步驟的方框圖。
[0016] 圖2顯示圓盤堆疊式離屯、機的剖視圖。
[0017] 圖3顯示沉降式離屯、機的剖視圖。
[0018] 圖4顯示強制循環(huán)結(jié)晶器的示意圖。
[0019] 圖5顯示在有效體積中具有水平熱交換器和擋板的強制循環(huán)結(jié)晶器的示意圖。
[0020] 圖6顯示導(dǎo)流管和擋板結(jié)晶器的示意圖。
[0021] 圖7顯示誘導(dǎo)循環(huán)結(jié)晶器的示意圖。
[0022] 圖8顯示密閉型奧斯陸結(jié)晶器的示意圖。
[0023] 圖9顯示開放型奧斯陸結(jié)晶器的示意圖。
[0024] 圖10顯示降膜蒸發(fā)器的部分剖視圖。
[00巧]圖11顯示強制循環(huán)蒸發(fā)器的部分剖視圖。
[0026] 圖12顯示板式蒸發(fā)器的部分剖視圖。
[0027] 圖13顯示循環(huán)蒸發(fā)器的示意圖。
[0028] 圖14顯示流化床蒸發(fā)器的示意圖。
[0029] 圖15顯示用于生產(chǎn)和分離1，4-BD0的完整流程的示意圖。
[0030] 圖16顯示用于生產(chǎn)和分離1，4-BD0的另一種完整流程的示意圖。
[00引]發(fā)明詳述
[0032] 經(jīng)發(fā)酵生產(chǎn)商用化學(xué)品是替代使用不可再生礦物燃料為原料的傳統(tǒng)生產(chǎn)的有效 方式。由于能夠使用可再生原料（例如循環(huán)的生物質(zhì)等等），與基于礦物燃料的生產(chǎn)相比該 方法可顯示出更具經(jīng)濟和環(huán)境的合理性。從發(fā)酵產(chǎn)生的產(chǎn)物可用于許多應(yīng)用中。在具體實 施方式中，本發(fā)明提供生產(chǎn)1，4-BD0的方法。1,4-下二醇度DO)是一種聚合物中間體和工 業(yè)溶劑。在下游，下二醇可進一步轉(zhuǎn)化；例如，通過氧化轉(zhuǎn)化成丫 -下內(nèi)醋，其可進一步轉(zhuǎn)化 成化咯燒酬和N-甲基-化咯燒酬，或者其可W經(jīng)氨解而轉(zhuǎn)化成四氨巧喃。運些化合物具有 廣泛的用途如作為聚合物中間體、溶劑、和添加劑。
[0033] 本發(fā)明部分地設(shè)及從發(fā)酵液分離沸點高于水的水可混溶性化合物，同時可選地可 循環(huán)發(fā)酵液的其它成分的方法。該方法分離出可包括微生物有機體的細胞團塊，而該微生 物有機體已經(jīng)用基因插入、基因破壞或者插入與破壞的結(jié)合被改造，W從合適的原料有效 地產(chǎn)生化合物。
[0034] 無細胞培養(yǎng)液、或液體部分可通過進一步處理去除鹽。運可在從發(fā)酵液去除一些 或基本上所有水之前或之后通過多種方法完成。如上所述，鹽通常不能回收W循環(huán)于發(fā)酵 過程中。通常，任何回收的鹽包括期望的生物合成產(chǎn)物的鹽形式，例如乳酸鹽、巧樣酸鹽或 其它簇酸鹽產(chǎn)物或含胺產(chǎn)物的錠鹽等等，而不是培養(yǎng)基鹽等等。，本發(fā)明所述的方法可W回 收培養(yǎng)基鹽并且可選地返回至發(fā)酵中循環(huán)。該分離方法也包括除水，其可將水重新引入發(fā) 酵系統(tǒng)中。在最終純化中，若為固體的話，發(fā)酵產(chǎn)生的化合物可在除去細胞、鹽和水后從剩 余的液體部分蒸饋、或重結(jié)晶。在液體的情況下，可通過如分饋去完成最終純化。
[0035] 在一些實施方式中，本發(fā)明設(shè)及從發(fā)酵液分離沸點高于水的水可混溶性目標化合 物的方法。該方法包括：（1)從包含細胞的固體部分分離富含化合物的液體部分；（2)從該 液體部分去除水；（3)從該液體部分去除鹽；和（4)通過蒸饋或重結(jié)晶純化目標化合物。上 述步驟（2)和（3)可依次或同時進行。
[0036] 通過發(fā)酵得到的沸點高于水的目標化合物的沸點可比水高io°c、2(rc、3(rc、 40 °C、50 °C、60 °C、70 °C、80 °C、90 °C、100 °C、150 °C、200°C和 300°C和更高（包括之間的所 有值）。沸點高于水的目標化合物可包括，例如1，4-BDO、1，3-BDO、2, 3-BDO、1，3-PDO、 1，2-PD0(甲基乙基乙二醇）、1，2-乙二醇（乙二醇）；丫-下內(nèi)醋（GBL)、1，5-戊二醇、 1,6-己二醇。另外，目標化合物包括可與水混溶的那些化合物。在一些實施方式中，運種水 可混溶性化合物可能難W經(jīng)受常規(guī)萃取方法。此外，目標化合物包括那些中性化合物。本 發(fā)明所指的中性化合物是不具有能夠攜帶電荷的官能團（例如胺、簇酸、橫酸、棚酸等等） 的化合物。最后，如下文進一步所述，目標化合物可足夠小W便可透過納濾膜。示例性化合 物的種類包含醇、二醇、S醇（例如甘油）、四醇和多元醇等等。
[0037] 在一個【具體實施方式】中，目標化合物是1，4-BD0。1，4-BD0具有大約230°C的沸點， 并且可與水完全混溶。另外，還未鑒定可從水中經(jīng)濟地萃取1，4-BD0的溶劑。作為中性分 子，不能通過結(jié)晶來分離鹽的形式。1，4-BD0的分子量足夠低，如下文實施例III中所述，可 W通過納濾膜。另外，如下文實施例VI中所述，各種發(fā)酵培養(yǎng)基鹽在純1，4-BD0中的溶解 度相對較低。
[0038] 在一些實施方式中，本發(fā)明提供從發(fā)酵液分離1,4-下二醇（1,4-抓0)的方法，其 包括：（1)從包含細胞的固體部分分離富含1，4-BD0的液體部分；(2)從液體部分去除水； (3)液體部分去除鹽，和（4)純化1，4-BD0。
[0039] 所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認識到，考慮到本發(fā)明關(guān)于示例性化合物1，4-BD0所公開的 教導(dǎo)的指導(dǎo)，其它沸點高于水的水可混溶性目標化合物可使用相同方法進行分離。例如，本 發(fā)明公開的方法可W很容易地修改成能夠分離1,3-下二醇。因此，盡管許多實施例通過 1，4-BD0進行舉例說明，但應(yīng)理解，該方法很容易適用于其它沸點高于水的水可混溶性目標 化合物。
[0040] 在一些實施方式中，本發(fā)明設(shè)及從發(fā)酵液分離1，4-下二醇（1，4-抓0)的方法。該 方法包括從包含括細胞的固體部分分離富含1，4-BD0的液體部分。在從液體部分分離鹽之 前或之后，從液體部分蒸發(fā)水。在一些實施方式中，如下文進一步所述，在去除水后從已結(jié) 晶的鹽分離1，4-BD0。鹽在1，4-BD0中具有低的溶解度，因此所分離的1，4-BD0大約98% 不含鹽。在一些實施方式中，如下文進一步所述，在去除水之前通過特殊的過濾方法和/或 離子交換、或色譜方法分離鹽。
[0041] 本發(fā)明所用的"分離"是指包括純化步驟W獲得基本上純的目標化合物的方法。在
【具體實施方式】中，目標化合物包含1，4-BD0?；旧霞兊幕衔锇谝恍嵤┓绞街兄辽?98%不含鹽、在其它實施例中至少99%不含鹽、和在其它實施例中至少99. 5%不含鹽的化 合物。基本上純的化合物不含鹽外也不含其它雜質(zhì)的化合物，從而目標化合物在一些實施 方式中至少98%純、在其它實施方式中至少99%純、和在其它實施方式中至少99. 5%純。
[0042] 本發(fā)明所用的術(shù)語"液體部分"是指在從發(fā)酵液去除固體物質(zhì)獲得的離屯、分離液 或上清液。除去的固體物質(zhì)包括一些、基本上所有、或所有的固體物質(zhì)。例如，在離屯、分離 中，液體部分是從固體分離的離屯、分離液或上清液。液體部分也是通過膜過濾后獲得的滲 透液或上清液的部分。液體部分也是在應(yīng)用一種或多種過濾方法后獲得的濾液或上清液的 部分。
[0043] 本發(fā)明所用的術(shù)語"固體部分"是指發(fā)酵液的一部分，其含有不溶性物質(zhì)的發(fā)酵 液。運種不溶性物質(zhì)包含，例如，細胞、細胞碎片、沉淀的蛋白質(zhì)和細粒等等。細粒是指細小 的，通常無定型的固體。細粒也可在結(jié)晶期間或從發(fā)酵液除水期間產(chǎn)生。細?？捎赡繕嘶?合物組成，該目標化合物可被溶解并重結(jié)晶出來。細?？砂ㄒ蜻^小而不能在膜過濾中截 留的固體部分。
[0044] 本發(fā)明所用的術(shù)語"鹽"，可與培養(yǎng)基鹽和發(fā)酵培養(yǎng)基鹽互換使用，其是指在發(fā)酵 液中使用的溶解的離子化合物。發(fā)酵液中的鹽可包含，例如氯化鋼、氯化鐘、氯化巧、氯化 錠、硫酸儀、硫酸錠、和緩沖液，例如鋼和/或鐘和/或錠鹽的憐酸鹽、巧樣酸鹽、乙酸鹽、和 棚酸鹽。
[0045] 本發(fā)明所用的術(shù)語"基本上所有"在用于指去除水或鹽時是指去除至少95%的水 或鹽。"基本上所有"也可包含去除至少96%、97%、98%、99%、或99. 9%，或之間的任何 值。
[0046] 本發(fā)明所用的術(shù)語"基因破壞"或其語法同義詞意思是使所編碼的基因產(chǎn)物失活 的遺傳改變。該遺傳改變可W是，例如整個基因的缺失、轉(zhuǎn)錄或翻譯所需的調(diào)控序列的缺 失、導(dǎo)致基因產(chǎn)物截短的基因的一部分缺失，或者使所編碼基因產(chǎn)物失活的各種突變策略 中的任何一種。一種特別有用的基因破壞方法是基因完全缺失，因為其減少或消除了在本 發(fā)明非自然發(fā)生的微生物中遺傳回復(fù)變異的發(fā)生。
[0047] 本發(fā)明所用的術(shù)語"微生物"意思是具有顯微粒徑的原核或真核細胞或有機體。該 術(shù)語意欲包含所有種類的細菌和真核有機體，例如酵母和真菌。該術(shù)語也包含可經(jīng)培養(yǎng)用 于產(chǎn)生生物化學(xué)物質(zhì)的任何物種的細胞培養(yǎng)物。
[0048] 本發(fā)明所用的術(shù)語"產(chǎn)生1，4-BD0的微生物"意思是改造成能生物合成有效量的 1，4-BD0的微生物。經(jīng)改造的有機體可包括基因插入，其包括質(zhì)粒插入和/或染色體插入。 經(jīng)改造的有機體也可包括基因破壞W通過期望的途徑進一步優(yōu)化碳通量來生產(chǎn)1，4-BD0。 產(chǎn)生1，4-BD0的有機體可包括插入與缺失的組合。
[0049]如本發(fā)明所用的"外源"意思是將參照分子或參照活性引入宿主微生物有機體中。 例如，可通過將編碼核酸引入宿主遺傳物質(zhì)中來引入分子，比如通過整合至宿主染色體中 或作為非染色體遺傳物質(zhì)，例如質(zhì)粒。因此，當用于提及編碼核酸的表達時，該術(shù)語是指W 可表達形式將編碼核酸引入微生物有機體中。當用于提及生物合成活性時，該術(shù)語是指引 入宿主參照有機體中的活性。來源例如可W是同源或異源的編碼核酸，其在引入宿主微生 物有機體中后可表達參照活性。因此，術(shù)語"內(nèi)源"是指在宿主中存在的參照分子或活性。 同樣，當用于提及編碼核酸的表達時，該術(shù)語是指包含在微生物有機體中的編碼核酸的表 達。術(shù)語"異源"是指來源于除參照物種外的來源的分子或活性，而"同源"是指來源于宿 主微生物有機體的分子或活性。因此，本發(fā)明的編碼核酸的外源表達可使用異源或同源編 碼核酸中的任一種或兩種。
[0050] 在一些實施方式中，本發(fā)明提供一種從發(fā)酵液純化目標化合物的方法。適用化合 物包含具有高于水的沸點和低的鹽溶解度的化合物。目標化合物也包含可與水混溶的化合 物。示例性目標化合物是1，4-BD0。該方法包括從包含細胞團塊的固體部分分離含有目標 產(chǎn)物的液體部分。該目標產(chǎn)物可W是沸點高于水的任何化合物。細胞團塊包含用于生產(chǎn)目 標化合物的的微生物有機體。固體部分也包含細胞碎片、細粒、蛋白質(zhì)、和來自發(fā)酵的其它 不溶性物質(zhì)。
[0051]分離方法也包括從液體部分去除鹽和水。去除的順序并不重要。在一些實施方式 中，可部分地去除鹽，隨后去除基本上所有的水，和然后除去剩余的鹽。在其它實施方式中， 可部分地去除水，隨后去除基本上所有的鹽，和然后除去剩余的水。在其它實施方式中，可 部分地去除水，隨后從發(fā)酵液分離固體部分。在其它實施方式中，最終去除基本上所有的水 可作為純化步驟的一部分，例如通過蒸饋進行。如下文實施例VI中所公開的，純的1，4-BD0 不會使典型發(fā)酵培養(yǎng)基鹽明顯溶解。因此，1，4-BD0可通過從液體部分蒸發(fā)水來與鹽分離。 如下文實施例V中所示，當1，4-BD0的濃度為大約30%重量時，鹽開始結(jié)晶析出。在一些實 施方式中，通過去除水來結(jié)晶或沉淀鹽已分離1，4-BD0后，1，4-BD0是至少98%不含鹽。從 實施例VI可發(fā)現(xiàn)，密切相關(guān)的同系物乙二醇和丙二醇也明顯使發(fā)酵鹽溶解。因此，即使去 除基本上所有的水之后，也可使用其它方法來去除鹽。
[0052] 最后當已除去鹽和水時，剩余液體或固體可進行最終純化。當目標產(chǎn)物是液體時， 純化可通過蒸饋例如包括分饋或多次蒸饋完成。當目標產(chǎn)物是固體時，純化可通過重結(jié)晶 完成。
[0053] 產(chǎn)生和分離目標化合物和循環(huán)各種發(fā)酵液成分的總體過程概括在圖1的方框流 程圖中。步驟100是使用碳原料例如薦糖發(fā)酵，來生產(chǎn)目標化合物。步驟110是從發(fā)酵液 分離細胞W取得液體部分，其中步驟1