洗2-3次，直至上清液為無色。最 后于離心機(jī)中1000~1500 g離心8-15 min，去除上清液，得到緊密的紅細(xì)胞壓積，用PBS 稀釋成濃度為20% (體積，v/v)的紅細(xì)胞懸液。單獨(dú)用100 yg/mL的合成多肽處理紅細(xì) 胞，以0. 1 mL 20%紅細(xì)胞懸液和0.3 mL PBS共同孵育2 h作為空白對(duì)照組，確定樣品不 具有溶血性。
[0021] 應(yīng)用實(shí)施例1 0. 1 mL 20%紅細(xì)胞懸液經(jīng)0. 1 mL濃度為0 yg/mL的合成多肽(用PBS取代，即為模 型組）預(yù)處理20 min后，加入0.2 mL終濃度為100 mM的AAPH溶液，微震、避光孵育 2 h，取各處理組的反應(yīng)物溶液50 yL用PBS緩沖液稀釋至1 mL，1500 g離心12 min， 取上清液于96孔板中，用酶標(biāo)儀在540 nm處測(cè)其吸光度，同樣地，用蒸餾水稀釋反應(yīng)混 合物作為全溶血對(duì)照，計(jì)算溶血率。（結(jié)果見圖2)同時(shí)，將各處理組細(xì)胞用離心機(jī)于1500 g 離心12 min，收集細(xì)胞沉淀，用PBS洗3次離心，棄去上清液，再次重懸。制片時(shí)，取10 y L 紅細(xì)胞重懸液均勻涂于潔凈的云母片上(要求細(xì)胞無重疊、不團(tuán)聚)，然后用2. 5% (體積，v/ v)的戊二醛固定細(xì)胞，5 min后，用超純水沖洗娃片3次，自然風(fēng)干娃片，最后置于原子力顯 微鏡上，在輕敲模式下掃描觀察細(xì)胞形貌，用NanoScope軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)(結(jié)果見圖3)。
[0022] 圖2為合成多肽添加后進(jìn)行AAPH損傷的正常人紅細(xì)胞溶血抑制率變化曲線。 結(jié)果表明，l-lOKg/mL范圍內(nèi)，合成多肽的濃度與紅細(xì)胞的溶血抑制率呈現(xiàn)濃度依賴性顯 著增加的方式，繼續(xù)增大濃度到100呢/mL，溶血抑制率沒有顯著性變化。其中橫坐標(biāo)為 Concentration (濃度）、縱坐標(biāo)為 Hemolysis inhibition (溶血抑制率）。
[0023] 圖3為不同處理組紅細(xì)胞的原子力顯微鏡（AFM)成像圖。其中a為正常紅細(xì)胞， b為100 mM的AAPH處理2 h的紅細(xì)胞，c為用100 Pg/mL的合成肽Val-Thr-Ala-Pro -Ala-Ala-Ser-Val-Ala-Leu 預(yù)處理 20 min 之后再加 100 mM AAPH 培養(yǎng) 2 h 的紅細(xì)胞。 結(jié)果表明，正常紅細(xì)胞具有典型的雙凹面結(jié)構(gòu)，細(xì)胞表面光滑，四周高度基本一致。AAPH處 理組細(xì)胞表面變得粗糙，細(xì)胞嚴(yán)重塌陷，高度降低，形狀不規(guī)則。合成多肽預(yù)處理的保護(hù)組， 細(xì)胞損傷程度明顯減弱，四周高度明顯增加，呈現(xiàn)圓形結(jié)構(gòu)。
[0024] 應(yīng)用實(shí)施例2 0. 1 mL 20%紅細(xì)胞懸液經(jīng)0. 1 mL濃度為1 yg/mL的合成多肽預(yù)處理20 min后，加 入0.2 mL終濃度為100 mM的AAPH溶液，微震、避光孵育2 h，取各處理組的反應(yīng)物溶 液50 yL用PBS緩沖液稀釋至1 mL，1500 g離心12 min，取上清液于96孔板中，用 酶標(biāo)儀在540 nm處測(cè)其吸光度，同樣地，用蒸餾水稀釋反應(yīng)混合物作為全溶血對(duì)照，計(jì)算 溶血率(結(jié)果見圖2)。
[0025] 應(yīng)用實(shí)施例3 0. 1 mL 20%紅細(xì)胞懸液經(jīng)0. 1 mL濃度為5 yg/mL的合成多肽預(yù)處理20 min后，加 入0.2 mL終濃度為100 mM的AAPH溶液，微震、避光孵育2 h，取各處理組的反應(yīng)物溶 液50 yL用PBS緩沖液稀釋至1 mL，1500 g離心12 min，取上清液于96孔板中，用 酶標(biāo)儀在540 nm處測(cè)其吸光度，同樣地，用蒸餾水稀釋反應(yīng)混合物作為全溶血對(duì)照，計(jì)算 溶血率(結(jié)果見圖2)。
[0026] 應(yīng)用實(shí)施例4 0. 1 mL 20%紅細(xì)胞懸液經(jīng)0. 1 mL濃度為10 yg/mL的合成多肽預(yù)處理20 min后， 加入0.2 mL終濃度為100 mM的AAPH溶液，微震、避光孵育2 h，取各處理組的反應(yīng)物 溶液50 yL用PBS緩沖液稀釋至1 mL，1500 g離心12 min，取上清液于96孔板中， 用酶標(biāo)儀在540 nm處測(cè)其吸光度，同樣地，用蒸餾水稀釋反應(yīng)混合物作為全溶血對(duì)照，計(jì) 算溶血率(結(jié)果見圖2)。
[0027] 應(yīng)用實(shí)施例5 0. 1 mL 20%紅細(xì)胞懸液經(jīng)0. 1 mL濃度為100 yg/mL的合成多肽預(yù)處理20 min后， 加入0.2 mL終濃度為100 mM的AAPH溶液，微震、避光孵育2 h，取各處理組的反應(yīng)物 溶液50 yL用PBS緩沖液稀釋至1 mL，1500 g離心12 min，取上清液于96孔板中， 用酶標(biāo)儀在540 nm處測(cè)其吸光度，同樣地，用蒸餾水稀釋反應(yīng)混合物作為全溶血對(duì)照，計(jì) 算溶血率。（結(jié)果見圖2)同時(shí)，將各處理組細(xì)胞用離心機(jī)于1500 g離心12 min，收集細(xì)胞 沉淀，用PBS洗3次離心，棄去上清液，再次重懸。制片時(shí)，取10 y L紅細(xì)胞重懸液均勻涂 于潔凈的云母片上(要求細(xì)胞無重疊、不團(tuán)聚)，然后用2. 5%的戊二醛固定細(xì)胞，5 min后，用 超純水沖洗硅片3次，自然風(fēng)干硅片，最后置于原子力顯微鏡上，在輕敲模式下掃描觀察細(xì) 胞形貌，用NanoScope軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)(結(jié)果見圖3)。
[0028] 應(yīng)用實(shí)施例6 0. 1 mL 20%紅細(xì)胞懸液經(jīng)0. 1 mL濃度為0 yg/mL (用PBS取代，即為正常對(duì)照組） 的合成多肽預(yù)處理20 min后，加入0. 2 mL終濃度為0 mM的AAPH溶液(用PBS取代， 即為正常對(duì)照)，微震、避光孵育2 h，取各處理組的反應(yīng)物溶液50 iiL用PBS緩沖液稀 釋至1 mL，1500 g離心12 min，取上清液于96孔板中，用酶標(biāo)儀在540 nm處測(cè)其吸光 度，同樣地，用蒸餾水稀釋反應(yīng)混合物作為全溶血對(duì)照，計(jì)算溶血率。（結(jié)果見圖2)同時(shí)，將 各處理組細(xì)胞用離心機(jī)于1500 g離心12 min，收集細(xì)胞沉淀，用PBS洗3次離心，棄去上 清液，再次重懸。制片時(shí)，取10 yL紅細(xì)胞重懸液均勻涂于潔凈的云母片上(要求細(xì)胞無重 疊、不團(tuán)聚)，然后用2. 5%的戊二醛固定細(xì)胞，5 min后，用超純水沖洗硅片3次，自然風(fēng)干硅 片，最后置于原子力顯微鏡上，在輕敲模式下掃描觀察細(xì)胞形貌，用NanoScope軟件分析實(shí) 驗(yàn)數(shù)據(jù)(結(jié)果見圖3)。
[0029] 應(yīng)用實(shí)施例7 表3
0. 1 mL 20%紅細(xì)胞懸液經(jīng)0. 1 mL濃度為5 yg/mL (用PBS取代，即為正常對(duì)照組） 的合成多肽預(yù)處理20 min后，加入0. 2 mL終濃度為0 mM的AAPH溶液(用PBS取代， 即為正常對(duì)照)，微震、避光孵育2 h，將各處理組細(xì)胞用離心機(jī)于1500 g離心12 min，收 集細(xì)胞沉淀，用PBS洗3次離心，加入4°C預(yù)冷的超純水，150r/min震蕩lOmin，10000g離心 30min，收集上清液備用，按照試劑盒(南京建成)的說明書進(jìn)行測(cè)定其中的SOD活性(結(jié)果見 表3)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種十肽，其特征是該合成十肽的氨基酸序列為Val-Thr-Ala-Pro-Ala-Ala-Ser-V al -Ala-Leu02. 權(quán)利要求1所述的一種十肽的應(yīng)用，其特征在于將所述十肽與紅細(xì)胞混合，在AAPH 的作用下，孵育2 h后，使得細(xì)胞溶血抑制率為57. 74%~80. 66%，其形貌比單純AAPH處理組 光滑、有序；所述十肽的濃度為1-100 呢/mL。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述十肽能使細(xì)胞溶血抑制率高達(dá) 80. 66 ±1. 09%。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述十肽能使細(xì)胞SOD活性由2. 5976 mgprot/mL 上升到 5. 2740 mgprot/mL ;所述十肽濃度為 100 Kg/mL。5. 權(quán)利要求1所述的一種十肽的應(yīng)用，其特征在于，在UVB的作用下，將所述十肽與 人皮膚成纖維細(xì)胞混合，孵育72 h后，使得細(xì)胞存活率提高了 7. 8-22. 74%，同時(shí)，膠原蛋白 得率提高了 4. 69-17. 96%，所述十肽的濃度為1-10 Pg/mL。6. 權(quán)利要求1所述的一種十肽在制備生物醫(yī)藥或化妝品中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種十肽及其應(yīng)用，所述合成多肽的氨基酸序列如下所示：Val-Thr-Ala-Pro-Ala-Ala-Ser-Val-Ala-Leu，縮寫為VTAPAASVAL，分子量899.4，純度93.8%。本發(fā)明的多肽使用多肽合成儀，采用固相合成法合成。發(fā)明的目的是提供一種具有保護(hù)紅細(xì)胞溶血以及促進(jìn)人皮膚成纖維細(xì)胞的增殖和膠原蛋白產(chǎn)生的多肽的合成方法，為其在生物制藥、化妝品等領(lǐng)域的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
【IPC分類】A61Q19/08, A61P17/18, C07K7/06
【公開號(hào)】CN105153282
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510634074
【發(fā)明人】張學(xué)武, 曾巧輝
【申請(qǐng)人】華南理工大學(xué)
【公開日】2015年12月16日
【申請(qǐng)日】2015年9月28日