一種十肽及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物制藥與化妝品等領域，具體涉及一種合成多肽及其應用。
【背景技術】
[0002] 生物活性肽是具有多種人體代謝和生理調(diào)節(jié)功能，易消化吸收，有促進免疫調(diào)節(jié)、 抗菌、降血壓、抗癌、抗氧化等作用的二肽到復雜的線性、環(huán)形結構的不同肽類的總稱，由25 個天然氨基酸通過肽鍵以不同組成和排列方式構成。活性肽安全性極高，是當前國際食品 界最熱門的研究課題和極具發(fā)展前景的功能因子?，F(xiàn)代營養(yǎng)學表明，蛋白質(zhì)經(jīng)消化道酶作 用后并不完全以游離氨基酸的形式吸收，大多以低肽的形式吸收，并且低肽比游離氨基酸 具有更高的營養(yǎng)價值和生物效價。
[0003] 構建細胞氧化損傷模型是評價樣品是否具有抗氧化能力的常用方法，而紅細胞由 于來源豐富、取材方便，是體外生物實驗中的常用材料。自由基首先攻擊紅細胞膜上的脂 質(zhì)和蛋白質(zhì)，使細胞膜破損，釋放出紅細胞中的血紅蛋白，稱為紅細胞溶血。AAPH、H 202和 Hemin為常用的誘導紅細胞溶血的物質(zhì)。
[0004] 原子力顯微鏡（AFM)是一種高分辨率的新型成像工具，在生物醫(yī)學界已被廣泛用 于細胞形貌及其超微結構的表征，其原理是通過檢測探針掃描樣品時所產(chǎn)生的原子間相互 作用力來獲得樣品形貌結構信息，經(jīng)計算機軟件處理成像。自由基攻擊細胞膜使之結構和 功能喪失，發(fā)生細胞溶血。這一結論通過用原子力顯微鏡（AFM)觀察對照組、損傷組和保護 組紅細胞形貌得到進一步驗證。
[0005] 皮膚老化主要是人的遺傳傾向性（也稱為年代老化）和人對環(huán)境應激的生理反應 (也稱為光老化）的結果。光老化是外界環(huán)境對皮膚的生物學應答的效果。皮膚對光老化 的應答通常與正常的水合作用的缺乏、皮膚下垂以及線條和皺紋外觀有關。UVB照射可使 成纖維細胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，R0S)堆積，超過了其清除能力，打破氧化 與抗氧化平衡，發(fā)生氧化應激反應，調(diào)節(jié)一系列程序化的細胞反應，甚至調(diào)控衰老相關的信 號通路，促進細胞衰老的發(fā)生。大量研究表明R0S在細胞內(nèi)的堆積是皮膚光老化發(fā)生發(fā)展 過程中的重要環(huán)節(jié)。人皮膚成纖維細胞是人皮膚產(chǎn)膠原蛋白的主要場所，其數(shù)量的多少和 細胞膠原蛋白的產(chǎn)率與皮膚衰老狀態(tài)息息相關。因此，人皮膚成纖維細胞的存活率和膠原 蛋白的產(chǎn)率是被廣泛認可的一種評價皮膚衰老狀態(tài)的模型。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種具有保護紅細胞溶血以及促進人皮膚成纖維細胞的增 殖和膠原蛋白產(chǎn)生的合成多肽，可應用于生物制藥與化妝品等領域。
[0007] 本發(fā)明以APPH誘導的紅細胞溶血實驗以及紫外損傷人皮膚成纖維細胞來評價多 肽的抗氧化及抗皮膚衰老活性。
[0008] 本發(fā)明所述的合成多肽縮寫為VTAPAASVAL，分子量899. 4,序列為：Val-Thr-Ala-Pro-Ala-Ala-Ser-Val-Ala-Leu。其中， Val表示英文名稱為Valine，中文名稱為纈氨酸的氨基酸的相應殘基； Thr表示英文名稱為Threonine，中文名稱為蘇氨酸的氨基酸的相應殘基； Ala表示英文名稱為Alanine，中文名稱為丙氨酸的氨基酸的相應殘基； Pro表示英文名稱為proline，中文名稱為脯氨酸的氨基酸的相應殘基； Ser表示英文名稱為Serine，中文名稱為絲氨酸的氨基酸的相應殘基； Leu表示英文名稱為Leucine，中文名稱為亮氨酸的氨基酸的相應殘基。
[0009] 本發(fā)明所述的氨基酸序列采用標準Fmoc方案，通過樹脂的篩選，合理的多肽合 成方法。將目標多肽的C-端羧基以共價鍵形式與一個不溶性的高分子樹脂相連，然后以 這個氨基酸的氨基作為起點，與另一分子氨基酸的羧基作用形成肽鍵。不斷重復這一過程， 即可以得到目標多肽產(chǎn)物。合成反應完成后，去除保護基，將肽鏈與樹脂分離，即得到目標 產(chǎn)物。多肽合成是一個重復添加氨基酸的過程，固相合成順序從C端向N端合成。合成完 畢，采用高效液相色譜進行純化，液氮速凍，真空冷凍干燥，得到多肽成品。
[0010] 本發(fā)明將終濃度為1-100 Pg/mL的合成多肽與正常人血紅細胞混勻，孵育，經(jīng) AAPH損傷2 h后，使得細胞溶血抑制率達到57. 74%~80.66%。用100噸/mL的合成多肽處 理后的與僅用AAPH損傷的紅細胞組相比，其形貌比單純AAPH處理組光滑，有序，S0D活力 由2. 5976mgprot/mL上升到5. 2740mgprot/mL，結果表明，合成多肽處理后紅細胞的S0D 活性有較大提高，能在生物醫(yī)藥與化妝品等領域應用。
[0011] 本發(fā)明將濃度為1-10 Kg/mL的合成多肽加入人皮膚成纖維細胞培養(yǎng)液中孵育，經(jīng) 中波紫外（UVB)80mJ/cm2損傷后，使得細胞存活率提高了7. 8-22. 74%。同時，膠原蛋白得率 由模型組的11. 9512±1. 2067Pg/mL上升為合成多肽組的14. 0976 ±1.4361噸/mL，膠原 蛋白得率提高了4. 69-17. 96%。
[0012] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點和技術效果： 本發(fā)明首次合成了該肽，并且應用于AAPH損傷的正常人紅細胞進行保護，使得紅細胞 溶血率顯著降低，S0D活性有較大的提高，同時，合成多肽對紫外損傷的人皮膚成纖維細胞 的生長具有促進作用，同時能促進其膠原蛋白的產(chǎn)生。
【附圖說明】
[0013] 圖1為合成多肽Val-Thr-Ala-Pro-Ala-Ala-Ser-Val-Ala-Leu的ESI-MS圖譜， 其中橫坐標為m/z(質(zhì)荷比值）、縱坐標為Relative Abundance(相對強度）。
[0014] 圖2為合成多肽添加后進行AAPH損傷的正常人紅細胞溶血抑制率變化曲線。
[0015] 圖3為不同處理組紅細胞的原子力顯微鏡（AFM)成像圖。
【具體實施方式】
[0016] 以下結合具體實例對本發(fā)明作進一步說明，但本發(fā)明的實施和保護范圍不限于 此。對于未特別注明的工藝參數(shù)，可參照常規(guī)技術進行。
[0017] 多肽固相合成 選用高分子樹脂（中肽生化有限公司），按照氨基酸序列 Val-Thr-Ala-Pro-Ala-Ala-Ser-Val-Ala-Leu 的特征，先將 Leu 的駿基以共價鍵的形 式與一個樹脂相連，然后Phe的氨基和Phe的羧基縮水反應，處理后，再添加Glu，Phe的 氨基和Glu的羧基反應，依次從右到左添加氨基酸，加好最后一個Phe氨基酸后，再切除 樹脂即得到目標多肽。高效液相色譜純化得到最后的產(chǎn)品，使用SepaxGP-C18色譜柱，尺 寸4.6*150mm，液相條件如下，流動相A:含有0. 1%三氟乙酸（TFA)的水；流動相B:含有 0. 09%TFA的溶液（80%乙腈+20%水），洗脫流速為1. OmL/min，20 min內(nèi)B相比例由23% 上升到43%，檢測波長220nm。液氮速凍，冷凍干燥，純度達到90%以上，并經(jīng)ESI-MS鑒定結 構(如圖1所示)。
[0018] 合成多肽對人皮膚成纖維細胞UVB損傷的保護應用 人皮膚成纖維細胞培養(yǎng)在完全培養(yǎng)基中，完全培養(yǎng)基由基礎培養(yǎng)基高糖DMEM，10%胎 牛血清（v/v)，以及1%雙抗（由青霉素和鏈霉素組成，v/v)組成。置于37 °C、C02體積分 數(shù)為5%的飽和濕度培養(yǎng)箱中。每隔2 d換液1次。待細胞長滿培養(yǎng)瓶的90%左右，取其 接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔lOOyL，濃度為5X104cell s/mL。細胞生長24h后，吸棄 培養(yǎng)液，用200 yL PBS洗1次，加入200 yL PBS，用80 mj/cm2 UVB照射，吸棄PBS，每孔加 入200 y L樣品（零濃度用高糖DMEM取代，即為正常對照），繼續(xù)培養(yǎng)72 h，吸棄培養(yǎng)液， 采用MTT法檢測細胞存活率(結果見表1)。
[0019]表1
合成多肽促進UVB損傷的人皮膚成纖維細胞膠原蛋白產(chǎn)生的應用 取上述處理組的細胞，吸棄培養(yǎng)液，用無菌水洗細胞表面兩次，加入冰冷70%乙醇 200 yL進行固定，在-80 °C冰箱放置至少lOmin，取出后，用無菌水洗細胞表面兩次，風干 水分后，每孔加入200 yL 1%飽和苦味酸-猩紅染液（m/v)，于4°C條件下輕晃24 h，吸棄 染液，用無菌水洗3次，直至沒有染色液洗出為止，加入150 y L 1M NaOH溶液，150 r/min， 震蕩15 min，每孔取出100 yL置于96孔板中，測定492nm處的吸光度值(結果見表2)。
[0020] 表2
合成多肽對正常人紅細胞AAPH損傷的保護應用 用含有檸檬酸鈉的抗凝管（抗凝劑檸檬酸鈉：血液=1 :9，v/v)抽取健康成人（30歲以 下)血液放于4°C冰箱保存，一周內(nèi)使用。臨用時，將血液放在離心管中于1000~1500 g離 心8-15 min，移去上層的血漿，紅細胞用PBS(pH=7.4)