一種靈芝菌的深層發(fā)酵方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于藥用真菌深層發(fā)酵生產(chǎn)技術(shù)及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種靈芝菌的 深層發(fā)酵方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 靈芝（Ganoderma Iucidum)是擔(dān)子菌綱多孔菌科（Polyporaceae)靈芝屬 (Ganodelma)真菌赤芝G. Iucidum .karst和紫芝G. japonicrnLloyd的總稱，具有扶正固 本等功效，被《本經(jīng)》稱為上品。近年來，對靈芝屬真菌的化學(xué)成分及臨床研宄頗多，對靈芝 的生殖細(xì)胞一一孢子藥用價(jià)值的研宄也頗受重視。
[0003] 靈芝孢子褐色，卵形，一端平截，（8. 5~IL 2) μ mX (5. 2~6.9) μ m，具雙層壁。 在每個(gè)孢子的褐色內(nèi)層產(chǎn)生許多針狀小突起，深深地伸入孢子壁的透明外層，外層孢壁光 滑。靈芝孢子包裹的兩層壁十分堅(jiān)韌，一般的化學(xué)，物理方法很難將其打破，故限制了對其 化學(xué)成分、生物活性成分的研宄。
[0004] 靈芝在全國最大的原始森林，長白山和海南自然保護(hù)區(qū)最適宜生長。但是由于多 年來人類的過度采摘，野生靈芝的存量越來越少。靈芝對多種理化及生物因素引起的肝損 傷有保護(hù)作用。無論在肝臟損害發(fā)生前還是發(fā)生后，服用靈芝都可保護(hù)肝臟，減輕肝損傷。 靈芝能促進(jìn)肝臟對藥物、毒物的代謝，對于中毒性肝炎有確切的療效。尤其是慢性肝炎，靈 芝可明顯消除頭暈、乏力、惡心、肝區(qū)不適等癥狀，并可有效地改善肝功能，使各項(xiàng)指標(biāo)趨于 正常。所以，靈芝可用于治療慢性中毒、各類慢性肝炎、肝硬化、肝功能障礙。靈芝可有效地 擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈，增加冠脈血流量，改善心肌微循環(huán)，增強(qiáng)心肌氧和能量的供給，因此，對心肌 缺血具有保護(hù)作用，可廣泛用于冠心病、心絞痛等的治療和預(yù)防。另外，服用靈芝后可取代 胰島素抑制脂肪酸的釋出，可改善血糖、尿糖等癥狀。靈芝中的水溶性多糖，可減輕非胰島 素依賴型糖尿病的發(fā)病程度。
[0005] 靈芝屬的化學(xué)成分較為復(fù)雜，且因所用菌種、菌種產(chǎn)地、栽培方法、提取工藝、制劑 方法不同而各異。靈芝屬的子實(shí)體、菌絲體和孢子中含有多糖類、核苷類、呋喃類衍生物、留 酵類、生物堿類、蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸類、三萜類、倍半萜、有機(jī)鍺、無機(jī)鹽等。靈芝多糖是靈 芝的主要有效成分之一。
[0006] 靈芝一般生長在濕度高且光線昏暗的山林中，主要生長在腐樹或是其樹木的根 部。靈芝不是植物，自身不能進(jìn)行光合作用，只能從其他有機(jī)物或是腐樹中攝取養(yǎng)料。靈芝 是一種堅(jiān)硬、多孢子和微帶苦澀的大型真菌。當(dāng)達(dá)到成熟期的靈芝就會噴出粉狀的孢子，從 而進(jìn)行繁殖。現(xiàn)在野生的靈芝已經(jīng)很少見，且質(zhì)量不容易控制。
[0007] 靈芝及靈芝生物活性物質(zhì)因其獨(dú)特的理化特性和神奇的生物學(xué)功能而成為新型 的保健食品和藥品領(lǐng)域的研宄熱點(diǎn)。然而，人工栽培靈芝的生長周期長(大于2~3個(gè)月）， 受環(huán)境影響大，產(chǎn)量低、品質(zhì)不穩(wěn)定，生產(chǎn)成本高，極大地影響了靈芝及其生物活性物質(zhì)在 健康產(chǎn)業(yè)中的發(fā)展。因此，近年來運(yùn)用生物工程技術(shù)，對靈芝菌液體深層發(fā)酵培養(yǎng)的研宄， 獲得靈芝菌絲體及其活性生長代謝產(chǎn)物(靈芝酸、靈芝多糖等)，并通過發(fā)酵條件的控制，縮 短生產(chǎn)周期，降低生產(chǎn)成本，使靈芝及其生物活性物質(zhì)在食品和藥品中得到應(yīng)用和推廣。
[0008] 人參(學(xué)名：Panax ginseng)，是具有肉質(zhì)的根，可藥用。人參屬于五加科，主要生 長在東亞，特別是寒冷地區(qū)。人參是常見藥材，用于愈后恢復(fù)、增強(qiáng)體力、調(diào)節(jié)荷爾蒙、降低 血糖和控制血壓、控制肝指數(shù)和肝功能保健等。人參根部所含皂苷是其有效成分，中國長白 山野參皂苷成分較高，但取得不易，價(jià)格高昂。人參營養(yǎng)成分含量（每100克）熱量80.0 大卡碳水化合物21. 2克脂肪0. 7克蛋白質(zhì)0. 6克纖維素3. 5克，既是產(chǎn)生發(fā)酵培養(yǎng)基碳源 和氮源的有效物質(zhì)，又可促進(jìn)衍生營養(yǎng)成分的代謝產(chǎn)物。
[0009] 蜂花粉(學(xué)名POLLEN)，花粉含有多種營養(yǎng)物質(zhì)，其中包括22種氨基酸、14種維生 素和30多種微量元素以及大量的活性蛋白酶、核酸、黃酮類化合物及其它活性物質(zhì)?；ǚ?富含的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)20 % -25 %，氨基酸總量20 %以上，游離氨基酸1 % -2 %，碳水化合物 40% -50%，脂肪5% -10% ;還有豐富的天然維生素、微量元素、酶類、激素、生物活性物質(zhì) 等多種營養(yǎng)物質(zhì)。特別是B族維生素的含量極為豐富。每100克花粉含硫胺素600微克， 核黃素1670微克，吡哆醇900微克，泛酸2700微克，煙酸10000微克。它含有多種礦物質(zhì)， 這些礦物質(zhì)中，一些元素的含量分別是：鉀20~40%、鎂1~20%、鈣1~15%、鐵1~12%、 硅2~10%、磷1~20%。以及大量的的活性蛋白酶、核酸、黃酮類化合物及其它活性物質(zhì)等。 作為復(fù)合碳源氮源進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)，有利于菌絲體生長。
[0010] 靈芝孢子粉(英文名：Ganoderma spore)。靈芝孢子粉粗蛋白含量為18. 12%，氨基 酸含量為5. 869%，粗脂肪含量為20. 39%。不飽和脂肪酸是優(yōu)勢脂肪酸.以油酸，亞油酸為 主。還含有豐富的三萜類化合物、多種有益礦物元素。以靈芝孢子粉靈芝深層發(fā)酵培養(yǎng)基 的原料之一，能夠促進(jìn)菌絲體胞外多糖合成的前體誘導(dǎo)物而促使胞外多糖的大量合成。其 生物量、粗多糖及粗靈芝酸含量均較高，有利于靈芝活性物質(zhì)（靈芝酸）的形成和靈芝酸含 量的提尚。
[0011] 茯苓(學(xué)名Wolfiporia cocos)。茯苓營養(yǎng)豐富，每100克茯苓的營養(yǎng)成分：能量16 千卡、蛋白質(zhì)1. 2克、脂肪0. 5克、碳水化合物82. 6克、膳食纖維80. 9克、核黃素0. 12克、 鉀58毫克、鈉1毫克、鈣2毫克、鎂8毫克、鐵9. 4毫克、錳1. 39毫克、鋅0. 44毫克銅0. 23 毫克磷32毫克、硒4. 55微克、煙酸0. 4毫克等等。將茯苓粉作為中藥培養(yǎng)基原料，可以促 進(jìn)靈芝多糖的合成，有利于靈芝多糖含量的提高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 本發(fā)明的目的在于提供一種靈芝菌的深層發(fā)酵方法，具有目的產(chǎn)物的產(chǎn)量高、質(zhì) 量穩(wěn)定、菌絲體生長良好、發(fā)酵周期短、生產(chǎn)工藝簡單、提取得率高、營養(yǎng)物質(zhì)豐富、成本低 等特點(diǎn)，是一項(xiàng)經(jīng)濟(jì)效益顯著的環(huán)保型的藥用真菌深層發(fā)酵技術(shù)，具有顯著的開發(fā)應(yīng)用前 景。
[0013] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案： 一種靈芝菌的深層發(fā)酵方法，其特征在于：包括以下步驟： (1) 將接種的斜面放于26-28°C下培養(yǎng)5-7d ; (2) 將長滿菌絲體的斜面接種于液體培養(yǎng)基，于搖床轉(zhuǎn)速80-100r/min，沖程7-8cm往 復(fù)震蕩，26-28 °C振蕩培養(yǎng)2-3d，制成種子懸浮液； (3) 種子罐種子培養(yǎng)，按種量15%-20%、溫度27-30°C，光照條件：連續(xù)黑暗條件，攪拌速 度160-180r/min，無菌空氣通氣量為每分鐘2. 5m3,罐壓0. 04MPa，發(fā)酵培養(yǎng)48-72h ;pH降至 4. 5-5. 0 ； (4) 發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)：接種量25-30%，溫度27-30°C，攪拌速度為150-200r/min，無菌 空氣通氣量為每分鐘2m 3,罐壓0. 05MPa，培養(yǎng)48-72h ;發(fā)酵液變稠，菌體開始自溶，pH降至 3. 0-3. 5,殘?zhí)橇拷抵?0· 2-0. 3% ; (5) 酶解：加入復(fù)合蛋白酶0. 5%，淀粉酶0. 75%，纖維素酶0. 75% ;蛋白酶為2X105u/kg， 淀粉酶為I. 〇Xl〇5u/kg，纖維素酶為I. 5X105u/kg ;溫度55-60°C，時(shí)間3-4h。
[0014] 斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯煮汁1000 mU脫脂奶粉30g、葡萄糖30g、瓊脂30g、蛋白胨 30g、酵母膏5g、硫酸鎂0· 2g、維生素 BI 0· lg，pH自然； 深層發(fā)酵培養(yǎng)基，按重量百分?jǐn)?shù)計(jì)：人參粉2. 0%、蜂花粉2. 0%、靈芝孢子粉1. 0%、茯苓 粉1. 0%、大豆粉2. 0%、酵母粉0. 5%、葡萄糖3. 0%、硫酸鎂0. 2%、磷酸氫二鉀0. 3%、氯化鈉 0. 2%、維生素 Bl 0. 1%、山茶油0. 3%，余量為水，pH=6-7,粉末細(xì)度：80-100目。
[0015] 發(fā)酵產(chǎn)物的提取方法包括以下步驟： (1) 高壓均質(zhì)處理：經(jīng)酶解處理的發(fā)酵液先經(jīng)膠體磨均質(zhì)，旋轉(zhuǎn)磨轉(zhuǎn)速800-1000r/ min，使菌絲體顆粒崩解，達(dá)到均質(zhì)，再經(jīng)高壓均質(zhì)機(jī)，使發(fā)酵液在40MPa-60MPa高壓作用下 通過200目膜過濾； (2) 超臨界0)2萃?。涸诔R界狀態(tài)下，將超臨界二氧化碳與待分離的物質(zhì)接觸，使其有 選擇性地把沸點(diǎn)高低和分子量大小不同的成分依次萃取析出有效活性物質(zhì)； (3) 發(fā)酵液濃縮：將發(fā)酵液濃縮至濃度Brix=28-32% ; (4) 采用真空冷凍干燥，冷阱溫度< -60°C，獲得發(fā)酵產(chǎn)物靈芝多糖和靈芝三萜活性物 質(zhì)干粉制品。
[0016] 本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn)在于：選用人參、蜂花粉、靈芝孢子粉和茯苓等天然中草藥原料 作為靈芝菌深層發(fā)酵培養(yǎng)基，具有目的產(chǎn)物的產(chǎn)量高、質(zhì)量穩(wěn)定、菌絲體生長良好、發(fā)酵周 期短、生產(chǎn)工藝簡單、提取得率高、營養(yǎng)物質(zhì)豐富、成本低等特點(diǎn)，是一項(xiàng)經(jīng)濟(jì)效益顯著的環(huán) 保型的藥用真菌深層發(fā)酵技術(shù)，具有顯著的